Gao-Zi-Yao は老齢自然高血圧ラットの学習と記憶機能を改善するパート 2

実験動物

生後 12 か月および生後 8 週間の雄の高血圧自然発症ラット (SHR) を南京動物モデルセンターから購入しました。

8-生後 1 週間の雄と記憶力の間には強い関係があります。 この期間中、雄の脳は急速に発達し、ニューロン間の接続が徐々に増加し、それが記憶力の発達に影響を与えます。

研究によると、男性の生き物の記憶力は年齢とともに向上し続けています。 これは、彼らの生存と繁殖に大きな影響を与えるだけでなく、環境に適応し、新たな課題に対処するのにも役立ちます。

したがって、若い男性がパズルを解く、新しいスキルを学ぶ、新しい分野を探索するなど、さまざまな有益な活動に参加するよう積極的に奨励する必要があります。 これらの活動は脳を刺激し、発達を早め、記憶能力を向上させることができます。

同時に、若い雄の生き物に適した環境と雰囲気も提供する必要があります。 子どもたちに安全で親近感を抱かせることで、子どもの脳の発達を促進し、記憶力を向上させることができます。

つまり、若い男性がより賢く、自信を持って有能な生き物になるよう、記憶力を向上させるために私たちはできる限りのことをすべきなのです。 これは彼らの個人的な成長に役立つだけでなく、種全体の繁栄と生存にも役立ちます。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳内の酸化反応や炎症反応を軽減し、それによって脳を保護する効果があるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。神経系の健康。 さらに、カンクサは神経細胞の成長と修復を促進し、神経ネットワークの接続と機能を強化します。 これらの効果は、記憶、学習、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発症も防ぐ可能性があります。

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このモデルでは、高血圧は生後 4 か月までに発症し始め、生後 6 か月までに脳微小血管系に高血圧に関連した変化が現れます [37]。

ラットは、標準的な衛生状態を備えた最適な条件下で飼育され、12/12の明暗サイクルで25度の温度に維持され、標準的なラットの餌と水を自由に与えられた。

すべての手順は、蘇州大学によって確立された動物の飼育と使用に関するガイドラインによって承認され、それに従って実行されました。これは、以前の報告書と一致しています[35]。

実験は、国立衛生研究所の実験動物使用ガイドライン (NIH、出版番号 85-23、1996 年改訂) に従って実施されました。 本研究はARRIVEガイドラインによって報告されています。

生後8週間のSHRを老化制御に適用しました(SHR-Young, n=10)。 生後12か月のラットを、Gao-Zi-Yaoの有無にかかわらず、蒸留水(旧SHR-C、n=10)、低用量(旧SHR-L、n=10)、中用量で治療しました。 (旧 SHR-M、n=10)、胃栄養による高用量 (旧 SHR-H、n=10)。

低、中、高の Gao-Zi-Yao の投与量は 1/2-、1- に等しく、臨床患者への適用の 3 倍の投与量は体表面積に応じて計算されます。 Gao-Zi-Yao は適用前に 5 mL の蒸留水に溶解され、乳製品を 4 週間 1 回投与されました。

血圧と心拍数はテールカフ法によって毎週監視され、以前の観察に従って体重も毎週監視されました[35]。

４週間後、モリス水迷路実験を実施し、ラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）による麻酔下で屠殺し、さらなる分析のために海馬組織を収集した。 すべての実験プロトコルは東州大学の倫理ライセンス委員会によって承認されました。

モリス水迷路実験

モリス水迷路実験 (BW-MWM101、Shanghai Bio-will Co., Ltd.、上海、中国) は、いくつかの修正を加えて以前に記載されたように実行されました [38]。 テストは 6 日間計画され、1 日目から 5 日目はトレーニング期間、6 日目はテスト結果が確認されます。

ラットは毎日２分間の訓練を受け、プラットホームに乗り込む時間を潜伏時間として記録した。 6日目にプラットフォームが撤去されました。 ラットを最も遠い象限に入れ、水泳の軌跡を2分間記録した。

学習および記憶機能のパラメータはソフトウェアによって計算されました。

ELISAによる血清NOおよび炎症因子濃度の測定

NO (カタログ番号: S0023)、IL-1 (カタログ番号: A301BH80153)、IL-2 (カタログ番号: A31038348)、IL-6 (カタログ番号: A30681042)、の血清レベルおよびＴＮＦ−（カタログ番号：Ａ３８２８０８５５）は、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．Ｓｈａｎｋｉａ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、中国、上海）を使用して測定した。すべてのステップは、製造業者の指示に従って実行した。

ニッスル染色

ラットの海馬組織を単離し、固定し、パラフィン包埋し、1% トルイジン ブルー染色液中で室温で 5 ～ 10 分間インキュベートしました。 10 個の切片を蒸留水ですすぎ、95% エタノールに 5 ～ 30 分間浸し、100% エタノールで脱水しました。

脱水後、切片をキシレンに置き、樹脂媒体を用いてカバースリップをかけた。 海馬の CA1、CA2、歯状回 (DG) 領域のニューロンの数を観察し、ImageJ 解析プログラムを使用して解析しました。

学習および記憶関連タンパク質のウェスタンブロット

学習および記憶関連タンパク質のウェスタンブロットは、我々の以前の報告に記載されているように、いくつかの修正を加えて実行されました[39]。

海馬組織を、フッ化フェニルメンタンスルホニル（R&D Systems Inc.、ミネアポリス、米国）を含むRIPA緩衝液（50 mmTris、150 mM NaCl、1% Triton-X-100、pH 7.0）でホモジナイズした。 ホモジネートを12,000×g、4℃で10分間遠心分離した。

細胞タンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜(Hybond TM-ECL; AmershamPharmacia Biotech, Inc.)に転写した。 メンブレンは、PBS 中の 5% 無脂肪乳と 0.1% Tween-20 中で室温でブロックされました。

次に、ブロットを一次抗体とともにインキュベートしました: 抗グルタミン酸受容体 1 (1:1000、Abcam, Inc.、カタログ番号: ab183797)、抗 NMDAR2B 抗体 (1:1000、Abcam, Inc.、カタログ番号: ab28373)、抗ホスホ-CaMKII 抗体（1:1000、Abcam, Inc.、カタログ番号: ab171095）、Antiphospho-CREB ​​抗体（1:1000、Abcam, Inc.、カタログ番号: 32096）または抗 GAPDH（Santa Cruz Biotech,Inc.、カタログ番号: sc-47724)。

次に、膜を二次抗体（HRP結合抗ウサギIg-G、1:2000、Abcam, Inc.、カタログ番号：ab205718）とともに1時間インキュベートした。 次に、TBS-T を使用して膜を 15 分間 3 回洗浄して過剰な抗体を除去した後、化学発光試薬 (ECL、R&D Systems Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) と 1 分間インキュベートしました。

さらに、免疫反応性バンドを電気泳動ゲル分析システム（GL2200 Pro、Crestream Inc. USA）により検出した。 バンドの強度は、Image J ソフトウェアによって分析されました。標的タンパク質の量は、GAPDH 発現によって正規化されました [39]。

統計分析

統計分析には SPSS 18.0 ソフトウェアを使用しました。 データは平均値±SEMとして表示されます。グループ化されたデータは、一元配置分散分析とそれに続くスチューデント-ニューマン-クールス検定を使用して分析されました。 以前のレポート [35] と同様に、Pvalue < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

結果

若い SHR と高齢の SHR の間の収縮期血圧 (SBP)、心拍数、体重

Yong SHR は、古い SHR と比較して最初の 2 週間で低い SBP を示し、その後 3 週間で 2 つのグループ間に差がなくなるまで上昇しました (図 2A)。

逆に、最初の 2 週間では心拍数は 2 つのグループ間に差がありませんでしたが、後半の 3 週間では若い SHR が高齢の SHR と比べて著しく増加しました (図 2B)。 若いSHRは、観察期間全体を通して、古いSHRと比較してより低い体重を示した(図2C)。

若い SHR と古い SHR の間のモリス水迷路パラメータ

海馬に依存した学習と記憶を調べるために、モリス水迷路実験が行われました。 老齢の SHR は、若い SHR と比較して、最初の 4 日間でより長い逃避潜伏期間を示しました (図 3A)。

ターゲット象限を横切る回数は、若い SHR よりも古い SHR の方が少なかった (図 3B)。

ターゲット プラットフォーム象限での時間の割合は、若い SHR と比較して、古い SHR の方が短かったです (図 3C)。 象限内の経路長のパーセンテージも、古い SHR と比較して古い SHR の方が短かった (図 3D)。 これらの結果は、高齢の SHR は認知機能に障害があることを示唆しています。

若いSHRと古いSHRの間の海馬のニューロンの数

海馬のさまざまな領域のニューロンの数をニッスル染色によってカウントした。 結果は、若いSHRと比較して、古いSHRのCA1、CA2、およびDG領域内のニューロンの数が少ないことを示しました（図4）。

若いSHRと高齢のSHRの間の海馬における学習と記憶に関連するタンパク質の発現

ウェスタンブロットの結果は、老年期のSHR海馬における学習および記憶関連タンパク質（GluR1、NMDAR 2B、リン酸化CaMK II、リン酸化CREB）の発現が若いSHR海馬よりも低いことを示しました（図5）。

高齢の SHR における SBP、心拍数、体重に対する Gao-Zi-Yao の効果

SBPに対するGao-Zi-Yaoの効果を分析した。 低用量のGao-Zi-Yaoによる治療は、対照の老年SHR群と比較して、2週目から4週目まで老年SHRのSBPを顕著に減少させ、中量および高用量のGao-Zi-Yaoを投与すると、1週目から2週目まで老年SHRのSBPが顕著に減少した。 ４週目は対照の古いＳＨＲと比較した（図６Ａ）。 これらの結果は、Gao-Zi-Yao が高齢の SHR において降圧効果を発揮することを示しています。

また、Gao-Zi-Yaoon の心拍数と体重の影響に関するデータも比較しました。 私たちのデータは、全観察期間中、すべてのグループ間で心拍数と体重に有意差がないことを示しました (図 6B、C)。

老年SHRにおける血清NO、IL-1、IL-2、TNF-レベルに対するGao-Zi-Yaoの効果

中用量および高用量のGAO-ZIYAOによる治療は、SHR対照群のレベルと比較して血清NOレベルを増加させた(図7A)。 試験したすべての用量のGAO-ZI-YAOによる治療は、SHR対照群のレベルと比較して、IL-1、IL-2の血清レベルを低下させた(図7B、C)。 しかしながら、高用量のGAO-ZI-YAOのみが血清TNF-レベルを抑制した(図7D)。

これらの結果は、GAO-ZI-YAO が酸化ストレスと炎症を調節できることを示しています。

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