天然に存在するフラボノイドであるゴシピトリンは、鉄によって誘発されるニューロンおよびミトコンドリアの損傷を軽減します：パート2
Mar 16, 2022
お問い合わせくださいoscar.xiao@wecistanche.com詳細については
2.5。 Gos-Fe（I）錯体の検出
上記の結果を説明するもっともらしい仮説は、GosがFe（II）と一過性の複合体を形成し、酸素による酸化を促進するというものです。 この遷移錯体は、Fe（）-クエン酸塩よりも容易に電子を送達し、Fe（III）とのより安定した錯体を生成する可能性があります。 図6Aは、276、332、および38 0 nmで最大吸収を示すGosの典型的なスペクトルを示しています（黒い線）。 Fe（）の添加により、最大吸収ピークが濃度依存的に低下し、500 nm付近に新しいピークが出現しました（図6A）。 ゴススペクトルに由来する一連のスペクトルの発生は、λiso=405 nm（黒い点を参照）に等吸収点が存在することで確認されました。これは、遊離ゴスと錯化ゴスの間の化学平衡（錯化）を示しています。 挿入図（図6A）は、化学量論2：1（ゴス鉄）の錯体の形成を示しています。 このようなゴス鉄錯体の化学量論は、モル比0.5で破壊点を示すジョブの方法によって決定されました。
鉄とGosの相関関係に関するさらなる証拠は、IR分光法によって得られました（図6B）。遊離Gosとその鉄錯体の場合、3000-4000cmの範囲にある広帯域は水素の伸縮と見なされました。水分子の存在による結合ヒドロキシル基。 フリーゴスのv（C=O）伸縮モードは1654 cm-Iで発生し、1636cm-Iupon複合体形成にシフトしています。 この結果は、Fe（Ⅱ）がカルボニル酸素と相関していることを示唆している[31]。 さらに、630 cm-Iでのv（Fe-O）伸縮振動の存在は、鉄-Gos複合体の形成を裏付けています。これは、遊離Gosがそのようなバンドを示さないためです。
図6.（A）Gos UV-VISスペクトル（200-600 nm）に対するFe（II）の影響。 125 mMスクロース、65 mM KCl、1 0 mM HEPESバッファー（pH 7.2）、2 mMクエン酸塩、およびGos1.6μMを含むインキュベーション混合物。上から下のトレースまでのFe（I）の濃度は{{12 }}、0。16、0。32、0。48、{{2 0}}。64、0.8、0.96、および1.12μM.Inset∶一定の総濃度でのGos-Fe（II）複合体のジョブのプロット【Fe（D）】と【Gos】=1。6μM。 黒い点は等吸収点を示します。 下向きの矢印と上向きの矢印は、それぞれ380nmと500nmでの吸光度値の減少と増加を示しています。 実験は28度で行われました。 スキャン速度は2nm/sでした。ベースラインは、インキュベーション混合物に1.6μMFe（I）を加えたもので確立されました。（B）GosおよびGos-Fe（I）の赤外スペクトル。 典型的な例を示します。
2.6。 アスコルビン酸塩によるFe（III）の還元を防ぐ
Gosによって促進される鉄の第二鉄状態は、Fe（II）の触媒活性を妨げるため、もっともらしい抗酸化メカニズムを表しています。 それにもかかわらず、Fe（III）は、アスコルビン酸塩のような天然の還元剤によって、再びその鉄の形に還元される可能性があります。 後者は、フェントン-ハーバー-ワイス反応に関与するFe（II）で生物学的システムをリロードし、非常に反応性の高い・OHラジカルを生成する可能性があります。 これらの可能性を調べるために、1、10-フェナントロリンを使用して、2 mMアスコルビン酸塩とさまざまなFe（II）濃度で処理したGos溶液（100μM）からのFe（II）形成レベルを測定しました（{{6} }μM）。 図7は、Gosがないため、Fe（II）からFe（II）への最大還元率が可能であることを示しています（5.85×10-3の傾きの黒い線）。 ただし、このプロセスはGosの存在によって遅くなり（1-分のインキュベーション、緑色の線）、Gosとの5分間のインキュベーション後、アスコルビン酸塩によるFe（I）の還元率はほぼ3分の1に減少しました（赤色の線）。 2.04×10-3）の傾きで。 この結果は、アスコルビン酸塩を介したFe（）のFe（I）への還元を阻害するGosの能力を示しています。
図7.Gosは、ラット肝臓ミトコンドリアの非存在下でアスコルビン酸塩によるFe（ⅢI）還元を阻害します。 実験条件：125 mMスクロース、65 mM KCl、10 mM HEPESバッファー（pH7.2）、1 mMクエン酸塩、Gos100μM。 実験は28度で行われました。 アスコルビン酸塩（4 mM）および5 mM 1、10-フェナントロリンを1分または5分のGos-Fe（I）インキュベーション後に添加しました。 線は3つのアッセイの代表です。
2.7。 Gosは2-デオキシリボースの酸化分解から保護します
フリーラジカルではなく鉄に優先的に作用するGosの能力を文書化するために、2.8または28 mM 2-デオキシリボースを鉄から保護する際のGosおよび2・OHスカベンジャー（DMSOおよびサリチル酸）の有効性を評価するための競合研究を実施しました媒介酸化損傷（図8）。20mMのOHスカベンジャーは、2.8 mM2-デオキシリボースよりも大幅に少ない28mM2-デオキシリボースを保護しました（p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">
図8.Fe（II）-EDTAとアスコルビン酸塩によって誘発される2.8または28 mM2-デオキシリボースへの酸化的損傷に対するGosおよび・OHスカベンジャーのジメチルスルホキシド（DMSO）とサリチル酸塩の効果。 溶液を37度で30分間インキュベートし、10 mMリン酸緩衝液（pH7.2）、2-デオキシリボース（2.8または28 mM）、150μMEDTA、および50μMFe（ⅢI）を含みました。 。反応は、アスコルビン酸塩を最終濃度2 mMまで添加することで開始しました。バーは、平均値±SD（n =3）を示しています。コントロールには、Gosサンプルの溶媒濃度であるDMSO（0.001パーセント）のみが含まれています。片側t検定は*pに使用されました<0.05, n.s.,="">
3.ディスカッション
虚血性および出血性脳卒中を含むいくつかの神経変性条件下で放出された鉄は、脳の鉄の恒常性の調節解除を引き起こし、神経学的損傷の病態生理学につながる[4、32-34]。 細胞内レベルでは、ミトコンドリアの機能障害が鉄を介した神経細胞死に関与しているようです[10,15、35-38]。 前臨床の証拠は、あらゆる種類の脳卒中を含む神経変性に対して、鉄キレート剤、主にメシル酸デフェロキサミンを使用することの利点を裏付けています[7,16]。 しかし、それらの高いコストと入手不可能性、および古典的な鉄キレート剤の幅広い悪影響により、ホメオスタシス異常症の鉄管理に天然キレート剤が使用されるようになりました[39,40]。
Cistancheは免疫力を向上させることができます
Gosの保護作用は、HT -22細胞と、鉄/クエン酸塩混合物とインキュベートしたラット-脳ミトコンドリアで示され、鉄による酸化的損傷に対する強力な保護が見られました。 鉄過剰症（24時間）に曝露されたマウス海馬HT -22細胞は、生存率の低下を示しました。これは、初期のミトコンドリア膜電位の消失とATPの低下と密接に関連していました（それぞれ図2A-C）。 これは、ミトコンドリアの機能障害がニューロンの致死に寄与することを示唆しています。 確かに、私たちの条件下では、鉄によって誘発されるニューロン死の前にミトコンドリア機能が失われるため、ニューロンにアップロードされたFe（II）の少なくとも一部が細胞小器官に到達すると予想されます。 したがって、鉄過剰症はマウス海馬HT-22細胞死とミトコンドリア断片化を誘発することが示されています[41,42]。 同様に、持続的な鉄曝露は、ドーパミン作動性神経芽細胞腫SHSY5Y細胞のミトコンドリアROSレベルを増加させます[43]。 さらに、海馬ニューロンへの広範な鉄の流入、およびミトコンドリアの損傷が、100μMの第一鉄への曝露後に確認されました[36]。 ここでは、鉄の影響を受けた海馬ニューロンの生存能力のGos誘発性の保存が、ミトコンドリア膜電位とATPレベルの保存と密接に関連していることを観察しました。
無傷の細胞と同様に、鉄への直接のミトコンドリア曝露は、細胞小器官の広範な腫れ、膜電位の消失、およびATPの喪失を引き起こしました（それぞれ図3A-C）。この実験設定では、Gosは上記のパラメーターの保存によって表された鉄過負荷ミトコンドリア。 この意味で、マイクロモル濃度の鉄を負荷したミトコンドリアは、鉄キレート化に敏感であるがカタラーゼ抗酸化作用に依存しない方法で、ミトコンドリア透過性遷移孔の開口と△Y散逸を経験したことが観察されています|44]。 興味深いことに、Mito-Tempo抗酸化剤は、ミトコンドリアのスーパーオキシドアニオンラジカルを除去し、ミトコンドリアの形態学的完全性と膜電位を維持することにより、海馬ニューロンの鉄過剰損傷から保護することが報告されました[36]。 最近、このフラボノイドの抗酸化作用と、PC12細胞を化学的低酸素誘発死から保護する能力について説明しました[29]。ここで、Gosのフリーラジカル捕捉および抗酸化能力は、鉄媒介性に対する保護に部分的に関与していると結論付けられました。 HT-22とミトコンドリアの損傷。 ただし、鉄を介した脂質過酸化反応とtertブチルヒドロペルオキシドを介した脂質過酸化反応に対するGosの有効性の向上（それぞれ図4A、B）は、鉄との相互作用能力が鉄による損傷に対する主なメカニズムであることを強く示唆しています。
Gos-Fe相互作用をさらに特徴づけるために、いくつかの無細胞およびミトコンドリアフリーの実験が行われました。 ポリフェノールをFe（II）と共培養すると、金属イオンの濃度が低下し、それに対応して酸素消費率が増加することが観察されました（図5A-C）。 これらの効果は、Gosがクエン酸錯体からFe（II）を除去し、電子受容体としてO2を必要とするプロセスでそれを第二鉄の形に酸化することを示唆しています。 その結果、Gosはフェントン反応によってヒドロキシルラジカルを妨げる可能性のあるFe（II）濃度の低下を促進します。 Gos-Fe（II）複合体は、アスコルビン酸塩などの関連する還元剤の酸化を可能にし、Fe（II）の形成/再生をもたらすため、Gosがアスコルビン酸塩を介したFe（II）の還元を阻害することを実証できました。 Fe（II）に。
Gosが鉄と強く相互作用するという仮説は、ここでも分光技術によって確認され、さまざまな配列の以前の結果が裏付けられました。
ゴス鉄錯体の化学量論は、電子スピンイオン化質量分析によって特徴づけられました[45]。
これらの結果は、おそらく鉄イオンと相互作用し、触媒活性酸素種の形成への関与を妨げることによる、鉄を介したニューロンの損傷に対するGosの保護効果を証明しました。 さらに、これは、Fe（入過酸化。 さらに、アスコルビン酸塩などの生物学的に関連する還元剤は、Gosの存在下で第二鉄を還元することができず、第一鉄イオンの再循環に関与する特定のフラボノイドの酸化促進特性を制限しました。 [30]。 マイクロモル濃度のGosは、2-デオキシリボースの鉄を介した酸化を防ぐ上で、従来のスカベンジャーよりも効果的でした。 この高い有効性は、酸化還元活性のあるGos-Fe（II）/（）の形成に起因する可能性があります。これは、酸化的損傷のさまざまなin vitroパラダイムで鉄と相互作用すると、抗酸化剤としての性能を向上させる他のポリフェノールで以前に観察されたとおりです。 22、46-48]。
配位子として酸素を含むキレート剤（オキソ配位子、O 2-）は、鉄をキレート化し、Fe（I）の酸化、Fe（II）の安定化を促進し、その結果、その還元の可能性49]。 生理学的pHでは、カテコールは第二鉄と熱力学的に安定したビス錯体を容易に形成し、低濃度の配位子に有利に働きます。 Gos構造にカテコール部分が存在することは、鉄との同様の相互作用メカニズムを示唆しており、これは、神経細胞およびミトコンドリアの鉄誘発性損傷に対して達成された保護を説明する可能性があります。 これに関して、マンギフェリンとグッティフェロンAが鉄の酸化を刺激し、第二鉄の還元を妨げることも以前に示しました[23,24、26-28]。
鉄をキレート化するGosの能力は、神経保護に寄与するシグナル伝達経路を促進する可能性もあります。 たとえば、プロリルヒドロキシラーゼドメイン酵素（PHD）、正常酸素下での古典的な低酸素誘導因子-lalpha（HIF -1 o）ヒドロキシル化修飾酵素は、多くの人に臨床的に有益な鉄キレート剤の重要な標的として特定されています神経障害[50,51]。PHDはカップリングファクターとして二価鉄に依存しているので理解できます[52]。 神経保護に関与しているいくつかの遺伝子は、eNOS、VEGF、EPOなどのHIF-laによって調節されています[53]。 さらに、PHD阻害に起因するHIF活性化は、転写因子としての役割とは無関係に、酸化ストレスを介したミトコンドリアの機能障害とアポトーシスを防ぐことができます[54]。
最近特徴付けられた鉄依存性の調節された細胞死であるフェロトーシスは、出血性損傷にさらされたニューロンが死ぬメカニズムとして提案されています[8]。 ミトコンドリア機能障害は最近、フェロトーシス細胞死に関連していた[55]。 したがって、鉄の損傷からミトコンドリア機能を保護するフェロトーシスの阻害は、Gosによって保護された鉄を介した神経障害に対する神経保護のもっともらしいメカニズムである可能性があり、これはさらに注目に値するでしょう。 鉄の恒常性の調節解除によって誘発される脳組織損傷に対する治療的介入としてこのフラボノイドを提案するために、鉄関連神経変性のインビボ動物モデルに対するGosの推定される有益な効果に関する追加の研究を行わなければならない。
