グルタチオン代謝は訓練された免疫の誘導に貢献します
Apr 03, 2023
概要：
自然免疫系は異種記憶特性を示し、二次的な攻撃に対するより強い反応を特徴とします。 訓練された免疫と呼ばれるこの現象は、自然免疫細胞のエピジェネティックな代謝的再配線に依存しています。 活性酸素種（ROS）の産生は訓練された免疫の表現型と関連しているため、我々は、ROSレベルの増加と主要な細胞内酸化還元分子であるグルタチオンが訓練された免疫の誘導に役割を果たしているという仮説を立てました。 今回我々は、訓練された免疫の in vitro モデルにおける ROS の薬理学的阻害が細胞の応答性に影響を及ぼさないことを示す。 グルタチオンレベルの調節により、ヒト単球における炎症誘発性サイトカインの産生が減少しました。 グルタチオン代謝に関与する遺伝子の一塩基多型 (SNP) は、訓練された免疫による炎症誘発性サイトカイン産生能力の変化と関連していることが判明しました。
また、血漿グルタチオン濃度は、BCG ワクチン接種を受けた人の単球によって産生される、訓練された免疫のバイオマーカーである ex vivo IL-1 産生と正の相関がありました。 結論として、グルタチオン代謝は訓練された免疫の誘導に関与しており、ヒトの疾患におけるグルタチオンの機能的影響を調査するための将来の研究が保証されています。
人間の免疫は病気や感染症から私たちを守るため、非常に重要です。 免疫システムは、多くの異なる細胞、組織、器官で構成される複雑なシステムです。 彼らは連携して内外のさまざまな病原体に対処します。 研究の結果、Cistanche desserticola 多糖類とベルバスコシドが心臓と脳組織の酵素の活性を改善し、腹腔を強化することがわかりました。 細胞の貪食機能とリンパ球の増殖反応は、免疫力の向上に明らかな効果をもたらします。
キーワード:
グルタチオン; 訓練された免疫力。 マクロファージ; 代謝; 自然免疫記憶。
1. はじめに
最近まで、適応免疫は、特定の抗原に対する T 細胞および B 細胞の応答を調整し、記憶を保持する能力を特徴とする宿主防御の唯一の要素であると考えられていました。
しかし、最近の研究では、異種記憶の特徴が自然免疫系、つまり訓練された免疫と呼ばれるプロセスによるものであるとする研究も増えています[1]。 カンジダ・アルビカンス、真菌の細胞壁成分であるグルカン、さらには酸化低密度リポタンパク質（ox-LDL）などの無菌刺激に短期間曝露された単球は、感染後長期間にわたって無関係な二次刺激を受けると、炎症誘発性サイトカインの産生亢進を示します。最初の刺激は除去されました [2,3]。
さらに、疫学研究では、結核に対するカルメット・ゲラン桿菌（BCG）ワクチン接種が自然免疫細胞の抗菌機能を高め、その後無関係な感染症に対する非特異的防御を誘導し、全死因死亡率を低下させることが示されています[4]。
訓練された免疫は、細胞の転写機構に対する炎症促進反応の遺伝子のアクセス可能性を調節するエピジェネティックな変化に根ざしています。 訓練された自然免疫細胞におけるエピジェネティックな再配線には、解糖、酸化的リン酸化、コレステロール生合成などの経路を促進する代謝変化が伴います[5、6]。 これらの経路に由来する代謝産物はシグナル伝達分子および補因子であり、これらがクロマチン修飾酵素の活性を調節することができます。 グルタチオン (GSH) は細胞内の酸化還元バランスを維持する主要な抗酸化物質であり、エピジェネティックな変化に寄与することが示唆されています [7]。
さらに、BCG や oxLDL などの訓練された免疫を誘導する刺激は、二次刺激によりマクロファージの活性酸素種 (ROS) の産生を増加させます [8-10]。 私たちは、訓練されたマクロファージの代謝活性の増加により、ROS レベルも上昇し、GSH が調節され、それが訓練された免疫応答の強さに影響を与えるのではないかと仮説を立てました。
2。材料と方法
2.1. ヒト末梢血単核球 (PBMC) および単球の分離
健康なドナーからのバフィーコートは、書面によるインフォームドコンセント後に入手した(Sanquin Blood Bank、ナイメーヘン、オランダ)。 倫理的承認は CMO アーネム・ナイメーヘン (NL32 357.091.10) から得られました。 単離は、Ficoll-Paque (GE Healthcare、Chalfont St Giles、英国) 上の示差密度遠心分離によって実行されました。 続いて、高浸透圧 Percoll (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) 密度勾配遠心分離を使用して単球の単離を実行し、発熱物質を含まない冷リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 1 回洗浄しました。 細胞を再懸濁し、その後、5 μg/mL ゲンタマイシン (Centraform、オランダ、エッテンルール)、2 mM グルタマックス (Gibco、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を添加した RPMI 1640 オランダ改変培地 (Invitrogen、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で培養しました。 ）、および1 mMピルビン酸（Gibco）。 最大限の純度を確保するために、Percoll で単離した単球をポリスチレン平底プレート (Corning、Sigma-Aldrish、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国) に 37 °C、5% CO2 で 1 時間放置し、その後温 PBS で 1 回洗浄しました。
2.2. In Vitro 訓練済み免疫モデル
接着単球は以前に記載されているように培養されました [11]。 簡単に説明すると、105 個の単球を平底 96- ウェル プレート (Greiner、クレムスミュンスター、オーストリア) に播種し、1 μg/mL グルカンまたは 5 μg/mL BCG ワクチン (InterVax、オンタリオ州トロント、カナダ) とともにインキュベートしました。 10パーセントのヒトプール血清を含むRPMI。 Candida albicans 由来の -1,3-(D)-グルカン ( -グルカン) は、David Williams 教授 (米国テネシー州ジョンソンシティ医学部) のご厚意により提供されました。
指示されている場合、細胞は {{0}}.5μM ジフェニレンヨードニウム (DPI)、50 μM α-トコフェロール (AT) (Sigma-Aldrich)、0.5 μM アスコルビン酸 (AA)、1 mM N-アセチルでプレインキュベートされました。グルカン添加前に、システイン (NAC) (Sigma-Aldrich)、または 100 μM DL-ブチオニン スルホキシミン (BSO) (Sigma-Aldrich) を 1 時間添加します。 24時間後、細胞を温PBSで1回洗浄し、10パーセントのプールされたヒト血清を補充したRPMI中で5日間分化させた。 培養３日目に培地を交換した。 6日目に、マクロファージを10 ng/mLの大腸菌リポ多糖（LPS、血清型055:B5、Sigma-Aldrich）でさらに24時間再刺激した。
2.3. 活性酸素種 (ROS) の定量化
単球/マクロファージを2時間、24時間、または6日間培養し、洗浄し、冷PBSで剥がし、PBS中の5μM H2DCFDA（Life Technologies、米国マサチューセッツ州ウォルサム）とともに30分間インキュベートしました。 37℃。 細胞をフローサイトメトリー（CytoFlex、Beckman Coulter、ブレア、カリフォルニア州、米国）によって分析しました。 データ分析は、Kaluza 2.1 ソフトウェアを使用して実行されました。 前方散乱（FSC）高さ対FSC面積プロットに基づいて細胞凝集体をゲートアウトし、FSCおよび側方散乱（SSC）に従って単球/マクロファージ集団をゲートしました。 データは平均値 ± SEM として表示され、フリードマン検定とそれに続くダンの多重比較検定で分析されます。 アスタリスクで示されているように、0.05 未満の p 値は統計的に有意であるとみなされます (* p < 0.05)。
2.4. インビトロで刺激されたヒト単球の RNA 配列データ
in vitro でα-グルカンに曝露された単球の遺伝子発現解析は、以前に公開された RNA-seq データを使用して実行されました [12]。 簡単に言うと、PBMC を Ficoll-Paque (GE Healthcare) での遠心分離によって単離しました。 単球は、CD3 プラス (T 細胞)、CD19 プラス (B 細胞)、および CD56 プラス (NK 細胞) 陽性細胞 (Miltenyi Biotech、ベルギッシュ グラードバッハ、ドイツ) 用のビーズを用いたネガティブ選択を使用して精製しました。 細胞は、記載されている in vitro で訓練された免疫モデルに従って培養され、5 μg/mL のグルカンに曝露されました。 単球は曝露後 4 時間および 24 時間で収集されました。 抗酸化反応およびグルタチオン代謝に関連する遺伝子は、in vitro 単球対マクロファージ訓練済み免疫モデルにおける有意に動的な遺伝子 (p < 0.05、FC > 2.5、RPKM > 1) のリストから抽出されました。 データは、α-グルカンで処理した単球と非刺激単球の間の比のlog10として示されている。
2.5. グルタチオンの定量
細胞内の還元 (GSH) および酸化 (GSSG) グルタチオンの定量分析は、以前に記載されているように核磁気共鳴 (NMR) 分光法を使用して実行されました [13]。
簡単に説明すると、増殖培地を除去し、培養細胞を温かい PBS (37 °C) で洗浄し、液体窒素でクエンチして代謝を停止しました。 続いて細胞をプレートからこすり落とし、メタノール/クロロホルム/水、8.1:0.9:1 (vol/vol/vol) の冷 (-80 °C) 溶液を使用して抽出しました。 。 抽出物をドライアイス上で少なくとも 30 分間凍結させた後、18,{{1{{30}}}× g で 20 分間遠心分離しました-4℃で。 細胞内代謝産物を含む上清を窒素の穏やかな気流下で乾燥させながら、タンパク質ペレットをタンパク質定量のために保管し、乾燥した材料を0.05Mリン酸緩衝液（pH7.4）0.22mLを含む0.05Mリン酸緩衝液（pH7.4）で溶解することによってNMRサンプルを調製した。 NMR参照および定量のための内部標準としてのmM トリメチルシリルプロピオン酸-d4-ナトリウム塩。 noesygppr1d パルスシーケンス (Topspin v3.0、Bruker Biospin Ltd、カールスルーエ、ドイツ) を使用して、14.1 T (1H で 600 MHz) Bruker Avance II NMR で各サンプルの 1D 1H NMR スペクトルを収集しました。 グルタチオンの定量化のために、すべてのスペクトルを Chenomx NMR スイート 8.4 (Chenomx NMR スイート、v8.0、エドモントン、アラバマ州、カナダ) で処理およびインポートしました。
すべての濃度は、各サンプルの総タンパク質量に対して正規化されました。 後者は、超音波処理によりタンパク質ペレットを緩衝液(1:1、1パーセントSDS:8M尿素(0.25MトリスpH:8))に溶解することによって定量した。 次に、PierceTM BCA タンパク質アッセイキット (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) をマニュアルに従って使用して、タンパク質濃度を測定しました。
2.6. 遺伝子および代謝分析のための In Vitro および In Vivo で訓練された免疫モデル
in vitro モデルでは、付着単球を、陰性対照として培地のみ、2 µg/mL の -1,3-(D)-グルカン、または 5 µg/mL BCG (300BCG コホート) のいずれかでインキュベートしました。 ：BCG-ブルガリア株、Intervax、カナダ）、10パーセントのプールされたヒト血清の存在下、37℃で24時間。 6日目に、200 μL RPMIまたはLPS 10 ng/mL (血清型 055: B5; Sigma-Aldrich) のいずれかを用いて細胞を24時間再刺激しました。
in vivo モデルでは、健康な成人の左上腕に標準用量の 0.1 mL BCG を皮内接種し、ワクチン接種前、ワクチン接種後 14 日、90 日後に血液を採取しました。 各訪問で、5 × 105 個の PBMC を加熱殺菌黄色ブドウ球菌 (106 CFU/mL) で刺激するか、刺激せずに 37 °C、5% CO2 で放置しました。 分泌されたサイトカインは、刺激の 24 時間後に両方のモデルで測定され、訓練刺激によって誘発されたサイトカイン応答性の増加倍数が訓練された免疫の尺度として使用されました [14]。
2.7. 遺伝子解析
遺伝子分析は、ヒト機能ゲノミクスプロジェクト[15]の西ヨーロッパ系の健康な個人のコホートを使用して実行されました。 300BCG コホートは、オランダの成人 325 人（男性 44%、女性 56%、年齢範囲 18 ～ 71 歳）で構成されています。 この研究は、地方倫理委員会CMO地域アーネム・ナイメーヘン、NL58553によって承認された。091.16。 個人 (n=325) の DNA サンプルは、Illumina から市販されている SNP チップ、Infinium Global Screening Array MD v1.0 を使用して遺伝子型特定されました。 デフォルト設定の光学式 0.7.0 が遺伝子型呼び出しに使用されました [16]。 コール率が 0.99 以下のサンプルは除外され、ハーディ・ワインバーグ平衡 (HWE) が 0.0001 以下、およびマイナー対立遺伝子頻度 (MAF) 以下の変異体も除外されました。 0.001まで。 変異体の鎖は、Genotype Harmonizer [17] を使用して 1000 ゲノム参照パネルに対してアライメントされ、識別されました。 次に、ヒト参照コンソーシアム (HRC r1.1 2016) を参照パネルとして使用して、ミシガン州の代入サーバー上のサンプルを代入し、代入品質について R2 < 0.3、MAF < 5 パーセントで遺伝的変異を除外しました。 [18]、追跡 QTL マッピングでは約 400 万の一塩基多型 (SNP) が得られます。 インビトロで訓練された免疫応答に関する遺伝子型データとサイトカインデータの両方が、300 人の BCG コホートから合計 267 人について得られました。 3つのサンプルは薬剤の使用により除外され（そのうち1つは遺伝的外れ値として特定された）、1つのサンプルは研究中に1型糖尿病の発症によるものでした。
まず、訓練された細胞と訓練されていない細胞の間のサイトカイン産生の倍率変化を、訓練された免疫応答の大きさの測定値として取得しました。 サイトカイン分布の品質チェックに続き、遺伝的外れ値を除外した後、サイトカイン産生の倍率変化の分布を補正するために、共変量として年齢と性別を用いた線形回帰モデルを使用して、対数変換されたサイトカイン産生の倍率変化を遺伝子型データにマッピングしました。 我々は、p < 9.99 × 10−3 のカットオフを使用して、訓練された免疫応答に影響を与える示唆的な量的形質遺伝子座 (QTL) の関連を特定しました。 in vivo で訓練された免疫モデルを使用して、合計 296 人の遺伝子型とサイトカインの両方のデータが取得されました。
インビトロ QTL マッピングで説明した外れ値に加えて、夕方ワクチン接種を受けた 18 人が除外され、QTL マッピング前のサンプルは 278 個になりました。 まず、生のサイトカインレベルを対数変換し、訪問間のサイトカイン産生の比をサイトカイン産生の倍率変化として取得した。 年齢と性別を共変量として用いた線形回帰モデルを使用して、サイトカイン産生の倍率変化を遺伝子型データにマッピングしました。 我々は、p < 9.99 × 10−3 のカットオフを使用して、訓練された免疫応答に影響を与える示唆的な QTL 関連を特定しました。 R パッケージ Matrix-eQTL はサイトカイン QTL マッピングに使用されました [19]。
2.8. メタボロミクス解析
300 人の BCG コホートからの個人の代謝物レベルは、BCG ワクチン接種前に測定されました。 代謝の特徴は、フローインジェクション飛行時間型質量 (フローインジェクション TOF-M) 分光法を使用して General Metabolics (スイス、チューリッヒ) によって測定され、注釈が付けられました [20]。 非標的代謝物には、ヒト代謝物データベース (HMDB) に従って注釈が付けられました。 すべてのメタボロミクス測定は 2 回繰り返して実行し、各サンプルの代謝産物ごとの平均値を計算しました。 スピアマン相関分析は、ワクチン接種前の反応に関する代謝物およびエクスビボサイトカイン倍率変化について実行されました。 グルタチオンレベルと遺伝子分析で特定された対象の SNP との関係をテストするために、年齢と性別を共変量として含む線形回帰分析を各 SNP に対して実行しました。
2.9. サイトカインの定量と分析
サイトカイン産生は、IL{0} 、IL-6、および TNF 用の市販の ELISA キット (R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を製造業者の指示に従って使用して測定しました。 データは平均値 ± SEM として表示され、二元配置反復測定 ANOVA とそれに続く Sidak の多重比較検定で分析されます。 アスタリスクで示されているように、0.05 未満の p 値は統計的に有意であると見なされます (* p < 0.05)。
3. 結果
3.1. -グルカンおよびBCG誘導の訓練された免疫が持続的な活性酸素種の生成を引き起こす
ROS 放出の増加は、訓練された免疫表現型の特徴として以前に説明されています [21]。 α-グルカンまたはBCGに2時間および24時間曝露された単球は、ROSの増加を示します。 興味深いことに、この増加は培地中で 5 日間放置した後も維持され、存在していました (図 1A)。 ROS レベルの上昇には、α-グルカンに 24 時間曝露された単球におけるさまざまな抗酸化遺伝子の転写変化が伴います (図 1B)。 ミトコンドリアのスーパーオキシドジスムターゼ SOD2 およびさまざまなチオール含有分子、すなわちチオレドキシン依存性過酸化物還元酵素 1-6 (PRDX 1-6) およびスルファイアドキシン 1 (SRXN1) が上方制御されます。 関連するチオール含有 ROS スカベンジャーであるチオレドキシン (TXN) およびチオレドキシン レダクターゼ (TXNRD) の発現も増加します。
図 1. 訓練された単球の ROS レベルの増加は、炎症誘発性サイトカイン産生の増強には寄与しません。 (A) 単球をα-グルカンおよびBCGに曝露してから2時間、24時間、および6日後のROSレベル(n=6/9ドナー、2/3の独立した実験からプール。フリッドマン検定、ダンの多重比較検定) 。 (B) 刺激されていない細胞と比較した、α-グルカンに 24 時間曝露された単球における抗酸化防御に関与する遺伝子の発現レベル。 式は log10(比率) として表されます。 (C) 0.5μM DPI (n=6 人のドナー、2 つの独立した実験からプール) および (D ) 1 mM NAC、50 μM AT、または 0.5 μM AA (n=6 人のドナー、2 つの独立した実験、二元配置 ANOVA、Sidak の多重比較検定からプール)。 (平均 ± SEM、* p < 0.05)。
しかし、主要な ROS 生産者である NADPH オキシダーゼをジフェニレンヨードニウム (DPI) で阻害したり、α-グルカンとインキュベートする前の抗酸化分子であるトコフェロール (AT) やアスコルビン酸 (AA) を添加したりしても、マクロファージの応答性の増加は調節されませんでした。 グルカン、TNF、およびIL-6に曝露されたマクロファージでは、LPS再刺激の24時間後の分泌は、この薬理学的アプローチによって変化しませんでした(図1C、D)。
しかし、DPI 単独への曝露は、LPS 刺激による IL-6 産生を増加させました。 (図1C)。 一般的な ROS スカベンジャーである N-アセチルシステイン (NAC) による前処理は、グルカンのみに曝露した細胞と比較して、TNF および IL-6 産生の減少を引き起こしました (図 1D)。 まとめると、我々は、ROS 産生の増加が、β-グルカン誘導の訓練された免疫のサイトカイン産生の増加において小さな役割を果たしていることを示します。 さらに、NAC は ROS スカベンジャーであるだけでなく、グルタチオン合成の前駆体としても機能するため、訓練された免疫の持続的な ROS レベルの増加は、細胞の抗酸化物質であるグルタチオンの調節と関連している可能性があります。
3.2. グルタチオン代謝は訓練された免疫反応に影響を与える
α-グルカンに 24 時間曝露された単球は、この時点で見出された ROS レベルがより高いことによる、酸化型グルタチオン (GSSG) のレベルが高くなります (図 2A)。 休止期間の後、訓練されたマクロファージでは還元型グルタチオン (GSH) が増加する傾向があり、酸化型の濃度は変化しません。
図 2. グルタチオンレベルは、β-グルカンに曝露されると調節されます。 (A) 1 μg/mL グルカンに 24 時間曝露し、休止期間から 5 日後の単球におけるグルタチオン細胞内レベルの減少および酸化 (n=4 人のドナー、2 つの独立した実験からプール)。 (B) β-グルカンに 4 時間および 24 時間曝露された単球におけるグルタチオン代謝に関与する遺伝子の発現。 式は log10(比率) として表されます。 (C) 100 μM BSO で 1 時間前処理した後、グルカンで訓練されたマクロファージによって産生された TNF および IL-6 (n=9 ドナー、3 つの独立した実験からプール、* p < 0.05 二元配置分散分析) 、Sidak の多重比較検定) (平均 ± SEM)。
律速酵素グルタミン酸システインリガーゼのサブユニットをコードする遺伝子 (GCLC および GCLM) は、対照単球と比較して、β-グルカン刺激の 4 時間後に発現の増加を示します。 グルタチオン レダクターゼ (GSR)、グルタチオン ペルオキシダーゼ 7 (GPX7)、およびグルタレドキシン ファミリーの酵素 (GLRX、2、5) も 24 時間の時点で上方制御され (図 2B)、合成の増加だけでなく、グルタチオンのリサイクル率。 グルカン曝露前にブチオニンスルホキシミン（BSO）でGCLの活性を薬理学的に阻害すると、LPS再刺激後のIL-6産生の減少につながります（図2C）。 したがって、前駆体NACの添加によるグルタチオンレベルの補充、またはBSOによる酵素GCLのブロックによるグルタチオンレベルの低下のいずれかの外因性グルタチオンレベルの調節は、二次刺激に対するα-グルカンの増加した応答性を弱めた。
グルタチオン代謝に関与する遺伝子の遺伝的変異が訓練された免疫に影響を与えるかどうかをさらに調査するために、325 人の健康な個人のコホートを使用して QTL マッピングを実行しました。 グルタチオン代謝に関連する遺伝子のマイナー対立遺伝子頻度 (MAF) > 0.05 を持つ一般的な SNP が、-グルカンおよび BCG の in vitro トレーニング時の単球の炎症誘発性サイトカイン産生能力の変化と関連しているかどうかをテストしました (図 3A、 C)。
同様に、278 人の健康な個人の BCG ワクチン接種によって誘導される in vivo 訓練免疫に対するこれらの遺伝的変異の影響も評価しました (図 3B、C)。 グルタチオン代謝に関与する遺伝子の 250 kb の範囲内のいくつかの SNP は、トレーニング後の IL-1 、TNF 、および IL{9}} 分泌の上方制御と示唆的に関連していました (p 値 < 9.99 × 10−3 )。 (図 3A、B)。
同じコホートで、BCGワクチン接種前にグルタチオン代謝に関与する血漿代謝産物を測定しました。 in vitro および in vivo 分析で同定された SNP は、循環グルタチオン濃度と有意に関連していました (p 値 < 0.05) (図 3D)。 さらに、BCGワクチン接種90日後、異種刺激黄色ブドウ球菌へのin vitro曝露時の血漿グルタチオン濃度とex vivo IL-1産生との間に正の相関があることを発見した（図3E）。 BCG ワクチン接種による IL-1 産生の上方制御は、メチオニン、システイン、グルタミン酸、グリシンなどのグルタチオン代謝に関与する他の代謝産物の循環濃度とも正の相関があります (図 3E)。 全体として、LPS (図 3A) または黄色ブドウ球菌 (図 3B) に対する先天性異種応答の QTL を含むグルタチオン代謝に関与する遺伝子、およびグルタチオン血清レベルと ex vivo IL-1 産生との相関関係は、両方とも次のことを示しています。訓練された免疫の確立におけるこの経路の役割。
図 3. グルタチオンは訓練された免疫機能と関連しています。 グルタチオン代謝に関与する遺伝子にマッピングされた SNP と、(A)-グルカンとBCG (IL-6 については=251 人の健康なボランティア、TNF については=238 人の健康なボランティア) および (B) in vivo BCG トレーニングの反応 (n {{10}}健康なボランティア）。 (C) 分析ごとの最も低い p 値 SNP の箱ひげ図 (rs7768134、rs35568915)。 (D) rs2233294 (GPX3) および rs10136944 (GLRX5, n=302) の遺伝子型ごとに階層化されたグルタチオン血漿レベル (年齢と性別で補正) を示す箱ひげ図。 各 SNP の p 値は、対象の SNP を独立変数とし、グルタチオン (年齢と性別で補正) を従属変数とした線形回帰モデルから導出されます。 (E) グルタチオン代謝に関与するベースラインでの循環代謝産物と、14 日または 90 日後に測定した PBMC 由来の黄色ブドウ球菌誘発性 IL-6、IL-1、および TNF 応答の倍率変化との間のスピアマン相関BCG ワクチン接種とベースラインとの比較 (= 297 人の健康なボランティア)。 この表は各相関関係のスピアマンの rho を示しており、赤色の相関関係は有意な正の相関関係を示しています (* p < 0.05、** p < 0.01)。 グルタチオン濃度と、0日目と比較した90日目のIL-1産生の倍率変化との間の相関関係を散布図の例として示します。
4。討議
マクロファージは、表現型をさまざまな環境刺激に適応させる可塑性細胞です。 訓練されたマクロファージは、解糖、TCA サイクル、酸化的リン酸化の増加による高エネルギー代謝に依存して、炎症誘発性サイトカインの産生を強化する応答を開始します [6、22]。
サイトカイン産生に加えて、再刺激されたBCGで訓練されたマクロファージでは、急速なROS産生を伴う酸化的バーストが増加します[8]。 BCG 処置マウスから単離された脾臓好中球も ROS 産生の増加を示します [23]。 代謝速度の増加と酸化的バーストを開始する能力の増加に応じて、α-グルカンまたはBCGに曝露された単球およびマクロファージが基礎的なROS産生の増加を示すことを観察しました。 同様の ROS 放出の増加が、oxLDL で訓練された単球でも以前に報告されています [9]。 ROS は病原体の除去においてエフェクター機能を持っていますが、シグナル伝達を媒介することもできます [24]。 ROS 生成酵素 NOX を薬理学的に阻害したり、抗酸化分子であるトコフェロールやアスコルビン酸で処理しても、サイトカイン生成が増加したグルカンは除去されませんでした。 しかし、ROS スカベンジャー NAC は、α-グルカンによって増強される TNF の産生を阻害し、訓練された免疫における ROS の役割の可能性を示しています。
興味深いことに、NAC は抗酸化分子であるだけでなく、主要な内因性抗酸化分子であるグルタチオンの前駆体としても機能します。 細胞の酸化還元系には、NAD プラス /NADH などのピリジン ヌクレオチドと、グルタチオンやチオレドキシンなどのチオール系の 2 つの主要なシステムがあります。 NAD プラス /NADH 比は、ROS レベルについて報告したものと同様に、訓練されたマクロファージの分化期間後にグルカンに曝露された単球で持続的に増加します [22]。 今回我々は、訓練された免疫においてもGSH濃度が調節されることを示す。
最も驚くべきことに、GSH 還元型の濃度は分化した訓練されたマクロファージでのみ増加しますが、酸化型 GSSG のレベルは安定しています。 これは、訓練されたマクロファージが GSH ストアを増加させ、NAD プラス /NADH とは対照的に、持続的な ROS 産生と連携しないことを示唆しています。 訓練された免疫に対するグルタチオン代謝の寄与は、健康な個人のコホート（300BCG）の遺伝的および代謝分析によってさらに強化されます。 GSH 関連遺伝子内の一般的な遺伝的多型は、in vitro および in vivo で訓練された免疫に対するサイトカイン産生の大きさに影響を与えることが判明しました (p < 9.99 × 10−3 )。 さらに、これらの QTL 遺伝子座のうち 2 つ、chr5 の GPX3 および chr14 の GLRX5 は、GSH 血漿濃度と関連していることが判明しました (p < 0.05)。
GSH は抗酸化分子ですが、さまざまなエピジェネティックなメカニズムを通じて遺伝子発現を調節することも知られています。 GSH は、ヌクレオソームタンパク質ヒストン H3 の S-グルタチオニル化で観察されるように、翻訳後修飾に関与し、最終的に s-アデノシル メチオニン (SAM) 産生につながるメチオニン経路によって駆動されます。 次に、SAM は DNA およびヒストンのメチル化に使用される主要なメチル供与体です [7]。 TCA サイクルの代謝産物であるフマル酸塩は訓練されたマクロファージに蓄積し、その誘導体であるフマル酸モノメチルは訓練された免疫表現型を誘導します [5]。 星状細胞では、誘導体フマル酸ジメチルへの急性曝露により細胞内のGSHが枯渇しますが、後の時点で総GSHが増加します[25]。 訓練された免疫は、長期記憶を与えるエピジェネティックな修飾によって支えられています[26]。 本明細書で観察された、訓練されたマクロファージのGSH含有量の増加は、自然免疫記憶の確立に必要なエピジェネティックな再配線を促進する可能性がある。
今回我々は、グルカン増強サイトカイン産生に対するBSOまたはNACの効果に見られるように、グルタチオンの薬理学的調節と細胞の酸化還元状態がマクロファージの異種反応を減少させることを示す。 さらに、健康な個人のコホートでは、GSH 代謝は訓練された免疫特性と関連しています。 GSH 代謝によって形成される訓練された免疫機構については、さらなる調査が必要ですが、代謝とエピジェネティックの両方の状況が関与する可能性があるため、この代謝ハブは将来の研究で調査すべき刺激的な手段となっています。 これらの洞察は、訓練された免疫の代謝およびエピジェネティックな配線の解明に貢献し、健康と病気に対する自然免疫の影響をより深く理解することを可能にします。 最終的には、理解を深めることは、自然免疫プロセスの調節不全を特徴とする疾患における新たな治療標的を特定するのに役立ちます。
著者の寄稿:
概念化: AVF および JD-A。 方法論: AVF、VACMK、VM および JCA-B.、MAG。 正式な分析: AVF、VACMK、VM、および JCA-B。 調査 AVF、JCA-B.、SK、LCJdB、SJCFMM、VPM、および BN。 データキュレーション: AVF、VACMK、VM、BN。 執筆—原案準備、AVF。 執筆 - レビューおよび編集: すべての共著者。 監修：MAG、MGN、JD-A。 資金調達: MAG および MGN すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。
資金提供:
JD-A。 はオランダ科学研究機構によって支援されています (VENI 助成金 09150161910024)。 MGN。 この研究は、ERC Advanced Grant (833247) およびオランダ科学研究機構の Spinoza Grant によって支援されています。 AVF は、Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT、Ph.D. 助成金 PD/BD/135449/2017) によってサポートされています。 JCAB は、コロンビアの COLCIENCIAS 科学技術イノベーション行政局からの助成金によって支援されています (Call 756/2016)。 BN は、NHMRC (オーストラリア) の調査助成金 (APP1173314) によってサポートされています。
治験審査委員会の声明:
300BCG 研究は、アーネム - ナイメーヘン、NL58553.091.16 地域の CMO 地域倫理委員会によって承認されました。
インフォームド・コンセントの声明:
倫理委員会アーネム・ナイメーヘン(番号:2010-104)の承認に従って、研究に関与したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。
データの可用性に関する声明:
この研究で提示された RNA 配列データは、アクセッション番号 GSE85243 で NCBI Gene Expression Omnibus で入手できます。
謝辞:
著者らは、300BCG 研究に参加してくださったボランティアの皆様に感謝いたします。
利益相反:
MGN は TTxD の科学的創設者です。 残りの著者は利益相反を宣言していません。 資金提供者は研究の計画に何の役割もありませんでした。 データの収集、分析、または解釈において。 原稿の執筆や結果の出版の決定において。
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アナイサ・V・フェレイラ 1,2,* , ヴァレリー・ACM・コーケン 1,3,4 , ヴァシリキ・マザラキ 1 , サラントス・コスティディス 5 , フアン・カルロス・アラルコン＝バレラ 5 , L. シャーロット・J・デ・ブリー 1 , シモーネ JCFM ムアラグ 1 , ベラ・P . モリッツ 1 、ボリス・ノバコビッチ 6,7、マルティン・A・ジエラ 5 、ミハイ・G・ネテア 1,8、ホルヘ・ドミンゲス＝アンドレス。
1 内科およびラドバウド感染症センター (RCI)、ラドバウド大学ナイメーヘン医療センター、6500 HB ナイメーヘン、オランダ;
Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);
Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);
Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN)。
2 Instituto de Ciências Biomedicas Abel Salazar (ICBAS)、ポルト大学、4050-313 ポルト、ポルトガル。
3 TWINCORE、ヘルムホルツ感染症研究センター (HZI) とハノーバー医科大学 (MHH) のジョイント ベンチャー、30625 ハノーバー、ドイツ。
4 ヘルムホルツ感染症研究センター (HZI) とハノーバー医科大学 (MHH) の共同事業である個別感染医学センター (CiiM)、個別感染医学計算生物学部、30625 ハノーバー、ドイツ。
5 プロテオミクスおよびメタボロミクスセンター、ライデン大学医療センター (LUMC)、2333 ZA ライデン、オランダ; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)
6 エピジェネティクス研究、マードック児童研究所、パークビル、ビクトリア州 3052、オーストラリア;boris.novakovic@mcri.edu.au。
7 メルボルン大学小児科、メルボルン、VIC 3052、オーストラリア。
8 ゲノミクスおよび免疫制御部門、生命医科学研究所 (LIMES)、ボン大学、53115 ボン、ドイツ。
* 対応: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); 電話番号: プラス 31-2436-16636 (JD-A.)。
For more information:1950477648nn@gmail.com
