単発性巣状分節性糸球体硬化症の新規候補遺伝子として同定されたRho-GTPase活性化タンパク質ミオシンMYO9A
Mar 12, 2022
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Qi Li1、Ashima Gulati2,6、Mathieu Lemaire3,7、Timothy Nottoli4、Allen Bale3、Alda Tufro1,5
1米国コネチカット州ニューヘブンのエール医学部腎臓内科小児科。 2米国コネチカット州ニューヘブンのエール医学部腎臓内科。 3米国コネチカット州ニューヘブンのエール医学部遺伝学科。 4イェール遺伝子編集センター、イェール大学医学部、ニューヘブン、コネチカット、米国。 および5米国コネチカット州ニューヘブンのエール医学部細胞および分子生理学部門
キーワード：FSGS; Myo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用; MYO9Aバリアント; RhoA活動
巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）は腎不全につながる巣状糸球体症であり、その分子的原因はしばしば未解決のままです。 ここでは、家族性の兄弟ペアの病気の可能性のある原因として、まれなMYO9Aの機能喪失ナンセンスヘテロ接合変異（p.Arg701 *）について説明します。FSGS/タンパク尿。 重要性が不確かなMYO9A変異体は、生検で証明されたFSGS患者94人のコホートにおける全エクソームシーケンシングによって同定されました。 MYO9Aは、Rho-GAPドメインを持つ型破りなミオシンであり、上皮細胞結合の組み立てを制御し、アクチンを架橋して束ね、RHOA遺伝子によってコードされる低分子量GTPaseタンパク質を非活性化します。 RhoA活性は、アクチンストレスファイバー形成とアクトミオシン収縮性の細胞骨格調節に関連しています。 Myo9Aは、invitroおよびinvivoでマウスおよびヒトの有足細胞で検出されました。 遺伝子編集により生成されたp.Arg701*MYO9A（Myo9AR701X）を搭載したノックインマウスが開発
タンパク尿、有足細胞の消失、およびFSGS。 Myo9AR701X / D変異マウスの腎臓と有足細胞は、Myo9Aハプロ不全、RhoA活性の増加、Myo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用の減少、有足細胞付着の障害、および遊走を明らかにしました。 私たちの結果は、Myo9AがRhoA活性と有足細胞機能を調節する有足細胞細胞骨格装置の新規成分であることを示しています。 したがって、Myo9AR701X /þノックインマウスは、プロバンドFSGS表現型を再現し、p.R701X Myo9AがマウスのFSGSを引き起こす変異であることを示し、ヘテロ接合性の機能喪失MYO9A変異がヒト常染色体優性の新しい形態を引き起こす可能性があることを示唆しますFSGS。 したがって、MYO9A病原性の同定
家族性または散発性の追加の個人における変異FSGS病気への遺伝子の寄与を確認するために必要です。
翻訳ステートメント
この作業は、タンパク尿と巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）の家族におけるミオシン9A（MYO9A）の機能喪失型変異を特定します。MYO9AバリアントFSGSコホートにおける重要性は不確かです。 p.Arg701 *変異を持つMyo9Aノックインマウスはタンパク尿を発症し、FSGS、発端者の表現型を再現します。 この新しい動物モデルは、有足細胞のMyo9A機能に関する新しいメカニズムの洞察を提供し、FSGSの実験的治療法のテストを可能にします。 データは、ヘテロ接合性の機能喪失MYO9A変異が寄与している可能性があることを示唆しているFSGS病因。 FSGS遺伝子検査パネルにMYO9Aを含めることを提案します。
巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）は、末期腎疾患につながる可能性のある組織学的病変です。1遺伝学的研究では、有足細胞が原因となる変異遺伝子のほとんどを発現するため、FSGSは主に巣状糸球体症であることが示されています2,3。ただし、FSGSの分子的原因は不明です。したがって、追加のFSGSを引き起こす遺伝子の同定とそれらの分子病因は、臨床的に関連があります。 ここでは、ミオシン9A（MYO9A）を全エクソームシーケンシング（WES）によってヒトFSGSの新規候補遺伝子として特定します。 この研究の全体的な目標は、患者で同定されたまれなMYO9A変異体が有足細胞機能を変化させ、invivoでFSGSを引き起こすかどうかを判断することです。 MYO9Aは、これまでヒトの腎疾患に関連していなかった、型にはまらない非筋肉ミオシンをコードします。4MYO9A変異は、関節炎および先天性筋無力症候群の患者で報告されました。運動性と形状調節、オルガネラ輸送、シグナル伝達などの機能。7–9ミオシンIIA（MYH9）とミオシン1E（MYO1E）の変異は、糸球体疾患と常染色体劣性FSGSを引き起こすことが報告されています。10–12クラス-9ミオシンは、それぞれ上皮細胞と免疫細胞によって発現されるMYO9AとMYO9Bで構成されます9,13。それらの特徴は、F-アクチン上を移動するプロセッシブシングルヘッドと、不活性化するRho-グアノシントリホスファターゼ活性化タンパク質（Rho-GAP）テールドメインです。 RhoA。 Myo9A mRNAは、脳上衣上皮、精巣、肺、腎臓の上皮で発現します。4Myo9Aノックアウトマウスは、進行性の水頭症、軽度の水腎症、尿細管障害を発症します。 9重要なことに、Myo9Aは、アクチンフィラメントを架橋および束ねてアクチンネットワークの形成を誘導するのに十分です。16
RhoAは、有足細胞のアクチン動態を調節し、糸球体の透過性を維持します17。有足細胞におけるRho-グアノシントリホスファターゼ（Rho-GTPase）活性の摂動は、糸球体疾患を引き起こします（Mouawad et al.18で概説）。 下流エフェクター（INF2）19と、Rhoグアノシン二リン酸解離阻害剤アルファ（ARHGDIA）3およびRho-GAP24（ARHGAP24）20のレギュレーターの変異は、タンパク尿とFSGSを引き起こします。 したがって、の微調整Rho-GTPase活性インビボで正常な有足細胞表現型を維持するために重要です。 18
ここでは、MYO9Aが新規の有足細胞タンパク質であり、マウスで変異するとタンパク尿、足突起消失（FPE）、およびFSGSを引き起こし、p.Arg701*MYO9A変異体に関連するヒトの表現型を複製することを報告します。 私たちの調査結果は、有足細胞におけるMyo9Aの関連性を明らかにし、Myo9Aが有足細胞RhoAを調節することを示し、p.Arg701 * Myo9AがRhoAを負に調節できず、Myo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用を減少させることによって有足細胞機能障害を引き起こすという最初の証拠を提供します。
cistancheできる腎臓病を治療する向上腎機能
方法
WES
巣状分節性糸球体硬化症臨床試験（FSGS-CT; NCT00135811）の影響を受けた2人の兄弟と94人のコホート被験者からのDNAサンプルのWESが、イルミナプラットフォームのエールDNA臨床研究所で実施されました。21–26 FSGS- CTコホートWESデータセットは、特定するために調査されましたMYO9Aバリアントマイナーアレル頻度カットオフ＃{{0}} .01パーセント（ヘテロ接合変異体）および＃0.1パーセント（ホモ接合体および複合ヘテロ接合体変異体）、バイオインフォマティクスMetaSVM、27 SIFT、28、およびCADD29スコアを使用して評価。 MYO9Aバリアントは、サンガーシーケンシングによって確認されました。 OMIM、Online Mendelian Inheritance in Man、データベース（omim.org）、および「FSGS」、「糸球体タンパク尿」、「ネフローゼ症候群」（またはこれらの組み合わせ）に関連する文献に基づく64個のFSGSを引き起こす遺伝子の遺伝子パネルこれらの用語）は、関連するバリアントを識別するために使用されました。
ノックインMyo9AR701Xマウスの生成
Myo9AR701Xノックインマウスは、CRISPR /Cas9-を介した遺伝子編集によって生成されました。30完全なメソッドは補足メソッドに含まれています。 Myo9AR701Xノックインと野生型の同腹仔（オスとメス）は、エール動物研究センターの動物管理使用委員会が承認したプロトコルに従って使用されました。
組織学/IF
ヒト腎生検およびマウス腎臓は、組織学、免疫蛍光（IF）、および透過型電子顕微鏡（TEM）のために、記載されているように処理されました。31,32IFは、マウス腎臓凍結切片および培養ポドサイトで実施されました。 一次抗体は、マウス抗MYO9A（クローン4C11; Abnova、台北、台湾）、ウサギ抗ポドシン（P0372; Sigma、ミズーリ州セントルイス）、ウサギ抗ラミニン（L9393; Sigma）、ウサギ抗アクアポリン2（PAS）でした。 -78809; Invitrogen、Carlsbad、CA）、およびウサギ抗メガリン;33の二次抗体はAlexaFluor -488および594-結合（Invitrogen）でした。 画像は、オリンパスIX71（オリンパス株式会社、新宿、日本）またはライカSP 5-スペクトル（ライカカメラ、ウェッツラー、ドイツ）共焦点顕微鏡を使用して取得しました。
イムノブロット/免疫沈降
タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、前述のようにイムノブロットしました; 31,32抗MYO9A（クローン4C11）、アクチン（A2066; Sigma）、カルモジュリン（EP799Y; Abcam、ケンブリッジ、英国）、グリセルアルデヒド{{ 9}}リン酸デヒドロゲナーゼ（6C5; Millipore Corp、マサチューセッツ州バーリントン）、RhoA（67B9; Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ビバリー）一次抗体。 共免疫沈降は、抗MYO9Aウサギポリクローナル抗体（A 305-702 AM; Bethyl Laboratories、Montgomery、TX）を使用して、記載されているように34,35実施し、続いてイムノブロッティングを行いました。
定量的PCR
全RNAは、iScript cDNA合成キット（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA）を使用して逆転写され、iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）、およびMyo9Aポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーで増幅されました：50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC -30および50-AGCAACCACAGCTCTGAAA-30は、CFX 96- Touch-Real-Time-PCR（Bio-Rad）を使用します。 記載されているように、Myo9amRNAは2-DDCt法でGAPDHmRNAに正規化されました。36
TEM/免疫電子顕微鏡
TEMは記載されているように実施しました32。イムノゴールドEMの場合、野生型マウス腎臓を固定し、極薄凍結切片をクエンチし、ブロックし、マウス抗MYO9A（クローン4C11）一次抗体とインキュベートしました。 二次抗体はウサギ抗マウスIgGであり、金コンジュゲートはヤギ抗ウサギ10nm金でした。 切片を後固定し、染色し、FEI Tecnai Biotwin（LaB6、80 kV）TEMで検査しました。
一次有足細胞の単離と機能アッセイ
足細胞は、記載されているように34、わずかな変更を加えて、野生型およびMyo9AR701X/þ腎臓から単離されました。 37,38接着アッセイは記載されているように実施され、クリスタルバイオレット染色を使用して定量化されました37。
Myo9Aノックダウン
Myo9Aノックダウン（Myo9AKD）は、Myo9A低分子干渉RNA（siRNA）（L -006539- ON-TARGETplus、Dharmacon; Horizon Discovery、Cambridge、UK）を製造元の指示に従って使用して、野生型不死化マウス有足細胞に誘導されました。 トランスフェクトされていない有足細胞および非標的siRNA（D -001810-10- ON-TARGETplus非標的対照、Dharmacon）でトランスフェクトされた有足細胞が対照として機能した。
Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>発端者、姉妹、母親が共有するT変異（上、*で示される）と、ヒトMYO9Aリファレンス配列NM _006901に基づく父親（下）の野生型（WT）配列。 （b）発端者からの腎生検は、FSGSおよび軽度の間質性浸潤（過ヨウ素酸-シッフ染色、元の倍率X 400）を示しています。 （c）家系図は、遺伝子型-表現型の分離を示します：タンパク尿/FSGSおよびMYO9Ap.R701X変異体（実線の記号）、野生型（空の記号）、または未知のMYO9A遺伝子型（＃で示される）を持つ個人。 （d）野生型MYO9A（NP _008832。2）タンパク質ドメイン：モータードメイン（灰色）には、ループ2（黄色）とカルモジュリン結合部位（赤色）、ネックドメイン（青色）、テールドメイン（ピンク）が含まれます）Rho-グアノシントリホスファターゼ活性化タンパク質（Rho-GAP）ドメイン（緑色）を含む。 ドメイン境界はアミノ酸残基番号で示されます。 予測されるp.R701XMYO9Aは、ループ2のカルモジュリン結合部位内で終了し、ネックドメインとテールドメインがなく、アスタリスクはミスセンスの位置を示しますMYO9Aバリアント識別された未知の重要性の。 （e）MYO9Aミスセンスによって変化したアミノ酸残基の進化的保存（続き）
図1| （続き）FSGSの患者で同定された変異：MYO9A改変残基p.D156G（p.Asp156）およびp.E765D（p.Glu765）（赤い矢印）は、系統発生によって高度に保存されています。 アクセッション番号：H。sapiens（NP _008832。2）、M。musculus（NP _766606。2）、R。norvegicus（NP _599162。1）、G。gallus（XP _015134553。1）、D。rerio（E7EZG2.1）、およびX.tropicalis（XP _002934596。2）は、Clustal Omega、EMBL-EBI（European Molecular Biology）とのMYO9Aマルチプルアラインメントに使用されました。研究所–欧州バイオインフォマティクス研究所、https：//www.ebi.ac.uk/ Tools / MSA / clustalo /）。 この画像の表示を最適化するには、www.kidney-international.orgでこの記事のオンラインバージョンを参照してください。
RhoA活動
活性RhoAは、製造元の指示に従ってRho活性化プルダウンアッセイ（Millipore）で測定されました39。活性RhoAはイムノブロッティングで検出されました40。
統計分析
必要に応じて、GraphPad Prism 8ソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、対応のないスチューデントのt検定とウェルチの補正またはウェルチの分散分析を使用してデータを分析しました。 P<>
結果
タンパク尿およびFSGSの患者におけるMYO9A変異体の同定
WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T、p.Arg701 * MYO9A変異体、突然変異の常染色体優性遺伝を示します（図1c）。 慢性腎臓病の母方のおじの遺伝子型は入手できません。 MYO9A p.Arg701 *（p.R701X）は、ナンセンス変異依存mRNA分解、またはMyo9Aがアクチンを架橋するために必要なMYO9Aヘッドドメインのループ2（図1d）の切断により、機能喪失を引き起こすと予想されます。 .16補足表S1は、兄弟によって共有されるすべてのバリアントを示しています。 これまでに報告されているFSGSまたはネフローゼ症候群の原因となる遺伝子の変異は、どちらの兄弟でも検出されませんでした（補足表S2）。 私たちの知る限り、これは機能喪失型MYO9A変異をヒト腎疾患に関連付ける最初の報告です。
Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18; 27–29他の3つのミスセンス変異は、3つのバイオインフォマティクス予測スコアに基づいて良性と見なされます。 p.Asp156Glyおよびp.Glu765Asp変異体で置換されたアミノ酸は、これらの残基が進化を通じて保存されているため、関連する機能を持っている可能性があります（図1e）。 また、先天性筋無力症症候群で以前に報告されたマイナーアレル頻度基準を満たさなかったMYO9A変異体（p.Arg2283His）を保有する1人の患者を特定しました。 ）MYO9A変異を持つ5人の個人で同定されました。
有足細胞および糸球体疾患におけるMYO9Aの発現
Myo9Aタンパク質の発現は、マウスの腎臓とマウスおよびヒトの有足細胞でイムノブロッティングによって検出されました（図2a）。 免疫細胞化学により、ヒト有足細胞におけるMYO9Aの細胞質発現が確認されました（図2b）。 免疫反応性Myo9Aは、マウス糸球体のIF顕微鏡で検出され、ポドシンと部分的に共局在します（図2c）。 二重標識および共焦点顕微鏡は、糸球体基底膜（GBM）の外面に沿ったMyo9Aの局在を、ポドシン（図2d）およびラミニン（図2e）と密接に隣接または共局在していることを示しています。 Immunogold EMは、Myo9Aの正確なローカリゼーションを示しています。 金粒子は、足突起の細胞質と有足細胞の細胞体に分布しています（図2fとg、補足図S1BとD）。 スリットダイヤフラムは均一にラベル付けされていません。 メサンギウム細胞と内皮細胞は有意な標識を示さない。 金粒子は近位尿細管細胞でも検出されます（補足図S1C）。
Myo9Aの発現が糸球体疾患で破壊されるかどうかを評価するために、ネフローゼ範囲タンパク尿に関連する2つのマウスモデルを調べました31,32。 同様に、糸球体Myo9Aは、Vegfaを過剰発現していない糖尿病マウス（図3b）および非糖尿病マウス（図2c）で検出されたMyo9Aと比較して、Vegfa過剰発現によって誘発されたストレプトゾトシン媒介進行糖尿病性糸球体硬化症のマウスで減少します32。 両方のタンパク尿性疾患モデルにおけるMyo9A有足細胞の足突起の局在化と糸球体Myo9Aの減少は、Myo9Aが糸球体濾過バリア機能に役割を果たす可能性があることを示唆しています。
表1| FSGS-CT患者コホートで同定されたミスセンスMYO9A変異体
p.D156G、p.Asp156Gly; p.E765D、Glu765Asp; p.M2384V、p.Met2384Val; p.P17 0 4S、p.Pro1704Ser; p.T389M、Thr389Met。 マイナーアレル頻度＃0.01パーセントでフィルタリングされたバリアント、ANNOVARアノテーションに続くn¼94サンプル。
FSGSを開発するための遺伝子編集されたMYO9AR701Xマウス
p.Arg701 *（p.R701X）MYO9Aナンセンス変異がマウスに糸球体疾患を引き起こすかどうかを判断するために、CRISPR / Cas9-を介した遺伝子編集によってノックインp.Arg701*（ここではMyo9AR701Xと呼びます）マウスを作成しました。 Myo9AR701X /þ変異マウス（図4a）は、メンデルの法則で生存可能な変異子を産出し、変異が胚的に致命的ではないことを示しています。 ホモ接合型変異体は進行性水頭症（補足図S2）、運動失調、発作を発症し、ほとんどすべてが3週齢前に死亡し、Myo9A欠損マウスを彷彿とさせます14。成人期に。
すべてのMyo9AR701X変異マウスは、年齢は異なりますが、FPEとタンパク尿を発症します。 ホモ接合性のMyo9AR701X/R701X変異体は、2週齢で光学顕微鏡で異形糸球体、尿細管拡張、およびタンパク質キャストを示します（図4b、補足図S3A）。 2-週齢のMyo9AR701X/R701X変異腎臓のTEMは、広範囲のFPE、厚くて不規則なGBM、および接着結合に置き換えられたスリットダイアフラムの欠如を明らかにします（図4d）。 対照的に、2-週齢のヘテロ接合性Myo9AR701X /þ変異体は、足の突起の定量化によって確認されるように、正常な腎組織学および糸球体濾過バリアの超微細構造（図4cおよびe）を示し、野生型同腹仔（図4f）と区別できません。 （FP / mm GBM）（図4g）。 アルブミン尿は、ヘテロ接合およびホモ接合の両方のMyo9AR701X変異マウスの尿サンプルで、2週齢のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図4h）によって検出されます。
生後4か月で、ヘテロ接合のMyo9AR701X /þマウスは光学顕微鏡でFSGSを示し（図5aおよびg）、TEMはFPE（白い矢印）、異常なスリットダイアフラム（短い黒い矢印）、不規則なGBM、およびメサンギウムの拡張を示します（図5b） 。 足のプロセスの定量化は、野生型の成人の腎臓と比較して、Myo9AR701X /þで有意なFPEを示しています（図5c）。 この糸球体の表現型は、発端者の腎生検で観察されたものと非常に似ています（図1b）。 成体のヘテロ接合性Myo9AR701X/þ変異マウスは、年齢を一致させた野生型マウスよりも有意に高い尿中アルブミン-クレアチニン比を示し（図5d）、多尿症または体重減少の証拠を示しません（図5eおよびf）。 過ヨウ素酸シッフ検査では、成人のMyo9AR701X /þ腎臓は、さまざまな重症度のFSGS（矢印、図5g）を示し、尿細管の萎縮および拡張または間質性浸潤が見られません。 デュアルラベリングと共焦点顕微鏡は、メガリンの周辺の近位尿細管でMyo9Aを検出しますが（矢じり、図5h、およびk）、アクアポリン2を発現する遠位ネフロンセグメントではMyo9Aは検出されません（図5hおよびi）。 成人のMyo9AR701X/þの両方の管状マーカーの標識は、共焦点顕微鏡法によって野生型腎臓と区別できません（図5hとkおよびiとl）。 対照的に、近位尿細管および糸球体のMyo9A染色は、野生型腎臓（図5kおよびl）と比較してMyo9AR701X /þ（図5hおよびi）で減少します。 これらの発見を総合すると、p.Arg701 *はマウスでFSGSを引き起こすMyo9A変異であり、発端者で同定されたヘテロ接合性MYO9Ap.Arg701*変異体の表現型と常染色体優性遺伝を再現します。
どのようにp。 Arg701 * Myo9A変異はFSGSを誘発しますか？
Myo9AR7 0 1Xノックインマウスを使用して、p.Arg701*MYO9A変異によって引き起こされるFSGSの分子病因を調べました。 ノックインMyo9AR701X腎臓でのMyo9Aの発現は、ヘテロ接合体では有意に減少し、ホモ接合体ではIF（図6a）およびイムノブロッティング（図6bおよびc）によって検出されません。 ナンセンス変異依存mRNA分解42によって媒介されるハプロ不全がMyo9AR701X/þ変異体で発生するかどうかを評価するために、定量PCRを実行しました。 Myo9AR701X/þ腎臓でのMyo9AmRNA発現は、野生型腎臓よりもw50パーセント低く（48.3±5.6パーセント; P <>
Myo9Aが減少すると、アクチンおよびカルモジュリンとの相互作用が減少します
Myo9Aハプロ不全がMyo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用を変化させるかどうかを調べた。 野生型とMyo9AR701X/þの腎臓と有足細胞を比較する共免疫沈降実験は、Myo9Aとアクチンおよびカルモジュリンとの相互作用を確認し、Myo9Aと両方のタンパク質との相互作用がMyo9AR701X /þ変異腎臓および有足細胞でw50％減少することを示しています（図6eおよびf）。フルレングスのMyo9Aと同様です。 対照的に、アクチンとカルモジュリンの発現レベルはそのままです（入力、図6e、およびf）。 発現低下の状況でのMyo9A相互作用を分析するために、siRNAを使用して不死化野生型マウス有足細胞にw50％Myo9AKDを誘導し、定量PCRとイムノブロッティングで評価し（図7aおよびb）、共免疫沈降実験を行いました。 Myo9AKDは、Myo9Aの発現に比例してMyo9A-アクチン-カルモジュリンの相互作用を減少させます（図7c）。 一緒に、共免疫沈降の発見は、ヘテロ接合のp.Arg701 * Myo9A変異とMyo9AKDがMyo9Aの存在量を減らし、それによってアクチンとカルモジュリンとの相互作用を減らすことを示しています。 Myo9Aは1：1のモル比でアクチンを架橋するため16、我々のデータは、ヘテロ接合性Myo9AR701X /þ有足細胞におけるMyo9Aの減少が、Myo9Aを介したアクチンの架橋とバンドリングを損なう可能性があることを示唆しています。
図2| （続き）GBM側（矢じり）のポドシン（緑）へ。 挿入図はより高い倍率を示しています。 バー= 25mm。 （e）共焦点顕微鏡は、Myo9A染色が、GBMの外面（挿入図と矢じり）に沿ってラミニン（緑色）と密接に隣接または共局在していることを示しています。 バー= 25mm。 （f、g）野生型マウス腎臓の糸球体におけるMyo9Aの免疫金電子顕微鏡による局在化：金粒子（黒い矢印）が有足細胞細胞体（POD）で観察され、足が細胞質（FP）を処理し、いくつかの金粒子が見られます糸球体基底膜の隣のFPベースではありますが、スリットダイアフラムではありません。 バー¼500nm。 この画像の表示を最適化するには、www.kidney-international.orgでこの記事のオンラインバージョンを参照してください。
Myo9AR701X変異はRho-A活性を増加させます
Myo9AR701X変異体および野生型マウスでプルダウンアッセイを使用してRhoA活性を測定し、ヘテロ接合性のMyo9AR701X /þに焦点を当てて、ヒトp.Arg701*MYO9A表現型への機構的洞察を提供しました。 アクティブなRhoAは、対応する野生型コントロールサンプルと比較して、Myo9AR701X /þ腎臓全体（図8a）、孤立した糸球体（図8b）、および初代有足細胞（図8c）で大幅に増加しています。 Myo9AR701X /þサンプルでのGTP-RhoAの増加の大きさは、孤立した糸球体でのw60％から腎臓全体および有足細胞でのw 2-倍までの範囲です（図8a–c）。 アクティブなRhoAは、ホモ接合体の方がヘテロ接合体の変異腎臓よりもわずかに高くなっていますが、その差は重要ではありません（図8a）。 一緒に、これらの実験は、Myo9AR701XがRhoA活性の増加を引き起こすことを示しています
Myo9AR701X / D変異とMyo9AKDは、有足細胞の行動を変化させます
Myo9AR701X /þ変異型有足細胞で検出されたMyo9A-アクチン相互作用の障害とRhoA活性の増加が機能に及ぼす影響を評価するために、付着および遊走アッセイを使用して有足細胞の接着と運動性を測定し、対照条件およびRho関連キナーゼ阻害剤Y27632によるRhoAシグナル伝達阻害。 これらの実験は、Myo9AR701X /þがRhoA活性依存的に有足細胞の運動性（図8d;補足図S4）および有足細胞の付着（図8e）を損なうことを明確に示しています。 有足細胞機能に対するMyo9Aハプロ不全の影響を直接評価するために、野生型マウス有足細胞をw50パーセントのMyo9A mRNAおよびタンパク質を発現するMyo9AKD有足細胞と比較する付着および遊走アッセイを実施しました（図7aおよびb）。 非標的siRNAで処理された有足細胞は、追加のコントロールとして機能しました。 Myo9AKDは、Myo9AR701X /þ有足細胞で観察されたのと同じ欠陥である、有足細胞の付着と移動を大幅に減少させます（図8fおよびg）。 まとめると、機構データは、ヘテロ接合体p.Arg701 * Myo9A変異が、Myo9Aハプロ不全を引き起こし、Myo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用の減少と、腎臓、特に有足細胞における活性RhoAの増加をもたらすことを示しています。 我々は、これらのメカニズムが一緒になって、invitroでの付着と運動性の低下およびinvivoでのタンパク尿の存在によって示される、有足細胞の機能を破壊すると解釈します。
討論
この研究は、Myo9Aを、RhoA活性を負に調節することによって有足細胞機能に影響を与える有足細胞細胞骨格装置の新規成分として特定しています。 に関連するまれなナンセンスMYO9A変異（p.Arg701 *）について説明します
家族性FSGS/タンパク尿およびこの突然変異がマウスにFSGSのような病変を引き起こすことを示し、病気のメカニズムへの洞察を提供します。
私たちの調査結果は、MYO9AがFSGS候補遺伝子であり、p.Arg701 * MYO9Aが、遺伝子予測アルゴリズム、対立遺伝子頻度、実験動物モデルを使用して因果関係を特定するためのAmerican College of Medical Geneticsガイドラインに基づいて、ヒトFSGSに関与する変異体であるという概念を支持します。 、および機能アッセイ。43,44p.Arg701 * MYO9Aを保有するプロバンド兄弟は、これまでに知られているFSGSの原因遺伝子に変異がなく、FSGSの二次的原因を示唆する証拠を示さない。 この変異体は、表現度が変化する常染色体優性遺伝形式に従って、小さな家系に共分離します。 MYO9A p.Arg701 *は機能喪失型変異体であると予測されており、対照エクソームには存在せず、対立遺伝子頻度があります<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">
無関係のFSGS小児および若年成人の大規模コホートのWESスクリーニング41により、まれなヘテロ接合性MYO9Aミスセンス変異（p.Asp156Glyおよびp.Glu765Asp）の2人の患者が特定されました。 両方のMYO9Aミスセンス変異は高度に保存された残基を含み、マイナーアレル頻度を持っています<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">
図3| 糸球体疾患マウスモデルにおける糸球体Myo9Aの発現。 （a）Vegfa過剰発現によって誘発される発達性ネフローゼ症候群31：免疫蛍光は、正常な非誘発2-週齢マウスの糸球体でMyo9A（赤）を示し、Vegfaを過剰発現するネフローゼマウスの糸球体でMyo9A発現を明らかに減少させました。変更されていません。 （b）ベグファ過剰発現を伴うまたは伴わないストレプトゾトシン誘発糖尿病32：免疫蛍光は、非誘発糖尿病腎臓（DM対照）からの糸球体でMyo9A（緑）を検出し、糖尿病性糸球体硬化症（進行性DN）を発症するベグファを過剰発現する糖尿病マウスからの糸球体で免疫反応性Myo9Aを著しく減少させる。 40、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）は、両方のセクションの核を示し、糸球体の輪郭が描かれています（白い斜線）。 バー= 50mm。 この画像の表示を最適化するには、wwwでこの記事のオンラインバージョンを参照してください。 腎臓-国際。
Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>T変異は、Arg（R）をコードするCGAを、アミノ酸701での翻訳の終了を予測する終止コドンであるTGAに置き換えます。 （b）2-週齢のホモ接合性Myo9AR701X / R701X変異腎臓からの代表的な過ヨウ素酸シッフ染色は、異常な糸球体、尿細管拡張、およびタンパク質キャストを示します。 バー=20mm。 （c）2-週齢のヘテロ接合性Myo9AR701X /þ腎臓からの代表的な過ヨウ素酸-シッフ染色は、正常な組織像を示しています。 バー=20mm。 （d）2-週齢のMyo9AR701X / R701X糸球体からの代表的な透過型電子顕微鏡は、大量の足突起の消失（白い矢印）、スリットダイアフラムの欠如、接着結合（黒い矢印）、および肥厚した不規則な糸球体基底膜を示しています膜（GBM）。 バー=1mm。 （e）2-週齢のヘテロ接合性Myo9AR701X /þ糸球体からの代表的な透過型電子顕微鏡は、正常な足の突起（黒い細い矢印）と正常なスリットダイアフラム（白い細い矢印）を示しています。 バー=1mm。 （f）2-週齢のWT同腹子からの透過型電子顕微鏡は、正常な糸球体濾過バリアを示しています：スリットダイアフラム、有窓内皮細胞（EC）、および薄いGBMによってリンクされた薄い足のプロセス。 バー=1mm。 （g）2週齢での足突起消失の定量化：ホモ接合型Myo9AR701X / R701X腎臓は、WTまたはヘテロ接合型Myo9AR701X /þ同腹仔よりも半足突起（FP）/ mm GBM未満を示し、重度の足突起消失を示します。 P <0.0001（分散分析）。 （h）ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分解された尿サンプルのクーマシーブルー染色は、myo9ar701x="" r701x（プラス/-）とmyo9ar701x="" （þ/プラス）の両方でアルブミン尿（alb）を示しますが、wt尿はアルブミンを含みません。="" ウシ血清アルブミン（10="" mg）は、分子量コントロールとして機能します。="" pod、有足細胞。="">
図5| 成体のヘテロ接合性Myo9AR7{{20}} 1X/Dノックインマウスの表現型分析。 （a）4-月齢のMyo9AR701X /þ腎臓からの代表的な過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色は、広範囲の巣状分節性糸球体硬化症とメサンギウム増殖を伴う糸球体を示しています。 バー= 50mm（b）4-月齢のMyo9AR701X /þ腎臓からの代表的な透過型電子顕微鏡は、広範囲の足突起の消失（白い矢印）、接着結合によるスリットダイアフラム（細い黒い矢印）の部分的な置換を示しています（太い黒い矢印）。 バー=2mm（c）成体Myo9AR701X /þ変異マウスにおける足突起消失の定量化：野生型（WT）と比較して、4か月齢のヘテロ接合（Het）Myo9AR701X/þは2.2±0.06FP/mmを示します）3.7±0.13FP/mm。 **** P<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">
Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001。 （e）尿量（24時間）および（f）体重は、WT（n =18）マウスとMyo9AR701X /þ（Het、n =16）マウスで違いはありません。 （g、j）Myo9AR701X /þ（g）およびWT（j）腎臓からの代表的なPAS染色：（g）2つの糸球体で初期の巣状硬化症（矢印）およびメサンギウム増殖を示し、正常な背中合わせの尿細管で浸潤はない。 （j）WT腎臓の正常な糸球体と尿細管を示しています。 バー=50mm。 （h、k）Myo9A /メガリン免疫蛍光の共焦点顕微鏡：（h）Myo9AR701X /þ腎臓は、メガリン（緑）で標識された近位尿細管細胞で限られたMyo9A（赤）信号（矢じり）を示し、近位尿細管は拡張していません。 （k）WT腎臓は、近位尿細管細胞でメガリンに隣接するより豊富なMyo9A（矢じり）を示します。 バー=25mm。 （i、l）Myo9A /アクアポリン2（AQP2）免疫蛍光の共焦点顕微鏡：（i）Myo9AR701X /þ腎臓は糸球体（矢じり）に限定されたMyo9A（赤）を示し、Myo9AはAQP2（緑）で標識された遠位ネフロンセグメントでは検出されません、拡張されていない; （l）WT腎臓は、糸球体でMyo9A染色を示し、遠位ネフロンセグメントでAQP2染色を示します。 バー=25mm。 EC、内皮細胞; FP、足は細胞質を処理します。 GBM、糸球体基底膜。 この画像の表示を最適化するには、www.kidney-international.orgでこの記事のオンラインバージョンを参照してください。
図6| Myo9AR701Xノックイン腎臓および有足細胞におけるMyo9A発現およびMyo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用。 （a）免疫蛍光は糸球体Myo9Aとポドシンを検出します：Myo9A糸球体免疫染色（赤）は野生型（WT）腎臓で強く、Myo9AR701X /þ糸球体で有意に減少し、Myo9AR701X/R701X糸球体では検出されません。 ポドシン（緑）はすべてのマウスの有足細胞に局在します。 有足細胞-Myo9Aの部分的な共局在はマージ（黄色）で示されています。 バー=50mm。 （b）イムノブロッティング：無傷のMyo9A（280 kDa）発現は、Myo9AR701X /þ（ヘテロ接合[Het]）腎臓では約半分に減少し、Myo9AR701X / R701X（ホモ接合[Hom]）腎臓では検出されません。<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >糖尿病のZuckerラットで報告されたDNAアレイによるMyo9A発現の2-倍の減少49。一緒に、Myo9A発現データは、Myo9Aが糸球体濾過バリアで役割を果たす可能性があることを示唆しています。
インビボでのp.Arg701*MYO9Aナンセンス変異の関連性を理解するために、遺伝子編集によってMyo9AR701Xノックインマウスを作成しました。 ホモ接合性のMyo9AR701X/R701X変異体は進行性の水頭症を発症し、Myo9A欠損マウスと同様に3週齢までに死亡します14。アルブミン尿に関連するスリットダイヤフラムと拡張した尿細管の不足。 成体のMyo9A欠損マウスは、近位尿細管障害、多尿症、および低分子量タンパク尿を示しています15。残念ながら、糸球体の超微細構造データはレポートに含まれていませんでした;15驚くべきことに3-から6-月齢のMyo9A -ヌルマウスは、以前に記載されたように進行性水頭症に屈しませんでした。 2-週齢のMyo9AR701X/R701X変異体で観察された尿細管拡張は、成体Myo9A欠損マウスで説明された尿細管障害の初期の証拠を表している可能性があります。
Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-初代ポドサイトの倍数（c）、n =3を表すウエスタンブロットから4回の独立した実験、それぞれ3匹のマウスからプールしたライセート、定量（平均±SD）、分散分析（ANOVA）（a ）または対応のないt検定（b、c）。 * P<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">
この研究の重要な発見は、ヘテロ接合性Myo9AR701X /þノックインマウスは出生時に表現型的に正常であるが、生後4か月でアルブミン尿、FSGS、および有足細胞FPEを発症し、p.Arg701*Myo9AがFSGSを引き起こす変異であることを示しています。成体マウス。 注目すべきことに、Myo9AR701X /þ変異腎臓の組織学的および超微細構造の変化は、発端者の腎生検の診断的特徴を再現しています。 さらに、Myo9AR701X /þ変異マウスは、大量のアルブミン尿ではなく有意なアルブミン尿を発症し、近位尿細管症に続発する糸球体硬化症を引き起こす可能性があることが示唆されています。 .15型破りなミオシンは、Dab2およびキュビリンとの相互作用を通じて近位尿細管によるアルブミン再吸収に関与しているが、このプロセスへのMyo9Aの関与は実証されていない51。多尿、尿細管拡張、萎縮などのタウオパシーの証拠は検出されなかった。 、または成人のヘテロ接合性Myo9AR701X/þマウスにおける近位または遠位尿細管マーカーの異常な分布。 これらのデータは、Myo9AR701X/þマウスで観察されたFSGSが閉塞または尿細管欠損に起因するという仮説を支持していません。
機構的に、Myo9A mRNAおよび完全長Myo9Aタンパク質がw50％減少することを確認しました。これは、変異がナンセンス変異依存mRNA分解によるMyo9Aハプロ不全につながることを強く示唆しています42。調節は、最後のエクソンの前の上流に位置する変異を切り詰めるための標準的なナンセンス変異依存mRNA崩壊規則に従います42,52。これと一致して、ホモ接合性のMyo9AR701X/R701X変異体はMyo9Aヌルマウスを模倣することが観察されました。 Myo9AR701X /þ変異腎臓および初代ポドサイト、ならびにMyo9AKD不死化ポドサイトにおけるMyo9Aタンパク質発現のw50％の減少は、Myo9A、アクチン、およびカルモジュリン間の相互作用を比例的に減少させます。 これらの発見は、Myo9Aハプロ不全がMyo9AR701X/þ変異体で観察されたMyo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用の減少の基礎であるという解釈を支持します。
この研究の重要な発見は、p.Arg701 * Myo9AがRho-GAP機能の喪失を誘発し、Myo9AR701Xの腎臓全体、孤立した糸球体、および初代有足細胞でアクティブなRhoAが増加することです。 さらに、Myo9AR701X /þ変異足細胞は、RhoA依存性の付着と運動性の低下を示します。 Myo9A-GAPシグナリングは、アクティブなRhoAを減らし、Rac1およびCdc42.9,53にほとんど影響を与えません。Rho-GAPの機能喪失の増加Rho-GTPase活性したがって、Myo9AR701X /þ変異足細胞の異常な行動は、Myo9AR701X/þマウスのFPEおよびFSGSの発症に寄与する可能性があります。 私たちのデータは、invivoおよびinvitroでの有足細胞機能に対するRhoA調節不全の報告された効果と一致しています。 54〜56
Myo9Aはアクチンを架橋し、アクチンおよびカルモジュリンと協調的に相互作用することにより、invitroで一定の36-nm間隔でアクチン束の形成を誘導するため、それらの相互作用の化学量論が重要であると考えられています16。 Myo9Aを介したアクチンの架橋と束を減らし、RhoAの不活性化が起こるアクチンフィラメントに沿った部位を少なくし、それによってすぐ近くのアクチンダイナミクスと細胞レベルでのポドサイトの挙動を変化させます。 Rho関連キナーゼ阻害剤Y27632は、Myo9AR701X /þによって誘発された付着および移動の欠陥を部分的に回復し、mDia1などの追加の下流RhoAエフェクターが関与していることを示唆しています。 あるいは、Myo9AR701X /þのアクチンクロスリンクの減少は、有足細胞の付着と移動を直接損なう可能性があります。 Myo9Aのハプロ不全は、人身売買のメカニズムにも影響を与える可能性があります。7–9Myo9Aが有足細胞のアクチンダイナミクスを調節する正確な分子メカニズムはまだ解明されていません。 要約すると、Myo9AR701X/þノックインマウスでヒトタンパク尿/FSGS表現型を再現することにより、Myo9Aを有足細胞細胞骨格装置の新規成分として、またMYO9AをヒトFSGSの候補遺伝子として関与させるナンセンスMYO9A変異として同定しました。小さな家系における表現型の優勢な共分離。 まとめると、データは、Myo9Aハプロ不全が成体Myo9AR701X/þマウスで観察される表現型の分子基盤であることを強く示唆しています。 RhoA活性の増加とMyo9A-アクチン-カルモジュリン相互作用の減少の両方を伴う、ノックイン変異体Myo9AR701X /þ有足細胞では、付着と移動が損なわれることを示しました。 Myo9Aが1：1のモル比でアクチンの架橋とバンドリングを誘導し16、Myo9AR701X /þがハプロ不全、有足細胞の消失、およびFSGSの経時変化を引き起こすという観察結果を考えると、Myo9Aは他のアクチン結合タンパク質（ACTN4、INF2）は、変異すると成人でオートソーム的に優勢なFSGSを引き起こすことが知られています。 Myo9Aが有足細胞RhoA、細胞骨格、およびスリット膜タンパク質とどのように相互作用するか、およびアクチン架橋および束形成におけるMyo9A媒介欠陥が有足細胞の細胞骨格構造を直接変化させるかどうかを解明するために、追加の研究が必要です。 因果関係を確立するためのこの研究の限界には、発端者の遺伝子型の血統を拡張できないこと、および同じ突然変異を持つ追加の家系の欠如が含まれます。 p.Arg701 *の前に家族性または散発性のFSGSを有する追加の患者で、WESの所見を検証するには、さらなる研究が必要です。MYO9Aバリアント病気の原因と見なすことができ、この情報は臨床上の意思決定に使用できます。
開示
すべての著者は、競合する利益を宣言しませんでした。
謝辞
この作品は、ATへの国立衛生研究所の助成金（NIH-RO1DK109434）とメンデルの法則のためのエールセンター（NIH-U 54- HG006504）によってサポートされていました。
不死化したヒトポドサイトを提供してくれたM.Saleem（University of Bristol、UK）、生検画像を提供してくれたG. Moeckel（Yale School of Medicine、Department of Pathology）、S。Ishibe Lab（Yale School of Medicine、Department of Medicine /腎臓学）ポドサイト分離および接着アッセイに関するアドバイスについては、T。Ardito（エール医学部、病理学科）およびV. Kakade（エール医学部、医学部/腎臓学科）、IFへの貢献
共焦点イメージング、EM研究への貢献のためのSueAnn Mentone（エール医学部、細胞および分子生理学部門）、巣状分節性糸球体硬化症患者と家族、およびDNAサンプルを提供するための国立糖尿病・消化器・腎臓病リポジトリ（FSGS-CT、NCT00135811）。
補足資料
補足ファイル（PDF）
補足方法。 WESおよびバイオインフォマティクスデータ分析、ノックインMyo9AR701Xマウスの生成、およびその他の詳細な方法。
図S1。 免疫EMは、Myo9Aの発現をマウス糸球体有足細胞と尿細管上皮に局在化します。
図S2。 Myo9AR701X / R701Xは、新生児の進行性水頭症を引き起こします。
図S3。 Myo9AR701X変異マウスにおける出生後の腎組織学。
図S4。 有足細胞遊走アッセイ（創傷アッセイ）。
表S1。 発端者の兄弟によって共有されるすべての亜種のリスト。
表S2。 FSGS-CTコホートで調査された64のFSGS-タンパク尿-NS遺伝子のリスト。 補足参照。
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Copyrightª2021、International SocietyofNephrology。 Elsevier Inc.が発行。これは、CC BY-NC-NDライセンス（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）に基づくオープンアクセスの記事です。
連絡先：Alda Tufro、小児科/腎臓内科、エール大学医学部、333 Cedar Street、ニューヘブン、コネチカット06520、米国。 電子メール：alda.tufro@yale.edu 6現在の所属：腎臓病学、小児国立病院、ワシントンDC、米国。 7現在の所属：腎臓病学、病気の子供のための病院、トロント大学、トロント、オンタリオ、カナダ。 2020年5月21日に受領。 2020年12月4日改訂。 2020年12月10日受理。 オンラインで公開2021年1月4日
