フェリスタチンIIはベロ細胞でSARS-CoV-2複製を効率的に阻害します
Mar 30, 2022
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp：008618081934791
概要
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV -2）世界の公衆衛生に大きな影響を与え続けています。 SARS-CoV-2セルエントリの複数のメカニズムが説明されています。 ただし、SARS-CoV -2感染におけるトランスフェリン受容体1（TfR1）の役割はほとんど注目されていません。 フェリチンIIを使用して、ベロ細胞の表面でTfR1の分解を誘導し、細胞の生存率とSARS-CoVの複製に対するそのような処理の結果を研究しました-2。 フェリチンIIは、400 µMまでの濃度でベロ細胞に対して無毒であることを示しました。 共焦点顕微鏡データによると、スパイクタンパク質の標識トランスフェリンおよび受容体結合ドメイン（RBD）の分布は、培地中の100 µMフェリチンIIによる18時間の前処理によって大きく影響されます。 RBDタンパク質の取り込みは、フェリチンII処理によってほぼ完全に阻害されますが、このタンパク質は細胞表面に結合したままです。 この発見は、27 µM（武漢D614Gウイルスの場合）および40 µM（デルタウイルスの場合）のIC50値を持つフェリチンIIによるベロ細胞のSARS-CoV-2感染の有意な阻害によって十分に確認されました。 オミクロンSARS-CoV-2変異体の感染力価の有意な低下は、6.25 µMという低いフェリチンII濃度で認められました。 フェリチンIIがTfR1-を介したSARS-CoV-2宿主細胞の侵入を阻止すると仮定します。 ただし、ACE2、ニューロピリン-1、CD147などの他のSARS-CoV -2受容体に対するフェリチンIIの影響など、このウイルス阻害の完全なメカニズムを解明するには、さらなる研究が必要です。 ウイルス変異を起こしやすいタンパク質ではなく、宿主細胞上の受容体を標的とすることによるウイルス侵入の阻害は、有望なCOVID-19治療戦略です。
キーワード：SARS-CoV -2;トランスフェリン受容体1; フェリチンII; 受容体結合ドメイン（RBD）; ベロ細胞
Alexey Sokolov、Irina Isakova-Sivak *、Natalia Grudinina、Daria Mezhenskaya、Elena Litasova、Valeria Kostevich、Ekaterina Stepanova、Alexandra Rak、Ivan Sychev、Olga Kirik、Larisa Rudenko
実験医学研究所、197376サンクトペテルブルク、ロシア
1.はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV -2）によって引き起こされるコロナウイルス病2019（COVID -19）のパンデミックは、世界の人口に重大な社会経済的負担をもたらし続けています。 アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）は、SARS-CoV -2が細胞に侵入するために利用する主要な宿主細胞受容体と考えられています[1–4]。 ただし、ニューロピリン-1、CD147、チロシンプロテインキナーゼ受容体UFO（AXL）など、SARS-CoV-2細胞の侵入と感染力を促進できるいくつかの代替受容体および補助受容体が同定されています。 [5–10]。 さらに、ウイルススパイク（S）タンパク質による宿主細胞受容体の関与後の細胞への効果的なSARS-CoV -2侵入には、2つのタンパク質分解切断ステップが必要です。 最初のステップは、感染細胞内のフューリンプロテアーゼによるS1–S2境界の切断を含みますが、S20部位の切断は、TMPRSS2やカテプシンLなどの標的細胞プロテアーゼに依存します。それぞれエンドリソソーム（[11]でレビュー）。
よく研究されているSARS-CoV-2宿主細胞侵入標的とは別に、トランスフェリン受容体1（TfR1）がSARS-CoV-2侵入の代替補助受容体になり得るという証拠があります[12]。 95 kDaのホモ二量体II型膜糖タンパク質であるTfR1は、ほとんどのヒト細胞の原形質膜に豊富に発現しており、鉄の送達のために細胞へのトランスフェリン（Tf）の侵入を仲介します[13]。 実際、新世界アリーナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パルボウイルス、C型肝炎ウイルス、アルファウイルスなど、TfR1や鉄取り込み経路の他の因子との相互作用を介して宿主細胞に侵入する可能性のあるヒトおよび人獣共通感染症ウイルスは広範囲に存在します。 [14]。 したがって、TfR 1-を介したウイルス侵入経路を標的とすることは、SARS-CoV-2感染の有望な治療戦略を表しています。 初期のスクリーニング研究では、HeLa細胞によるTfを介した鉄の取り込みに対して有意な阻害効果を持つ2つの小さなサイズの化合物（NCI11079およびNCI306711）が特定されました。 化合物NCI306711は、その内在化と分解を誘導することによってTfR1を標的とし、コレステロール依存性経路を介した鉄の輸送を阻害するという珍しい特性から「フェリチン」と名付けられました[15]。 別の小分子であるフェリチンII（NSC 8679）は、フェリチンと同様に作用し、ナイスタチン感受性脂質ラフト経路を介してTfR1を分解します[16]。 これらのデータに照らして、Vero-CCL81細胞におけるSARS-CoV -2複製を阻害するフェリチンIIの能力を評価し、この阻害の潜在的なメカニズムを調査しようとしました。
2。材料と方法
2.1。 ウイルス、タンパク質、および化合物
SARS-CoV -2は、hCoV -19 / St _ Petersburg -3524 S / 2 0 20（Wuhan D614G系統）、hCoV-19を分離します/ Russia / SPE-RII -32759 V / 2021（デルタ系統）およびhCoV -19 / Russia / SPE RII -6086 V / 2021（オミクロン系統）はSmorodintsev Research Institute ofインフルエンザ（サンクトペテルブルク、ロシア）。 感染性ウイルスに関するすべての作業は、バイオセーフティーレベル3（BSL -3）の実験室で行われました。 SARS-CoV -2 Sタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）に対応する組換えタンパク質は、BIOCAD JSC（サンクトペテルブルク、ロシア）によって真核細胞で発現されました。 鉄飽和ヒト血清TF（Fe 2- TF）は、前述のように、DEAE-Toyopearl、UNOsphere Sでのイオン交換クロマトグラフィー、およびSephadex G-75Superfineでのゲルろ過によってヒト血清から分離されました。 [17]。 フェリスタチンII（図1）は、Sigma（C -1144、セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 化合物を150mMNaCl、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4（PBS）で最終濃度4 mmに希釈し、溶液を孔径0.22 µmの滅菌膜（ザルトリウス、ドイツ）でろ過しました。 。
2.2。 SARS-CoV-2ウイルスの繁殖とフェリスタチンIIウイルス阻害能力の評価
ウイルスは、1×抗生物質-抗真菌剤、10 mM HEPES、および2％FBS（すべてCapricorn、Ebsdorfergrund、Germany）（DMEM / 2％FBS）を添加したDMEMを使用してVeroCCL81細胞で増殖させました。 感染力価は、[18]に記載されているように、50％組織培養感染量（TCID50）アッセイによって決定され、lgTCID50/mLで表されます。
フェリチンウイルス中和能力の評価のために、我々は修正されたマイクロ中和アッセイを使用した。 実験の前日、Vero細胞を1×抗生物質-抗真菌剤と10％FBSを添加したDMEMの{{0}}ウェル培養プレート（ウェルあたり3×104細胞）に播種しました。 翌日、培地を除去し、細胞をDMEM /2パーセントFBSで調製した100TCID50のSARS-CoV-2に37°C、5パーセントCO2で2時間感染させました。 いくつかのウェルは、ネガティブコントロールとして感染していないままでした。 次に、接種材料を取り除き、細胞をDMEM /2パーセントFBSで調製した150µLの2倍フェリチンII希釈液で覆いましたが、ネガティブおよびポジティブコントロールウェルは培地のみで覆いました。 各フェリチンII希釈は3回評価されました。 プレートは、陽性対照ウェルで明確な細胞変性効果が見られるまで、37°C、5％CO2で48時間（武漢G614Dウイルスの場合）または72時間（デルタおよびオミクロンウイルスの場合）インキュベートされました。 ウイルス力価を定量するために、上清を注意深く0.2 mLチューブに収集し、細胞を10％ホルムアルデヒドで4°Cで24時間固定しました。
固定プレートは、細胞ベースのELISA手順のためにBSL{{0}}ラボに移されました。 これには、PBST（Tween 20の0。05パーセントを含むPBS）による洗浄、室温で15分間の0.1パーセントのTriton X -100による細胞透過処理、37°Cでの3パーセントのスキムミルクによるブロッキングが含まれます。 1時間、PBSTで徹底的に洗浄します。 次に、精製ポリクローナルウサギ抗RBD抗体（BIOCAD JSC、サンクトペテルブルク、ロシア）を1.5 µg / mLの濃度で1時間添加した後、PBSTで洗浄し、二次抗ウサギ抗IgGHRP-を添加しました。結合抗体（BioRad、Hercules、CA、USA）を37°Cで1時間。 プレートは、1- Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を使用して開発されました。 1M H2SO4溶液で反応を停止し、xMarkマイクロプレート分光光度計（BioRad、Hercules、CA、USA）を使用して450nmで結果を読み取りました。 IC50力価を計算するために、[18]で説明されているように、ウイルス陰性およびウイルス陽性細胞のOD450値に基づいて、4つのパラメトリック非線形回帰分析が使用されました。
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細胞上清中のSARS-CoV-2力価は、定量的リアルタイムRT-PCRによって計算されました。 RNAは、100 µLの細胞培養液、およびアッセイ標準曲線を作成するための既知の力価を持つSARS-CoV-2から精製されました。 RNAサンプルは、RNA抽出キット（Biolabmix、ノボシビルスク、ロシア）を使用して、製造元のプロトコルに従って精製しました。 RT-PCR反応は、One-Tube RT-PCR SYBRを使用して、フォワーディングプライマー50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30とリバースプライマー50 -CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-30[19]を使用して2回実行しました。 Quantstudio 1リアルタイムPCRシステム（Thermofifisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のキット（Evrogen、モスクワ、ロシア）、参照色素として50xRoxを追加。
QuantStudio Design and Analysis Software v1.5.1を使用して、サンプルごとにしきい値サイクル（Ct）を計算し、各反応プレートで検量線を作成しました。 各ウェルのウイルス力価は、標準ウイルス滴定に基づいて計算され、lgTCID50/mLで表される標準曲線に正規化されたCt値を使用して計算されました。 フェリチンIIが細胞へのウイルス付着の初期段階を阻害できるかどうかを判断するために、100 TCID50のSARS-CoV-2をフェリチンII希釈液と混合し、37°Cで1時間インキュベートした後、この混合物をVeroに添加しました。細胞、続いて37°Cでさらに1時間のインキュベーション。 ウイルスを吸収した後、接種物を取り除き、細胞を150 µLの新鮮なDMEM/2パーセントFBS培地で覆った。 37°C、5％CO2、および陽性対照細胞での可視CPEで48時間のインキュベーション後、プレートを固定し、上記のように細胞ベースのELISAに供しました。
2.3。 フェリスタチンIIの細胞毒性効果の評価
ベロ細胞に対するフェリチンIIの細胞毒性は、{{0}}（4、5-ジメチルチアゾール- 2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ MTT）還元アッセイ[20]。 フェリチンIIの2倍希釈液は、400 µMの濃度から開始してDMEM / 2パーセントFBS培地で調製し、Vero細胞単層を備えた96-ウェルプレートのウェルに添加しました。 48時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を温かいPBSで穏やかに洗浄した。 0.5 mg / mLMTT試薬を100µLの容量で各ウェルに添加し、プレートをさらに37°Cで2時間インキュベートしました。 次に、試薬を除去し、細胞をPBSで洗浄して風乾した後、100 µLの96％エタノールを加えてホルマザン結晶を溶解しました。 色の強度は、535nmの波長で分光光度計を使用して記録されました。 ベロ細胞を播種していないプレートのウェルをネガティブコントロールとして使用しました。 細胞生存率の50％阻害（CC50）は、GraphPadPrizmソフトウェアを使用した4パラメトリック非線形回帰分析によって計算されました。
2.4。 ヒト血清トランスフェリンおよび組換えRBDタンパク質の標識
標識反応は、ジメチルスルホキシド中のNHS-ester 5- TAMRA（Lumiprobe、＃47120）の5mM溶液を30µM Fe 2- TFまたはRBD溶液に添加することにより、プラス4°Cで12時間実施しました。 200 mM NaHCO3で、5- TAMRA：タンパク質= 8：1（mol / mol）の比率を維持します。 過剰な色素を除去した後、標識の程度は、A541とA280の比率によって推定されました。これは、Fe2-TFとRBDの1モルあたりそれぞれ3.5と3.2モルのTAMRAでした。
2.5。ベロ細胞によるTFおよびRBD取り込みのフェリスタチンII効果の研究
ベロ細胞は、フェリチンIlを含まないDMEM / 2パーセントFBSで、顕微鏡用のカバースリップを備えた1 0 0 uMフェリチンIlを添加して、培養プレートの底に事前に配置して18時間培養しました。 次に、培地を、1.2μMFe 2- TF-TAMRA（0.25mg / mL）または1.2μMRBD-TAMRA（0.1mg / mL）を含むFBSを含まない培地と15時間交換した。 インキュベーション後、細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（w /）で10分間固定し、PBSで30分間2回洗浄した。 次に、細胞の核を360nM DAPIで5分間染色し、PBSとカバースリップで洗浄し、蛍光顕微鏡用の重合樹脂（DAKO、Glostrup、デンマーク）を使用してスライドにマウントしました。 画像は、Axio Observer.Z1 / 7共焦点レーザー走査型顕微鏡（Carl Zeiss、イエナ、ドイツ）を使用し、Plan-Apochromat63×/1.40オイルDICM27対物レンズを使用して取得しました。A561nmレーザーを使用してTAMRA蛍光を励起しました。 {28}} nmフィルターを使用して蛍光を記録し、405nmレーザーを使用してDAPIを励起しました。 400-570nmフィルターを使用して蛍光を記録しました。 画像は、顕微鏡に付属のソフトウェアを使用して取得および処理されました。
3.結果
2つの抗原的に離れたSARS-CoV-2株を使用して、ベロ細胞でのウイルス複製を阻害するフェリチンIIの能力を評価しました。 最初の段階で、培地中に化合物が常に存在する場合のウイルス阻害を評価しました。 細胞ベースのELISAでウイルス抗原を検出したところ、フェリチンIIのIC5 0値は、武漢D614Gウイルスとデルタウイルスでそれぞれ26.5と40.4 µMでした（図2A）。 培地中のウイルス力価の定量化により、感染細胞から培地へのウイルスの放出が、25μM濃度から始まるフェリチンIIによって阻害され、TCID50力価の低下から計算されたIC50値は24.0および25.2であることが確認されました。 WuhanD614GおよびDeltaウイルスの場合はそれぞれµM。 さらに、化合物を100 µMの濃度で添加した場合、Vero細胞ではウイルス複製は発生しませんでした（図2B）。
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武漢D614GとオミクロンSARS-CoV-2変異体のRBDタンパク質には大きな違いがあるため、後者は利用可能な抗RBD抗体を使用した細胞ベースのELISAでは検出できませんでした。元のSARS-CoV-2株のRBD。 それにもかかわらず、フェリチンIIの存在下での感染性ウイルス力価の低下は、他の2つのSARS-CoV -2株と比較して、オミクロン変異体でさらに顕著でした。ウイルス力価の10分の1の低下がフェリチンIIで認められました。濃度は6.25µMと低く、50 µM以上の濃度ではウイルスの複製は発生しません（図3）。 このSARS-CoV-2の阻害は、フェリチンIIが培地に常に存在する場合にのみ発生しましたが、細胞を化合物で前処理した場合、またはウイルス/フェリチンの場合はこの効果は観察されなかったことに注意してください。 II混合物を吸着ステップで使用し、続いて物質なしでインキュベーションしました（データは示していません）。
We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >武漢D614G、デルタ、およびオミクロンSARS-CoV-2株の場合はそれぞれ64。
フェリチンIIによるSARS-CoV-2阻害の考えられるメカニズムを調査するために、代理RBD取り込みアッセイによってウイルス侵入に対する物質の影響を調べました。 したがって、100 µMの非毒性濃度のフェリチンIIが、ベロ細胞によるテトラメチルローダミン標識（TAMRA）RBDの取り込みにどのように影響するかを決定しました。 フェリチンII作用の標的であるTfR1は、Tfの侵入を仲介することが知られています。 したがって、TAMRAラベルのTFをポジティブコントロールとして使用しました。 標識タンパク質を添加せずに100µMフェリチンIIの存在下でVero細胞を18時間培養しても、細胞核の形態に有意な影響はなく（図5、上部パネル（モック））、間接的に細胞壊死とアポトーシスがないことを示しています。 フェリチンII処理なしでTF-TAMRAと細胞をインキュベートすると、DAPIで染色された核領域に影響を与えることなく、細胞内に標識タンパク質が蓄積しました（図5の画像の左中央のトライアド（TF-TAMRA））。 100 µMのフェリチンIIで細胞を処理すると、標識されたTF（図5の画像の右中央のトライアド（TF-TAMRA））の含有が大幅に減少しました。 標識TFの場合のように、フェリチンII処理なしでRBD-TAMRAと細胞をインキュベートすると、核領域に影響を与えることなく、細胞質に標識タンパク質が蓄積しました（図5の左下のトライアド（RBD-TAMRA））。 ）。 細胞を100µMのフェリチンIIで処理すると、TAMRAシグナルの再分布が起こりました。 標識されたRBDを細胞に組み込む代わりに、TAMRAシグナルは細胞表面全体に均一に分布し、標識のごく一部のみが核のDAPI染色と部分的に重なるクラスターを形成し、TAMRA標識の表面局在を示しています（下図5の右トライアド（RBD-TAMRA）。 図5に示す結果は、Vero細胞を100 µMのフェリチンIIで処理すると、標識されたRBDの細胞への取り込みに影響を与えることを示しています。 ACE2受容体に対するフェリチンIIの効果に関するデータが現在利用できないことを考えると、観察された効果が細胞表面への標識RBDの結合によるものであることを排除することはできませんが、細胞にTfR1が存在しないと取り込みが妨げられますフェリチンIIで処理された細胞におけるRBDの。
4。議論
SARS-CoV -2は、複数のメカニズムを利用して宿主細胞に侵入し、ウイルス感染を成功させます。現在、COVID-19治療戦略としてさまざまな宿主細胞侵入阻害剤が評価されています[21]。 現在の研究では、トランスフェリン受容体1を選択的に分解できる小さなサイズの分子であるフェリチンIIによる標的細胞の処理により、SARS-CoV-2invitro複製を阻害した予備的な結果を報告します。鉄飽和トランスフェリン（Fe 2- Tfまたはholo-Tf）は、その受容体に対して高い親和性を持っています。これは、ほとんどのヒト細胞の表面に発現し、受容体を介したエンドサイトーシスによってholo-Tfと複合体を形成します。 鉄とTfの間、およびホロ-TfとTfRの間の複合体の形成は、pHに依存し、エンドソームの酸性環境でTfからの鉄とTfRからのTfの放出を提供します。 エンドソームのリサイクルにより、TfRが原形質膜に戻り、アポ型のTfが放出されて、細胞への鉄の送達がさらに繰り返されます。 哺乳類細胞による鉄の取り込みは、既知の作用機序を持つ薬剤を欠く癌細胞の増殖を調節するための重要なプロセスです。 National CancerInstituteのDiversitySetライブラリからの2000の小さなサイズの化合物のスクリーニングにより、5〜30 µMの範囲のIC50値を持つ鉄輸送の10の阻害剤が特定されました[22]。 フェリスタチンIIは、C型肝炎ウイルス[23,24]、伝染性胃腸炎ウイルス[25]、およびレオウイルス[26]によるTfR1を介した細胞感染の研究でTfR1の遮断薬として使用されています（表1）。 フェリチンIIによるTfR1分解の実験は、ほとんどの場合、培地中に物質が恒久的に存在する状態で行われることに注意してください。
同様のアッセイ設定で、400 µMの濃度に48時間曝露した場合、フェリチンIIはベロ細胞に対して実質的に無毒であることがわかりました。 この濃度は、培養細胞の表面でTfR1を完全に分解するのに十分です[16]。 一方では、この効果は、100 µMのフェリチンIIで18時間前処理されたVero細胞による標識Fe2-Tfの取り込みの減少によって確認されました。 この場合、標識されたTf取り込みの不完全なブロッキングは、標識されたタンパク質の添加時にフェリチンIIが存在しないことで説明できます。 一方、フェリチンIIによるVero細胞の処理は、スパイクタンパク質のRBDの取り込みを劇的に変化させました。 この予備研究では、フェリチンII治療下での他のSARS-CoV -2受容体の発現レベルを評価せず、SARSの媒介におけるTfRの独立した役割を証明するこれらの既知の受容体のノックアウトを誘発しませんでした-CoV-2セルエントリ。これは私たちのさらなる研究分野です。
それにもかかわらず、フェリチンIIで処理された細胞の表面へのRBDの比較的均一な結合は、ベロ細胞上のSARS-CoV -2受容体の一部が機能を維持し、ウイルスに結合することを示している可能性がありますが、TfR1は存在しません。ウイルスは細胞に侵入できません。 Prabhakara et al。以来、この受容体はおそらくACE2です。 ACE2を過剰発現する細胞による標識トランスフェリンとともに標識RBDの取り込みの増加を示し、ACE2がTfR1によって利用されるクラスリン媒介エンドサイトーシスを介してRBD取り込みを促進することを示唆しています[28]。 さらに、SARS-CoV-2が代替の侵入経路を使用してACE2-陰性細胞に感染する可能性があるという証拠があります[29]。 したがって、さまざまな細胞型に対するフェリチンIIの作用をより深く分析することで、SARS-CoV -2感染が許容され、ウイルスのライフサイクルにおけるTfR1の役割が明らかになります。 この物質がSARS-CoV-2感染の将来の治療にどれほど有望であるかを理解するには、この化合物がinvivoでどのように代謝されるかを知ることが重要です。 フェリチンIIで治療されたラットは、肝臓でのTfR1のレベルが低く、肝臓の非ヘム鉄に変化がなく、血清鉄とTf飽和度が低下しました[16]。
さらに、フェリチンIIはヘプシジンの発現を誘導しました[16,30]。 別の研究では、遺伝子発現は、フェリチンII（コーン油中）を146 mg /kg/日の用量で7日間Wistarラットの胃に投与した後に評価されました。 鉄調節タンパク質の遺伝子の中で、フェリチンII投与後のHFEの発現低下とCP、GDF15、HAMPの発現上昇が観察されました[31]。 注目すべきことに、p 53-依存性シグナル伝達経路に対するフェリチンIIの効果は、細胞培養におけるTfR1阻害剤としての使用のみを制限する障壁である可能性が最も高い[31]。
フェリスタチンIIは、ダイレクトブラック38、クロラゾールブラックE、CI 30235、またはCAS 1937- 37-7としても知られており、顆粒球および爪真菌症を染色するための色素として一般的に使用されています[32,33]。 重要なことに、膀胱がんの潜在的リスクを有する直接黒38のベンジジン代謝物が、この染料を製造した小規模ユニットの労働者の尿サンプルで観察された[34]。 フェリチンIIはヒトで直接使用することはできませんが、このため、TfR1をブロックすることによってSARS-CoV -2の細胞への侵入を阻害する戦略は、このアプローチが宿主上の受容体を標的とするため、有望であるという議論があります。ウイルス変異を起こしやすいタンパク質ではなく細胞。 さらに、フェリチンII分子のように作用するが、潜在的な健康リスクを伴う代謝物の形成を伴わない化合物を特定するために、さらなる研究が必要です。
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