皮膚の光老化に対抗し、バリアの完全性を回復するための革新的な戦略としてのサルビア・ヘンケイのさらなる評価

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概要：皮膚は、複数の機能を実行する人体の重要なバリアです。 内因性要因は、外部からの攻撃と連携して、皮膚の完全性に継続的に影響を与え、皮膚の外観だけでなく、そのさまざまな生理学的機能にも影響を与える明確な構造変化をもたらします。 バリア機能の変化は、病気や副反応を発症するリスクの増加につながります。したがって、表皮バリアの完全性を維持し、皮膚の老化プロセスを遅らせることの重要性は明らかです.シスタンシェの陰茎の成長サルビア ハンキー (SH) は、潜在的な抗老化剤として最近同定されました。 その抽出物は、ll.1aの放出に影響を与え、活性酸素種（ROS）の生成を減らすことにより、老化細胞のレベルを下げることができます. この研究では、フリーラジカルや紫外線 B 放射などの細胞の早期老化に関連するストレス要因にさらされたヒトケラチノサイト細胞株 (HaCaT) で SH 抽出物をテストしました。 SHがROSのスカベンジャーとして作用することを確認し、細胞骨格構造を強化し、タイトジャンクションを密閉し、細胞の移動速度を高めることにより、皮膚バリアの完全性を回復する能力を発見しました. これらの結果を考えると、サルビア ハンキーがアンチエイジングの皮膚治療に有用な化合物であることを臨床的に特定することで、この研究は関連性を持つようになります。

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序章

健康で機能的な皮膚は、微生物、アレルゲン、刺激物、および放射線から 100% のさまざまなものの脱水と浸透を保護するために不可欠です。 遺伝学、細胞代謝、ホルモン、代謝プロセスなどのいくつかの内因性要因と組み合わされた外因性因子への毎日の曝露は、皮膚の自然な老化につながります[1]。 特に、皮膚の老化現象は、紫外線、汚染、反復的な筋肉の使用、および重力に大きく関係しています [2, 3]。 したがって、皮膚の老化は、蓄積された構造的および生理学的変化と、皮膚層の漸進的な変調に起因します[2、4、5]。 老化は病的な状態ではなく、生物学的で避けられないプロセスであると考えられていても、さまざまな皮膚疾患との相関関係は現在十分に確立されています. 最も関連性の高い加齢性皮膚疾患が変性疾患、良性および悪性新生物などであることを考慮すると、特定の皮膚疾患を治療または予防するためのスキンケアの重要性は明らかです.[6-8]. 今日、皮膚のアンチエイジング戦略は、皮膚および表皮の光/経年老化の兆候を逆転させるように作用します. それらのアプローチに基づいて、それらは次のように分類できます：美容ケア、局所薬剤、侵襲的処置、全身薬剤、老化の外因性要因の回避、ライフスタイルと習慣の修正、および予防医学[9]。 アンチエイジング製剤の成分として使用できる薬剤には、主に次の 2 つのグループがあります。 2. ビタミン、ポリフェノール、フラボノイドなどの抗酸化物質は、コラーゲンの分解を抑えることができます [9]。

実質的な証拠は、皮膚の老化は主に、内因性細胞の酸化的代謝中に生成される ROS によって引き起こされるという考えを支持しています [10,11]。 ROS の蓄積は、脂質過酸化、膜タンパク質の損傷、構造的および機能的な皮膚の変化につながる DNA 突然変異などの細胞損傷の原因であることが知られています。 時間が経つにつれて、ヒト細胞は抗酸化防御の部分的な喪失に関連する ROS レベルの自然な増加を支えます。 この避けられない状態は、マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) 合成を誘発する毎日の紫外線照射 (UVR) によってさらに助長され、その結果、MMP を介したコラーゲン破壊が引き起こされます [12、13]。 in vivo 研究では、ミトコンドリアの酸化的損傷、細胞老化、老化表現型の間の因果関係が示されました [10, 14]。

細胞老化は、加齢中にすべてのヒト細胞で発生する細胞増殖の安定した停止として定義されます [15-17]。 がん遺伝子の過剰発現、ROS 生成、および DNA 損傷 (たとえば、UVR、特に UVB 光によって誘発される) などのストレスの多いイベントの結果として、細胞は時期尚早に老化する可能性があります [18]。シスタンチ サルサのメリットこのシナリオでは、老化細胞の蓄積を防止したり、老化細胞を選択的に殺したりして、老化や加齢に伴う障害に対抗できる革新的な戦略を開発することが重要であることは明らかです。 最近、ビタミン B と抗酸化特性が豊富なボリビアの植物である Salvia hankie(SH) が、老化防止剤の可能性があることを確認しました [18]。

経時的な老化細胞の蓄積は、組織が老化プロセスを受ける最も重要なメカニズムの 1 つであることがよく知られており、これは主に典型的な炎症状態の持続によって引き起こされるようです。 実際、老化細胞は増殖できないにもかかわらず、高い代謝活性を持ち、いくつかの炎症誘発性分子を効率的に生成します [19]。 皮膚のヒト表皮モデル (EpiSkin) を使用することにより、SH 抽出物が IL1a 放出に影響を与え、ROS 生成を減少させることによって老化細胞のレベルを減少させることが実際に実証されました [18]。

恒常性条件下では、皮膚は外部からの攻撃や内因性要因から保護し、体液、電解質、タンパク質の損失を調節する効率的なバリアです。 この重要な役割は、主に動的で高度に重層化された上皮である表皮に起因します。 2 つの主要な表皮構成要素は、角質層、外層、および顆粒層で隣接するケラチノ サイトをシールする細胞間結合であるタイト ジャンクション (TJ) です [20]。 細胞間接着は、表皮バリアの完全性を維持するために必要です。シスタンケ・チューブロサの投与量 redditこの重要な機能は、接着結合 (AJ)、デスモソーム、タイトジャンクションなどの特殊な細胞間結合によって実現されます。 これらの構造は、細胞間の物理的な接続を可能にするだけでなく、細胞骨格要素を全体的に編成し、組織の発達、構造、および生理学に関与するシグナル伝達経路を調節します。 最近の遺伝子研究では、接合部タンパク質の非標準的な役割が予期せず明らかになり、組織の堅牢性を可能にする接合部クロストーク、相互依存性、および補償の重要性が明らかになりました [21]。

ここでは、サルビア ヘンケイ抽出物の活性を研究し、光/経時的皮膚老化に対する保護効果の原因となる分子メカニズムを理解しました。 この観点から、ヒト自発的不死化ケラチノサイト (HaCaT) を in vitro モデルとして使用し、SH の作用機序を基礎レジメンおよび H2O2 および/または UVB 照射によって誘発されるストレス条件下で分析しました。

結果

SH 抽出物の安全なプロファイルと老化防止特性 皮膚の酸化ストレスは、老化プロセスといくつかの皮膚疾患の病因において主要な役割を果たします [22]。 マティック等。 サルビア・ヘンケイの抗老化活性もその除去特性と相関することがすでに実証されている[18]。 これらの保護効果は、バリアの完全性を維持できる新しい皮膚修復治療の開発に利用される可能性があります。 SH特性を深く調査する目的で、HaCaT細胞モデルにおける細胞生存率とROS生成に対する抽出活性が最初に検証されました。

ニシンはアンチエイジングできる

ケラチノ サイトに対するサルビア ヘンケイ抽出物の細胞毒性効果の可能性に対処するために、細胞生存率アッセイを実施しました。 HaCaT 細胞を SH 抽出物（0.01-10 ug/ml）で 24 時間および 48 時間処理しました。 細胞生存率は、トリパン ブルー排除アッセイによって評価されました。 図 1A および 1B は、SH 抽出物による処理が細胞生存率に影響を与えないことを示しており、使用された実験条件下での HaCaT 細胞に対する抽出物の安全性プロファイルを確認しています。

ROS 生成に対するサルビア ヘンケイ抽出物の活性は、3-24 時間の処理後、H2O2 曝露の前後に HaCaT 細胞でアッセイされました。

図 2A の結果は、特に 3- 時間の処理時間中に、SH が細胞内の基底 ROS レベルを低下させることができることを示しています。 H-Oz 刺激 (図 2C) 後の ROS レベルの大幅な増加に加えて、SH は ROS の生成を防ぐことができます。 SH 抽出物 (0.01 ug/ml) は、酸化刺激によって誘導される ROS 生成を大幅に (-25 パーセント) 減少させ (図 2B)、3 時間の処理後に NAC と同等の効果を示しました。 24 時間の SH 治療は、1 および 10 ug/ml で ROS レベルを大幅に低下させるという点で、ROS 効果を打ち消す効果があるように思われます (図 2B)。 これらの結果は、サルビア・ヘンケイを確認します

抗酸化効果は、以前に観察されたように[18]、短期間の治療からすでに始まっている抗酸化基礎効果を示しています。 酸化刺激による増加を防ぐ効果は、より長い治療時間に最も関連しています。

紫外線は、人間の皮膚の細胞内 ROS レベルの増加を誘発し、損傷や早期老化、その他の病状を引き起こすことが報告されています [23-25]。 したがって、UVB を介した ROS 産生に対する SH 抽出物の効果が評価されています。 予想通り、図 3C の結果は、UVB 刺激後の細胞内 ROS レベルの大幅な増加を示しています。 細胞内の基底 ROS レベルを低下させる傾向を誘発する SH による処理 (図 3A) は、UVB 刺激によって誘発される増加を防ぐことができます (図 3B)。 3 時間の SH 治療は、ROS レベルを低下させる傾向を誘発します。 より長い SH 治療は、図 3 aで報告されているように大幅な減少を示す、酸化ストレスに対抗するのにより効果的です。 これらのデータは、UVB を介した酸化ストレスにおけるサルビア ヘンケイの抗酸化活性を強調しています。

前述のように、加齢に伴う光老化した皮膚に老化細胞が蓄積し、加齢に伴う皮膚の変化や病状に寄与していることを示唆する証拠が増えています [26]。 したがって、Salvia hankie の効果は、p21 および p27 老化マーカー (網膜芽細胞腫タンパク質 (Rb) のリン酸化を防止し、CDK2- サイクリン E に対する阻害活性をそれぞれ有する [27]) で評価された。紫外線。 図 4 の結果は、UVB 照射が刺激されていないコントロールと比較して、p21 および p27 mRNA レベルの有意な増加を誘発することを示しています。cistanche แอ ม เว ย์増加の防止において同様の傾向が、SHで処理された細胞で観察されます。 SH 1 μg/ml は、UVB 刺激コントロールと比較して p21 レベルの有意な減少を誘発しますが、他の濃度は減少傾向を誘発します (図 4A)。 P27 レベルは、SH 0.01,0.1 および 10 ug/ml での前処理によって大幅に低下します (図 4B)。

老化細胞は、老化関連分泌表現型 (SASP) として知られるケモカイン、サイトカイン、成長ホルモン、プロテアーゼの炎症誘発性混合物を分泌することにより、微小環境に悪影響を与えることも確立されています [28]。 図 5 の結果は、UVB 刺激が刺激されていないコントロールに対して IL1a (A)、IL6(B)、および IL18(C) mRNA レベルの有意な増加を誘発することを示しています。 SH による前処理は、サイトカイン レベルの増加に対抗する強力な活性を示します。 図 5A に示すように、SH 10 ug/ml は IL1a レベルを有意に低下させました。 IL6 の増加は、SH 0.01,0.1 および 10 ug/ml によって大幅に抑制されますが (図 5B)、試験したすべての濃度で IL18 レベルを大幅に低下させることができます (図 5C)。 皮膚バリアの維持 上皮細胞株に関する上記の結果を考慮して、皮膚バリアの維持および組織損傷の修復に関与するいくつかのタンパク質およびプロセスに対する SH 抽出物の効果を評価しました。

Sirtuin-1式

いくつかの in vitro 研究では、UVB 放射がヒト線維芽細胞の Sirtuinl (SIRT1) タンパク質レベルの低下を誘発することが報告されており、UVB を介した損傷に SIRT1 が関与していることを示しています [29]。 そのため、Sirtuin1 タンパク質発現に対するサルビア ヘンケイ抽出物の効果をウエスタンブロット法で評価しました (図 6)。 予想通り、UVB 刺激は、HaCaT 細胞における SIRTI タンパク質発現の有意な減少を誘発しました。 したがって、SIRT1 レベルに対する SH 抽出物の活性を調査しました。 興味深いことに、結果は、コントロールと比較して、1 ug/ml の SH 抽出物が基本条件下で SIRT1 発現の増加 (プラス 40 パーセント) を誘発したことを示しており、SIRT1 レベルに対する潜在的な刺激効果を示しています。 予想通り、UVB 刺激は SIRT1 レベルの大幅な低下を誘発します。 結果は、0.01 ug/ml SH 抽出物による前処理が、UVB 処理コントロールと比較して、サーチュイン 1 レベルの改善効果を示すことを示しています。

創傷治癒アッセイ

ケラチノ サイトは表皮の主な構成要素であり、生物と環境の間にバリアを提供します。 したがって、それらの増殖と移動は、効果的なバリアの維持と、損傷後の創傷治癒において重要な役割を果たします [30, 31]。 したがって、HaCaT 細胞移動に対する SH の効果を評価しました。 図 7A の画像は、SH による治療がスクラッチの厚さの減少につながることを示しており、HaCaT 細胞移動への影響を示しています。 図 7B は、HaCaT 細胞の移動速度のキモグラム構成を報告しています。 画像は、細胞遊走の濃度依存的な増加を示しています。 図 7C のグラフは、0.01 ug/ml の SH 抽出物で 4-8 時間処理した後の細胞移動速度の有意な増加を示しています。 8-12 時間間隔で最大の増加に達し、細胞移動速度細胞の速度はコントロールに対して約 165% です。 これらのデータは、細胞増殖で得られた結果として、最低濃度の SH 抽出物が過剰増殖表現型とは関係のない細胞移動速度の増加を誘導できることを示しています。

タイトジャンクションのメンテナンス

角質層と同様に、タイトジャンクション (TJ) は皮膚の完全性において重要な役割を果たし、水と溶質のバリアとして機能し、細胞の分化、増殖、細胞極性、およびシグナル伝達プロセスに関与しています。 最近の研究では、UV 光が TJ 構造の単一タンパク質の発現と局在を変化させ、それが皮膚のバリア機能を破壊することが実証されています [32]。

TJ破壊に対する可能な保護剤としてのサルビア・ヘンケイ抽出物の効果を評価するために、オクルディンの発現を、UVB放射への曝露後の免疫細胞化学によって測定した。 図 8A および 8B の画像は、SH の両方の濃度での処理がオクルディンタンパク質発現の増加を誘導し、表皮バリアの完全性の維持に有用な結合形成を促進することを示しています。 予想どおり、UVB 放射への曝露後、細胞は不規則で定義されていない膜リングを示します (図 8A)。 特に高濃度での SH 処理は、膜の形態を維持し、刺激されていないコントロールに匹敵する構造を維持します。 SHエキスが接合部強化を促進し、UVB照射によるダメージを防ぎ、皮膚バリアの機能を維持します。

フィラグリンの発現

フィラグリン (FLG) タンパク質発現に対するサルビア ヘンケイ抽出物の効果を、免疫細胞化学によって評価しました。 フィラグリンは、皮膚バリアの発達と維持に欠かせない構造タンパク質です。 図 9A および 9B の結果は、SH 抽出物で 24 時間処理した後のフィラグリンタンパク質発現の濃度依存的な増加を示しています。 さらに、F-アクチンタンパク質の発現は、SH による処理後の細胞の規則的な分布を示しており、これは上皮バリアのよく組織化された構造的連続性につながります。 これらのデータは、SH が皮膚バリアに有益な影響を与え、皮膚の正しい形成と機能に不可欠なフィラグリンの発現を改善することを示しています。

メタロプロテイナーゼの発現

皮膚が紫外線にさらされると、細胞外マトリックス (ECM) の損傷が誘発され、皮膚の老化の主な特徴であるしわ、たるみ、弛緩が引き起こされます。 マトリックス メタロプロテイナーゼ (MMP) は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロテオグリカンなどの ECM 成分を分解する主な原因です [33]。摂取するシスタンチの量多数の研究が、UV 照射への皮膚曝露がさまざまな MMP のアップレギュレーションを誘発し、皮膚の外観と健康に影響を与えることを強調しています [34-37]。

図 10 の結果は、UVB 放射が基底膜コラーゲンと変性構造コラーゲンを分解するゼラチナーゼ MMP-2 の mRNA 発現を増加させることを示しています [38]。 SH による処理は、MMP-2 mRNA レベル (SH 0.01-0.1-10 ug/ml) を大幅に低下させることができ、これは、細胞の構造的完全性の維持における SH 抽出物の活性を示しています。光ストレスでダメージを受けた肌。

討論

皮膚の老化は、内因性および外因性の要因の累積的な影響であり、皮膚の衰退につながり、菲薄化、こわばり、および柔軟性の喪失を引き起こします. 皮膚は生物と環境の間の最初の障壁であるため、その機能的および解剖学的完全性の維持が不可欠です。 自然な老化プロセスや、糖尿病、更年期障害などの老化に関連する状態に加えて、外因性要因が皮膚の構造に影響を与えることに同意する可能性があります。 特に、光損傷、汚染、またはライフスタイル要因 (喫煙、食事、感情的ストレスなど) は、皮膚の構造と機能を妨げる可能性があります [39,40]。 ケラチノサイトは表皮の主要な構成要素であり、最も外側のバリアの細胞基盤を提供します。 この研究では、HaCaT ヒトケラチノサイト細胞株を、フリーラジカルや紫外線 B 放射などのストレス要因にさらして、自然な皮膚の老化を模倣し、バリア機能を変化させました。 Salvia hankie は最近、潜在的な老化防止剤として同定されており、皮膚の老化および皮膚の老化に関連する障害への適用の可能性を示唆しています。 したがって、この植物の抽出物の効果は、肌の老化、肌の完全性の維持、および生理学的状態に関連するパラメーターについて深く調査されました. 通常の内因性代謝プロセスまたは UVR および汚染による活性酸素種またはフリーラジカルの生成は、皮膚の老化プロセスに寄与すると考えられています。 皮膚はさまざまな酸化還元反応の影響を受けやすく、酸化還元バランスは皮膚の恒常性の維持に不可欠です。 低濃度のROSは生理活性を発揮しますが、これらの種のレベルの増加は経路の活性化に関与し、コラーゲンの分解、エラスチンの蓄積、マトリックス分解メタロプロテアーゼの活性化などを引き起こします.[41]. さらに、ROS は、老化、炎症、損傷、および乾癬や白斑などのいくつかの皮膚疾患の病因などの病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします [42]。 興味深いことに、Salvia haenkei 抽出物は、基礎状態、酸化ストレス状態、および UVB 照射によって誘発されるストレス状態で ROS レベルを低下させることが示されており、ROS を介した変化に対する潜在的な保護効果を示しています [22]。

サルビアハンキーの以前に観察された老化防止効果を支持して、この研究では、SH抽出物がUVB放射によって刺激されたケラチノサイトの老化を減少させる能力を証明しました. 結果は、SH が、UVB 放射によって刺激される p21 および p27 老化マーカーの遺伝子発現を減少させることができることを示しています。 興味深いことに、SH 抽出物は、インターロイキンの転写を低下させることにより、細胞の光損傷によ​​って促進される炎症反応を軽減する有望な活性を示します。 さらに、興味深いことに、サルビア・ヘンケイ抽出物がストレス後だけでなく基礎条件下でもSirtuin1タンパク質発現を誘導し、老化プロセスを遅らせる有望な活性を示していることを実証しました。 サーチュイン ファミリー、特に SIRT1 は、特に MMP の阻害とその後のコラーゲン分解を通じて、光老化に関与することが示されています。 複数の研究で、UVB を介した光老化におけるその保護的役割が強調されています。 ジュグロン (5-ヒドロキシ-1、4-ナフタレンジオン) などの天然化合物は、UVB 治療後に SIRT1 を正常レベルに戻すことが示されています。 [29]。 私たちの結果は、UVBストレス後の修復プロセスにおけるサーチュインの関与の可能性と、表皮の恒常性の維持におけるサーチュインの役割も示しています。

アトピー性皮膚炎や乾癬、老化プロセスなどの一般的な炎症性皮膚疾患は、バリア機能の低下を示し、バリア破壊に対する表皮細胞の反応は、そのような状態を悪化、維持、または開始することさえあります。 この作業の結果は、これらのプロセスに関与するいくつかのタンパク質を調節することにより、皮膚バリアの完全性を回復する SH の強力な能力を明らかにしました。 特に、オクルディンおよびフィラグリン転写の刺激は、細胞間の接着に対する強化作用を示すことが観察された。 遺伝性および後天性のフィラグリン欠乏症は、表皮バリアに影響を与え、組織を変化させます。

細胞骨格ケラチンフィラメントと皮膚の角化エンベロープの構造[43]。 さらに、FLG 発現の欠損は、ケラトヒアリン顆粒の数の減少、天然保湿因子 (NMF) 濃度の著しい低下、および皮膚 pH のアルカリ化を誘発する [44]。 さらに、タイトジャンクション（TJ）タンパク質に属するクローディンおよびオクルディンタンパク質の変化は、老化プロセスに関してよく説明されています。 TJは、上皮細胞間の細胞間空間を密閉して機能的バリアを形成する役割を果たし、細胞の増殖と分化に関与しています[45]。 Salvia haenkei 抽出物は、フィラグリンの発現を改善し、UVB 放射によって損なわれる細胞膜上のオクルディンの局在を維持することが示されています。 健康な皮膚の維持における SH 抽出物の追加の活性は、UVB 放射によって刺激されるマトリックス メタロプロテイナーゼ 2 (MMP-2) 転写を減少させる能力によって証明されています。 MMP のアップレギュレーションは、細胞外マトリックス (ECM) の障害を引き起こすコラーゲンとエラスチンを分解することにより、老化と皮膚の病状を促進します [33, 38]。

この研究で観察された、最も一般的な皮膚分子パラメーターに対する SH 治療のプラスの効果は、45 歳から 60 歳までの 50 人の白人女性のコホートで実施された最近の臨床試験でも確認されました [46]。 サルビアハンキーはクリーム製剤で投与され、皮膚の赤みと弾力性、しわの深さ、抗酸化能などのいくつかのパラメータが、臨床評価と機器評価の両方、および被験者による自己評価によって評価されました. この研究の結果は、中程度の皮膚老化の状況で毎日適用した場合、皮膚の衰えを改善するSHの有効性を明らかにしています. 実際、84日間の塗布後、女性の肌はより弾力性があり、赤い部分の数が少なくなり、しわが浅くなりました. さらに、この研究は、クリームを毎日塗布した後、皮膚の抗酸化能力が徐々に増加することを示しています [46]。

外部環境から体を保護するシェルターとして、皮膚は常に潜在的な損傷にさらされているため、創傷治癒はすべての生物の生存に不可欠なプロセスです. 健康で傷のない肌を維持するSHの証明された能力を考慮して、この抽出物は皮膚病変の修復に役立つことにより、皮膚の再生を促進するのにも役立つと考えました. したがって、ケラチノサイトの移動に対するSH活性は、損傷後の皮膚バリアの回復における重要なステップであると最終的に考えられました。 SH抽出物処理は、HaCaTの移行速度を増加させることができるという興味深い活動を明らかにし、病変後の上皮損傷の再構築に強い効果を示しました. 移行は創傷治癒プロセスの重要な要素であるため、抽出物の非過剰増殖活性も考慮した我々のデータは、皮膚バリアの損傷の影響をより速く打ち消し、リスクを軽減するSH抽出物の潜在的な効果を示しています感染症。

私たちのデータは、サルビア・ヘンケイ抽出物が、バリアの再構築を助けたり、表皮のストレス反応を弱めたりするのに役立つ化合物であることを示しています. ヒトでの最近の試験に付随して、この研究は皮膚の老化に対する抽出物のプラスの効果に関与するメカニズムへのさらなる洞察を提供します.

この研究は、以前の研究 [18, 46] を支持して、皮膚パラメーターの調節におけるサルビア ハンキーの有効性に関連する分子メカニズムをより独特な方法で特定し、アンチエイジングに有用な魅力的な薬剤としてのサルビア ハンキーの関連性を強調しています。そして加齢による皮膚疾患。

材料と方法 細胞培養と UVB 照射

HaCaT 細胞 (ヒト自発的不死化ケラチノサイト) は、10% ウシ胎児血清 (Life-Technologies、米国マサチューセッツ州ウォルサム)、2 mM グルタミン、100 U/ml ペニシリンおよび 100 ug/ml ストレプトマイシン (Lonza、Basilea、スイス)。 細胞は、空気中の 5 パーセント CO2 の加湿雰囲気下で維持され、37 度でインキュベートされました。

実験プロトコルで要求された場合、細胞は Philips Medical Narrowband UVB PL-S ランプから供給される 30 KJ/m²UVB 放射線にさらされました。 組織培養培地による光吸収を防ぐために、これは照射前に除去され、照射プロトコールに従って、DMEM FBS および赤色フェノール フリーに置き換えられました [47]。 UVB 照射後、細胞に新鮮な増殖培地を与えたり、プロトコルに従って実験に使用したりしました。

細胞生存率 - トリパン ブルー排除アッセイ 35 x10³ 細胞を 12 ウェル プレートに播種し、一晩インキュベートした後、実験プロトコルに従って、さまざまな濃度のサルビア ヘンケイ ハイドロエタノール抽出物に曝露しました。 抽出物は、IBSA Farmaceutici Italia (ローディ、イタリア) の厚意により提供され、HPLC により 0.6 パーセント w/w のマーカー ロスマリン酸の含有量を示します。 処理後、細胞を洗浄し、0.25% トリプシン -0.2% EDTA で剥離し、トリパン ブルー (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) に培地溶液で 1:1 の比率で懸濁しました。 チャンバーバーカー血球計を用いて細胞を計数した。

ROS蛍光アッセイ

ROS は、2',7'-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート (Hz-DCF-DA、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して定量化されました [48]。 簡単に説明すると、細胞 (5x10') を 96- ウェル プレートに播種し、一晩接着させた後、SH 抽出物に 3 時間または 24 時間さらしました。 N-アセチルシステイン 5 mM (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を陽性対照として使用しました。

酸化ストレス条件については、H2Oz の非存在下または存在下で 50 μM Hz-DCF-DA の添加後に ROS レベルを測定しました [48]。 マルチラベル プレート リーダー VICTOR X3 (PerkinElmer、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) を使用して、励起 485 nm - 発光 535 nm で DCF 蛍光強度を測定しました。

UVB ストレス条件での ROS レベルの評価のために、PBS 中の SH 処理 - 50 μM Hz-DCF-DA 溶液で細胞をインキュベートすることにより、プロトコルをわずかに変更しました。 37℃で25分間インキュベーションした後、プレートをUVB放射に曝露し、マルチラベルプレートリーダーVICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)を使用して、DCF蛍光強度を励起485 nm-発光535 nmで直ちに測定した。

免疫蛍光顕微鏡法

10×104 個の細胞を、24- ウェル プレートのコラーゲンでプレコートしたガラス カバースリップに播種し、一晩付着させ、プロトコールに従って SH 抽出物で処理しました。 α-カテニンおよびオクルディンタンパク質の検出のために、上記のプロトコルで説明したように、細胞を UVB 放射にさらしました。 照射後、細胞に新鮮な増殖培地を与えるか、プロトコルに従って実験に使用しました。 免疫蛍光アッセイでは、UVB 照射の 4 時間後に細胞を洗浄し、4 パーセントのホルムアルデヒドで固定し、PBS 中の 0.1 パーセントの Triton X-100 で透過処理し、さまざまなタンパク質特異的抗体で 37 度で 1 時間染色しました。マウスモノクローナル抗オクルディン (Invitrogen Life Technologies、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)、マウス抗フィラグリン (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)。 PBSで洗浄した後、細胞を二次抗体/フルオレセインイソチオシアネート（Alexa Fluor 488抗マウスまたはAlexa Fluor 536抗ウサギ免疫グロブリンG、Molecular Probes、Invitrogen Life Technologies、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）およびファロイジンと1時間インキュベートしました室温。 RNase で 10 分間処理した後、Mowiol 40-88 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用してカバーガラスをガラス スライドにマウントし、ヨウ化プロピジウムを加えました。 共焦点顕微鏡 LSM 800、倍率 60X、ソフトウェア ZN 2.1 blue Edition (Carl Zeiss、Jena、Germany) を介して画像を取得し、ImageJ ソフトウェアを使用して定量化しました。

統計分析

統計分析は、Windows用のGraphPad Prismバージョン7.02（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）を使用して実行されました。 特に明記しない限り、結果は平均プラス SEM として表示されます。 スチューデントの t 検定が使用され、p 値<0.05 were="" considered="" statistically="">

略語

AJ:接着接合; ECM: 細胞外マトリックス;FLG: フィラグリン; Hz-DCF-DA: 2',7'-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート。 H2Oz: 過酸化水素。 MMP: マトリックス メタロプロテイナーゼ。 NAC: N-アセチルシステイン。 NMF:係数; ROS：活性酸素天然保湿

種族; SIRTl：Sirtuinl; SH：サルビアハンカチ。 TJ: タイトジャンクション。 UVB：紫外線B。

この記事は www.aging-us.com から抜粋したものです。