ドブネズミの血液、肝臓、腎臓におけるブドウ種子抽出物の健康に有益な特性とその選択された生化学的マーカーへの影響
Mar 10, 2022
概要：カドミウム（Cd）は、食物連鎖を含む環境のすべての領域で発生する重金属です。 体内では、細胞に有害なフリーラジカルを生成することにより、酸化ストレスを引き起こします。 ブドウ種子エキス（GSE）には、フリーラジカルの悪影響を中和するのに役立つさまざまな生物学的に活性な成分が含まれています。 この研究では、フェノール類が豊富な半耐性ブドウ品種シーズンから調製されたGSEが、カドミウムの影響にさらされたドブネズミの生化学的マーカーに及ぼす影響を監視しました。 GSEは血漿抗酸化活性を増加させ、腎臓肝臓では、GSEの同時投与によりCd含有量が大幅に低下しました。 したがって、クレアチニン含有量とアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の増加、およびカドミウムによって引き起こされるカタラーゼとスーパーオキシドジスムターゼ活性の減少は、GSEの同時投与によって遅くなりました。 この研究の結果は、ブドウ種子抽出物が生物への重金属の摂取に対する保護効果を提供することを明らかにしています。
1.はじめに
カドミウム（Cd）は、環境のすべての領域で発生する重金属です。 それは地球の地殻の一部であり、水に含まれ、植物に蓄積し、生物に存在します。 食物連鎖に加えて（植物に関しては、ほとんどの穀物、根菜類、野菜が供給源ですが、動物の臓器、主に肝臓と腎臓は発生源です）、人間にとって重要なカドミウムの発生源は、タバコの煙、さまざまな種類の燃焼からの呼気、冶金産業、およびいくつかの電気設備です[1,2]。 体内では、カドミウムは主にメタロチオネイン、アルブミン、および血液中の他の血漿タンパク質に結合します。 カドミウムは、細胞に有害なフリーラジカルを生成することによって酸化ストレスを引き起こす危険な有毒金属です。 フリーラジカルはタンパク質、脂質、酵素、DNAに損傷を与える可能性があるため、細胞に入る前に抗酸化物質で中和する必要があります[3]。
中和されていない場合、Cdは赤血球の崩壊を引き起こし[4]、生物、特に肝臓に蓄積し、腎臓—そして、必須元素である亜鉛と類似しているため、酵素反応に入りやすく、生化学的プロセスに関与します[5]。 それは非常にゆっくりとしか排泄されず、生物からは困難に排泄されます[6]。 抗酸化物質が酸化ストレスや重金属の損傷を防ぐ効果があることはよく知られており、この実験的研究はこの事実に基づいています。 ブドウ種子エキス（GSE）は、フリーラジカルの悪影響を中和するのに役立つさまざまな生物学的に活性な成分をマトリックスに含んでいます[7]。 GSEは、細胞の酸化的損傷を調節し、臓器の損傷を減らし、酸化剤と抗酸化剤のバランスを改善し、炎症性メディエーターの放出を減らすことにより、細胞を損傷から保護します。 また、抗炎症作用、抗アポトーシス作用、増殖促進作用もあります[8]。 重篤な疾患の代替治療法として調査中の凝縮フラバン-3-オールまたはプロシアニジンの含有量が高いことは特に重要です[9,10]。 ただし、ブドウ種子フェノール類の含有量と組成、および種子抽出物の抗酸化活性は、ブドウの栽培品種、台木、気候条件、または栽培技術[11–13]、したがって抗酸化特性によって影響を受ける可能性があります。コンクリート抽出物の保護効果と同様に、簡単に予測することはできません。 この作業の目的は、半耐性ブドウ品種Cerasonから調製されたGSEが、血液、血漿、肝臓、および腎臓カドミウムの影響にさらされたドブネズミの。
キーワード：ブドウ種子エキス; 抗酸化剤; カドミウム; ドブネズミ; 生化学的マーカー; 保護効果; 腎臓、腎臓
CISTANCHEは腎臓/腎機能を改善します
2.結果と考察
2.1。 ブドウ種子エキスの抗酸化活性と植物化学組成
半耐性品種セラソンから調製されたブドウ種子抽出物は、抗酸化活性、総ポリフェノール含有量、および選択された個々の抗酸化剤についてテストされました。 抗酸化活性は、異なる原理に基づく4つの方法（DPPH•、ABTS•plus、FRAP、FR）を使用して分光光度法で測定し、総ポリフェノール化合物はFolin-Ciocalteu法で測定しました。 使用した方法に応じて、抗酸化活性は7〜31 mg / g没食子酸当量（GAE）の範囲であり、総ポリフェノール含有量は9.3 mg / g GAEでした（表1）。 実験のこの部分の結果は、ブドウの種子に高い抗酸化能があることを示しています。
2.2。 ラットにおけるブドウ種子抽出物効果のinvivo測定
2.2.1。 血液、肝臓、腎臓のカドミウム含有量の測定カドミウムは飼料中の最も一般的な有毒金属です。 経口投与後、腸から吸収され、肝臓に輸送され、メタロチオネイン（MT）のチオール基に結合します。 これとは別に、Cdは血中のアルブミンや他のタンパク質にも結合する可能性があります[14]。 その後、Cdは体内に蓄積し、尿や糞便を介してゆっくりと体外に排泄され、生物学的半減期は約20年です。 カドミウムの最大量（約3分の1）は、肝臓皮質。 血液中のほとんどのカドミウム（約90パーセント）は赤血球に存在します。 それは広範囲の臓器に毒性があり、主な標的は腎臓、骨、および肺[15–17]。 GSEは、赤血球および腎臓、一方、肝臓でのその含有量は増加することが報告されています[14]。 この研究における血中カドミウム含有量の結果を図1Aに示します。 実験の開始時に、3.2 µg/kgのカドミウムが動物の血液中に検出されました。 実験中、14日後、GSEとカドミウムを添加したグループの平均カドミウム値は他のグループよりも有意に高かった（10.8 µg / kg、p=0。023）。 28日後、データの変動性が高すぎて統計的有意性を観察できませんでした。
実験の開始時に、実験動物の肝臓（図1B）でカドミウムは検出されませんでした。 したがって、実験中、対照群およびGSE群の動物の肝臓でカドミウムは検出されなかった。 一方、実験の14日後、カドミウムを添加したグループの平均カドミウム値は5.8 mg / kgであり、カドミウムとGSEを添加したグループの平均値は5.2 mg/kgでした。 これらの値は両方とも、対照群とは有意に異なっていました（カドミウムのみの群とカドミウムとGSEを含む群ではそれぞれp= 0。002とp= 0。018）。 28日後、カドミウムを添加したグループの平均値は6.7 mg / kgに増加しました。これは、カドミウムとGSEを添加したグループのカドミウムレベルとはわずかに異なり、4.8 mg/kgにわずかに減少しました。 （p=0。008）。
実験の開始時に、カドミウムは検出されませんでした腎臓（図1C）実験動物の。 したがって、カドミウムは検出されませんでした腎臓実験中の対照群およびGSE群からの動物の。 一方、14日後のカドミウム添加群の平均カドミウム値は9.5mg / kg、カドミウムとGSE添加群の平均値は6.5mg/kgでした。 これらの値は両方とも、対照群とは有意に異なっていました（両方の群でp <0。001）。 28日後、カドミウムを添加したグループの平均値は16.6="" mg="" kgに増加しました。これは、カドミウムとgseを添加したグループのカドミウムレベルとはわずかに増加し、10.4="" mg/kgにわずかに増加しました。="" kg（p="0。009）。">腎臓肝臓では、GSE投与によりCd含有量が大幅に低下しました。 GSEには、Cdをキレート化できるフェノール化合物が含まれているため、Cdの蓄積が減少します。 これらのキレートの形成は、おそらくタンパク質がCdに結合する能力の低下をもたらし、それにより体からより効果的に排除される可能性があります[18]。
2.2.2。 クレアチニンと尿素含有量の測定
のカドミウム蓄積に関して腎臓、肝臓は、Cd誘発毒性の最も重要な標的器官の1つです。 したがって、肝臓血漿中のマーカーであるクレアチニンと尿素が測定されました。 クレアチニンの測定は糸球体濾過の良い指標であり、主に腎臓病。 クレアチニン濃度と糸球体濾過の関係は双曲線です。 糸球体濾過が減少すると、クレアチニン分泌も減少します[19]。 重金属カドミウムの摂取量の増加は、腎臓の損傷、したがってクレアチニン分泌効率が低下します。 その結果、血中クレアチニンレベルの上昇は、腎臓障害[20]。
私たちの研究では、以前に発表された結果と一致して、クレアチニンのレベルはCdによって増加しました[21]。 実験開始時の実験動物の平均クレアチニン含有量値（図2A）は3。0 mg/Lでした。 カドミウムを投与されたグループでは、モニター値が5.1 mg / L（14日後、p= 0。015）および6.2 mg / L（28日後、 p <0。001）。 gseをカドミウムと同時投与したグループでは、このマーカーの増加は低く（14日後に4.2="" mg="" l、28日後に5.5="" mg="" l）、対照と比較した場合、28日後にのみ統計的に有意でした（="" p=""><0.001）。 したがって、クレアチニン濃度の増加は、gseの同時投与によって遅くなり、カドミウムによって引き起こされる毒性効果の減少を示唆しています。="">
尿素は、アミノ酸とタンパク質の最も重要な分解生成物です。 それは、アミノ酸代謝中の脱アミノ化反応によって放出されたアンモニアから肝臓で形成されます。 それは主に生物から排泄されます腎臓糸球体濾過および尿細管吸収による[22]。 の場合腎疾患、尿素生成の速度がそのクリアランスの速度を超え、その結果、血中尿素レベルが上昇します。 さらに、カドミウムはタンパク質へのアミノ酸の取り込みを阻害し、尿毒症を引き起こします[21]。 一方、肝機能が低下すると、尿素合成が低下し、血漿中の尿素濃度も低下します[20]。 したがって、血中尿素濃度は食事中のタンパク質含有量に依存します。腎臓排泄、および肝臓の代謝機能。
私たちの研究では、以前に発表された結果と一致して、尿素のレベルはCdによって増加しました[21]。 実験開始時の実験動物の平均尿素含有量値（図2B）は2 0 7mg/Lでした。 カドミウムを投与されたグループでは、モニター値が329 mg / L（14日後）および425 mg / L（28日後）に有意に増加しました。 GSEをカドミウムと同時投与したグループでは、このマーカーの増加はわずかに低く、14日後に325 mg / L、28日後に381 mg/Lでした。 GSEと一緒にカドミウムとカドミウムのみを投与されたグループは両方とも、実験の14日後（それぞれp=0.001とp= 0。002）と28日後（p <0.001）に対照グループと有意に異なっていました。両方のための）。>
2.2.3。 血漿抗酸化活性の測定
カドミウムは、主に酸化ストレスに関連するさまざまな効果を誘発します。 Cdはレドックス活性がないため、活性酸素種を直接生成しません。 それにもかかわらず、Cd曝露後のそれらの生成は多くの研究で報告されており、Cuypersらによってレビューされています。 [23]。 Cd曝露中のレドックス障害につながるメカニズムには、チオール基へのCdの親和性によって引き起こされる還元型グルタチオンの枯渇、タンパク質中のFeのCdによる置換が含まれ、レドックス活性遊離Feの濃度の増加、ミトコンドリア機能障害、およびスーパーオキシドラジカルの形成を触媒するNADPHオキシダーゼ[23]。 酸化ストレスの間、フェノール類のような抗酸化化合物は、安定したラジカル形態への変換を介して、新しい反応種の生成を停止させることができます。 したがって、フェノール類が豊富な植物抽出物は、CdまたはCd含有化合物に対する保護効果を提供することができます[24]。
この研究では、実験開始時の実験動物の平均血漿抗酸化活性値（図3）は0 .71mg/Lでした。 対照群と比較して、すべての実験群でわずかな増加が観察された。 しかし、唯一の重要な違いは、28日後のGSE治療群と対照群の違いであり（p=0。012）、血漿抗酸化活性に対するGSEの正の効果が確認されました。 以前に報告された結果はあいまいです。 GSEによって引き起こされる血漿抗酸化能の増加が見られることもあり[25]、見られないこともありました[14]。
2.2.4。 ALTおよびAST活動の決定
酸化ストレスは、脂質過酸化の増加によって引き起こされる膜構造の機能的完全性の喪失に関連しています。 次に、細胞質膜の透過性の増加は、血液への肝マーカー酵素（ALTおよびAST）の漏出につながります[14]。 確かに、ALTとASTは、中毒による限られた肝臓の損傷でも診断的に重要であり、カドミウムによって引き起こされる血清の増加は以前に報告されており[14]、この研究によって確認されました。 実験開始時の実験動物の平均ALT活性値（図4A）は0 .84 µkat/Lでした。 カドミウムを投与されたグループでは、モニター値の有意な増加が14日後に平均1.52 µkat / L（p <0。001）、28日後に1.87 µkat="" l（p="" {{="" 13}}。004）。="" gseをカドミウムと同時投与したグループでは、このマーカーの増加はカドミウムのみを投与したグループよりも有意に遅かった（14日後に1.23="" µkat="" l、28日後に1.92="" µkat="" l）。="" 実験の14日後、このグループは対照グループ（p="0。009）とカドミウムグループ（p=0。026）の両方とは異なりましたが、28日後は大幅に異なりました。コントロールグループからのみ（p=0。003）。" gseのみを投与されたグループでは、値も14日後に1.17="" µkat/lに増加しました。="" この値は対照群とは有意に異なり（p="0。024）、GSEとカドミウムの両方を投与された群の値と同等でした。">
実験開始時の実験動物の平均AST含有量値（図4B）は2.07 µkat/Lでした。 カドミウムを投与されたグループでは、観察値の統計的に有意な増加は、実験の28日後にのみ記録されました（3.52 µkat / L、p=0。001）。 驚いたことに、GSEをカドミウムと同時投与したグループでは、このマーカーの増加は14日後と28日後の両方で対照グループとはより速く有意に異なっていました（それぞれ2.67および2.84 µkat / L、p {{15 }}。043）、ただし、28日後の値はカドミウムのみのグループの値よりわずかに低かった。 GSEのみのバリアントは通常の値でした。
私たちの実験では、GSE投与はALT活性の増加を遅らせることができました。 この効果は、以前に報告された結果[14]に対応し、フェノール化合物からフリーラジカル含有過酸化物への水素移動を介して過酸化脂質を除去することによって引き起こされる可能性があります。 一方、長期的には、この効果は低かった。 カドミウムによって引き起こされるAST活性の増加は、GSE投与によってかなり加速されました。 しかし、長期的には、AST活性がわずかに低下しました。 したがって、GSEは細胞膜に対するCdの毒性作用を部分的に補償することができます。
2.2.5。 肝臓におけるSODおよびCAT活性の測定
カドミウムは、酸化反応に直接関与することに加えて、SODやCATなどの抗酸化酵素、それぞれスーパーオキシドラジカルと過酸化水素を無害化できる酵素の活性を阻害します[14]。 SODは、スーパーオキシドラジカルを効果的にクエンチし、それを毒性の低い過酸化水素に変換する酵素であり、カタラーゼまたはペルオキシダーゼによってさらに分解される可能性があります[26]。 CATは、酸素にさらされているほとんどすべての生物に見られる酵素です。 過酸化水素を水と酸素に分解するための触媒として機能します[27]。 酵素の中で最も高い変換数の1つであり[28]、抗酸化酵素として、人体のバランスを維持するための保護メカニズムの1つです[29]。 Cdが誘導する酵素活性の低下のメカニズムは、おそらくCdが酵素の活性部位に直接結合することです[30]。
この研究では、SODおよびCAT活性の低下も観察されました。 実験の開始時、実験動物の肝臓における平均SOD酵素活性（図5A）は18.4 U/mgタンパク質でした。 実験の14日後、SOD活性は、カドミウム投与群の両方よりもGSE投与群（21.1 U / mg）で有意に高かった（p<0。001およびp{{ 9}}。009カドミウムのみおよびgseグループを含むカドミウム）が、カドミウムのみを投与されたグループでのみ、sod活性は対照グループよりも有意に低かった（16.7u="" mg）（p="0" .005）。="" 実験の28日後、両方のカドミウム受容群は両方の対照群と有意に異なっていました（16.4="" u="" mg、p="0。002および17.6U" mg、p=""><0.001およびp=>
実験の開始時、肝臓の平均CAT酵素活性（図5B）は32.7 U/mgタンパク質でした。 実験の14日後、CAT活性は、GSEを投与されたグループ（33.5 U / mg）の方が、カドミウムを投与されたグループの両方よりも有意に高かった（p= 0。002およびp= 0。031カドミウムのみおよびGSEグループを含むカドミウム）が、カドミウムのみを投与されたグループでのみ、CAT活性は対照グループよりも有意に低かった（23.8U / mg）（p=0。005）。 しかし、28日後、カドミウムと一緒にGSEを投与されたグループのCAT活性は、さらに27.1 U / mgに減少し、カドミウムのみのグループの値（25.8 U / mg）に達し、対照グループとは有意に異なりました（p { {21}}。033）。 GSEで処理されたグループは、両方のカドミウムグループとのみ有意に異なっていました（カドミウムのみおよびGSEを含むカドミウムについてはそれぞれp= 0。026およびp= 0。012）。 興味深いことに、カドミウムによって引き起こされた減少は、GSEの同時投与によって遅くなりました。 CATの場合、GSEのこれらの影響は以前に観察されています[14]。 GSEに含まれるフェノール化合物のキレート効果は、カドミウムが酵素の活性部位に結合する能力を低下させる可能性があります。
2.2.6。 MTコンテンツの決定
カドミウムは直接的な代謝変換の影響を受けませんが、すべての組織で、主にメタロチオネイン（MT）に結合しています。 MTは、分子量6〜10 kDaの細胞内、低分子量、システインリッチタンパク質のグループに属しています。 生物におけるMTの主な役割には、亜鉛の恒常性の維持、重金属の解毒、および酸化ストレスからの保護が含まれます。 MTの発現は、紫外線、重金属、ストレスホルモン、遊離酸素ラジカル、炎症のメディエーター、感染、外傷、発癌など、多くの外因性および内因性の要因によって誘発されます[31,32]。 MTは主に肝臓で合成され、肝臓そして血中に放出されました。 MTは、その排泄を低下させることによって組織内のカドミウムの蓄積に関与していますが、MTは急性および慢性のCd誘発毒性から保護します[33]。 私たちの研究では、MT含有量は血液、肝臓、および肝臓。
実験開始時の実験動物の血中平均MT含有量（図6A）は23.9 nmol/gでした。 14日後、変化は最小限であり、28日後、複製間の大きな変動が観察され、統計的な不確定性を引き起こしました（p=0。948）。 の平均MTコンテンツ値腎臓（図6B）実験開始時の実験動物の21.46 nmol/gでした。 実験中、どの実験グループでも値は有意に変化しませんでした（p=0 .938）。 実験開始時の実験動物の肝臓における平均MT含有量（図6C）は17.15 nmol/gでした。 14日後、MT含有量はすべての実験群でわずかに増加し、対照群との差はCdのみの群とGSEのみの群で有意でした（p= 0。008およびp= 0それぞれ.046）。 28日後、GSEグループのMT含有量は対照グループの値に戻りましたが、CdグループのMT含有量は増加したままであり、対照群とGSEグループの両方とは異なりました（p= 0。046およびp=0。035、それぞれ）。 カドミウムと一緒にGSEを投与されたグループでは、MT含有量は、Cdのみのグループと比較した場合、コントロールと有意差はありませんでした。実験の28日）。
全体として、Cdによって引き起こされるMT含有量の統計的に有意な変化は、肝臓でのみ観察されました。 以前に、カドミウムを投与された実験動物の血中MTの増加が報告されました[34]。 この場合、結果は、MTを介したCdの解毒がむしろ肝臓で起こる可能性があることを示唆しています。
3.材料と方法
3.1。 実験計画Wistar属のドブネズミ（8週齢、235±3 g）は、6個体の4つのグループに分けられました。A）通常の食餌を与えたラットの対照グループ（n=6）。 B）食餌GSEが追加されたラットのグループ（2 0 0 mg GSE /日）（n=6）; C）カドミウムを投与されたグループ（2 mg Cd /日-具体的には、CdCl2を水に溶解）（n=6）; D）GSEが添加されたカドミウム（2 mg Cd /日）（200 mg GSE /日）を含む食事を与えられたグループ（n=6）。 抽出物は、セラソンブドウ品種の種子から採取されました。 その準備と特性評価はセクション3.2で説明されています。 （ブドウ種子エキス）。 実験用ドブネズミに投与する前に、抽出物を毎日200 mgの用量で秤量した（各ラットに200 mg GSE、体重0.85 g / L kg）。 GSEは水で投与されました。 ラットに湿った飼料混合物と無害な（乳児）水を自由に与えた。 週に一度、動物は寝具を交換しました。 実験の14日後および28日後、各グループの3匹の動物を安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取しました。 採取前に、腹腔内投与にフラキシパリン（0.01 mL / kg）を割り当て、その後、吸入麻酔下で動物にジエチルエーテルを投与しました。 次に、血液サンプルをヘパリンでコーティングされたマイクロテストチューブ（またはEDTAを備えたチューブ-MTおよびカドミウムの分析用。その後の遠心分離なし）に収集し、続いて穏やかな遠心分離（800 g / 10分）および血液の収集を行いました。さらなる分析のための血漿。 肝臓と右肝臓さらなる分析のために抽出されました。 研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、プロトコルはブルノのメンデル大学の実験動物の福祉を確保するための専門家委員会によって承認されました（プロジェクトIGA-ZF / 2016- AP011の場合）。
3.2。 ブドウ種子エキス
ブドウの種子（セラソン品種-メルロー×セイベル13 666）を選別、洗浄、乾燥、粉砕しました。 選別は分離機のマークを介して行われ、そこで種子が皮から分離されました。 このように分離された種子は、その後、すすがれ、空の種子が除去され、残りの種子が洗浄された。 洗浄および洗浄された種子は、50°Cの乾燥機で12時間乾燥されました。 その後、IKA MF 10ベーシックラボグラインダー（IKA Werke、シュタウフェンイムブライスガウ、ドイツ）を使用してシードを粉砕しました。 粉砕した種子を75％エタノールで120時間抽出しました（22°C、50 RPMで振とう、IKA KS 260 Basic、メーカー：IKA Werke、シュタウフェンイムブライスガウ、ドイツ）粉砕した種子の1部と10部の比率で抽出しました。エタノールの（m / m）。 この後、抽出物を25 mLの試験管（エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）に入れ、4°CおよびRCF 25、000×gで遠心分離（Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich、Westphalia、Germany）しました。 遠心分離したサンプルを試験管から取り出し、真空蒸発器蒸留フラスコ（IKARV10デジタルVC;IKAWerke、シュタウフェンイムブライスガウ、ドイツ）に移し、そこでエタノールを蒸発させました。 蒸発は90°Cの真空で行われ、抽出物はペトリ皿に移され、53°Cの真空で凍結乾燥されました（Heto PowerDry PL3000凍結乾燥機;Trigon-plus、Cestlice、チェコ共和国）。 調製された後、抽出物は実験動物に投与された。
CISTANCHEは腎臓/腎感染症を改善します
3.3。 抗酸化活性と総ポリフェノール含有量の決定
結果の客観性を確保するために、4つの根本的に異なる方法を使用して抗酸化活性を決定しました。 サンプルは、BS -400自動分光光度計（Mindray、深セン、中国）で分析されました。 すべてのサンプルは3回分析され、結果の値はこれらの測定値の平均に対応します。 これらの分析は、Sochoretal。に従って実施されました。 [35]。
3.3.1。 ABTS法を使用した抗酸化活性の測定
ABTSアッセイによって抗酸化活性を測定するための溶液は、2つの溶液を混合することによって調製されました。 溶液2：蒸留水5mLあたりm= 1。67mgを秤量して調製した過硫酸カリウムの4.95mM溶液。 得られた溶液を蒸留水で1:10に希釈し、暗所および冷所に12時間放置した。 次に、150 µLの試薬R1（7 mMABTSおよび4.95mM過硫酸カリウム）をピペットでプラスチックキュベットに入れ、続いて3 µLのサンプルを添加し、分光光度計（λ= 660 nm）で12分間測定しました。分。 検量線によると、吸光度は没食子酸の同等の含有量に変換されました。 抗酸化活性は、標準として没食子酸（10〜200 mg・L1）を使用して検量線から計算され、結果は没食子酸当量として表されました。
3.3.2。 DPPH法を使用した抗酸化活性の測定
まず、m{{0}}。35mgのラジカルDPPHを秤量しました。 この量を250mLメスフラスコに移し、メタノールで構成しました。 次に、150 µLの試薬R1（0.095 mM DPPH）をピペットでプラスチックキュベットに入れ、続いて15 µLの測定サンプルを添加しました。 DPPHテストは、安定したフリーラジカル2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルが水素供与体と反応する能力に基づいています。 DPPHは、紫外可視分光法（UV-VIS）スペクトルで強い吸収を示します。 吸光度は、λ= 505nmで12分間測定されました。 検量線に従って、吸光度を同等の没食子酸含有量に変換しました。
3.3.3。 鉄還元抗酸化力法を使用した抗酸化活性の決定
3つの溶液を使用して、鉄還元抗酸化力（FRAP）法を使用して抗酸化活性を測定しました。（1）TPTZ溶液：1 0 mM TPTZ（m=78 .02 mg）を25mLに溶解40 mM HCl; （2）FeCl3溶液：25mLの蒸留水に溶解した20mM FeCl3（m= 135。13mg）。 （3）酢酸緩衝液：0.02M酢酸緩衝液pH3.6（m=775mg酢酸ナトリウムを250mLの蒸留水に溶解し、酢酸でpHを調整）。 3つの溶液を1：1：10の比率で混合しました（TPTZ：FeCl3：酢酸緩衝液）。 次に、150 µLの試薬をピペットでプラスチックキュベットに入れ、3 µLのサンプルを加えました。 吸光度は、λ= 605nmで12分間測定されました。 抗酸化活性は、標準として没食子酸（10〜200mg・L1）を使用して検量線から計算されました。 結果は没食子酸当量として表された。
3.3.4。 クロロフィリンフリーラジカル法を用いた抗酸化活性の測定
合計200 µLの試薬R1（0.1 M HCl、クロロフィル抽出物、反応バッファー、触媒）をプラスチックキュベットにピペットで入れ、8 µLのサンプルを添加しました。 この方法は、クロロフィリン（クロロフィルのナトリウム-銅塩）の能力を利用して、吸収の最大値を安定して変化させながら、電子を受け入れて供与します。 このプロセスは、アルカリ性環境と触媒の添加によって調整されます。 吸光度は、λ= 450nmで12分間測定されました。 最後の測定値が計算に使用されました。 結果は没食子酸当量として表された。
3.3.5。 総ポリフェノール濃度の決定
フォリン-チオカルト法を使用して、総ポリフェノール化合物を測定しました。 すべてのサンプルを3回分析し、結果の値をこれらの測定値の平均として取得しました。 40 µLのサンプルをピペットでキュベット（3 mL）に入れ、1960 µLの蒸留水で希釈しました。 続いて、50 µLのFolin–Ciocalteu試薬をキュベットに添加しました。 混合物を完全に振とうし、3分後、300μLの20パーセントNa2CO3十水和物溶液を加えた。 反応混合物を振とうし、22℃で120分間インキュベートしました。 この後、ブランクに対してλ= 750 nmで吸光度（SPECORD 210; Carl-Zeiss、イエナ、ドイツ）を測定しました。 結果は没食子酸当量として表された。
3.4。 HPLCによる酸化防止剤の測定
質量分析計を備えた高速液体クロマトグラフィーを使用した個々の抗酸化成分の測定。 フラボノイドとプロアントシアニンの推定に使用されるサンプルの分析は、Agilent Technologies 12 {{1 0}} 0（Jet Stream Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）のクロマトグラフィーシステムで実行されました。次のデバイス：移動相リザーバー、デガッサ、バイナリポンプ、オートサンプラー付きサンプルリザーバー、Agilent6460トリプル四重極LC/MS（Jet Stream Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）を備えた質量検出器。 サンプルの分離は、寸法が50×2.1 mm、粒子サイズが2.7 µmのZorbaxSBC18クロマトグラフィーカラムで行いました。 分析期間は常に6分でした。 キャリアガスのフェローレートは0.6mL・min1でした。 移動相の有機成分はメタノールグラジエントグレード（溶媒B）で、水性成分には0.05 Mのギ酸アンモニウム（溶媒A）が含まれていました。 移動相のグラジエントは次のとおりです。時間0分：溶媒Aの50％と溶媒Bの50％。 時間2.5分：溶媒Aの100パーセントと溶媒Bの0パーセント。 時間5分：溶媒Aの50％と溶媒Bの50％。カラムサーモスタットの温度を45°Cに調整しました。
CISTANCHEは腎臓/腎臓の痛みを改善します
3.5。 選択された生化学的マーカーの決定
血液、血漿、肝臓、および肝臓カドミウムの悪影響に対するGSEの保護効果を決定するために、動物のうちの1匹をモニターした。 以下の分析を行った：（1）血漿分析：総血漿抗酸化活性、クレアチニン、尿素、ALT、AST。 （2）血液分析：MT。 （3）肝臓分析：SOD、CAT、MT。 （4）肝臓分析：MT。
3.5.1。 総血漿抗酸化活性の決定、クレアチニン、尿素、ALT、およびAST A BS {{0}}自動生化学分析装置（Mindray、深セン、中国）を使用して、血漿、クレアチニン、尿素、ALT、およびASTの総抗酸化活性を分析しました。 血漿の総抗酸化活性の測定フリーラジカル法を使用して、血漿の抗酸化活性を測定しました[35]。 この方法は、クロロフィリン（クロロフィルのナトリウム-銅塩）の能力を利用して、吸収の最大値を安定して変化させながら、電子を受け入れて供与します。 このプロセスは、アルカリ性環境と触媒の添加によって調整されます。 合計200µLの試薬R1（0.1 M HCl、クロロフィリン抽出物、反応バッファー、および触媒）をピペットでプラスチックキュベットに入れ、その後8 µLのサンプルを添加しました。 吸光度をλ= 450nmで12分間測定し、最後の測定値を計算に使用しました。 標準として没食子酸を使用して検量線から抗酸化活性を計算し、結果を没食子酸当量として表した。
クレアチニン含有量の測定この方法の原理は、クレアチニンとアルカリ性ピクリン酸の色の複合体の測光測定であり、その形成速度はサンプル中のクレアチニンの濃度に比例します。 クレアチニンを測定するために、Greiner（Greiner GmbH、Pleidelsheim、Germany）の診断キットを使用しました。 合計180µLの試薬R1（0.16 mM水酸化ナトリウム）をキュベットにピペットで入れ、続いて10 µLのサンプルと30 µLの試薬R2（4 mMピクリン酸）を添加しました。 吸光度をλ= 505nmで6分間測定しました。 試薬R1のみとサンプルの吸光度値、および試薬R2と6分間インキュベートした後の吸光度値を計算に使用しました。
アラニンアミノトランスフェラーゼの測定ALTを決定するために、Greiner（Greiner GmbH、Pleidelsheim、Germany）の診断キットを使用しました。 まず、15 0 µLの試薬R1（100mMTrisバッファーpH7.5;500 mM L-アラニン、1200 U / L乳酸デヒドロゲナーゼ）と15 µLの血漿サンプルを自動的にピペットでキュベットに入れました。 続いて、30 µLの試薬R2（15 mM 2-オキソグルタル酸、0.18 mM NADH）を自動的にピペットで移し、混合物を5分間インキュベートしました。 吸光度はλ= 340nmで測定されました。 試薬R1のみのサンプルとの吸光度値、およびサンプルとの5分間のインキュベーション後の吸光度値を計算に使用しました。 結果は、検量線に従ってµkat/L単位の酵素活性に変換されました。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの測定ASTを決定するために、Greiner（Greiner GmbH、Pleidelsheim、Germany）の診断キットを使用しました。 まず、15 0 µLの試薬R1（80 mMTrisバッファーpH7.8、240 mM L-アスパラギン酸、1200 U / Lリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）および15 µLの実験動物の血漿サンプルをキュベットに自動的にピペットで移しました。 続いて、混合とインキュベーションを37℃で270秒間行った。 次に、30 µLのR2試薬（15 mM 2-オキソグルタル酸、0.18 mM NADH）を自動的にピペットで移し、混合物を5分間インキュベートしました。 吸光度はλ= 340nmで測定されました。 試薬R1のみのサンプルとの吸光度値、およびサンプルとの5分間のインキュベーション後の吸光度値を計算に使用しました。 結果は、検量線に従ってµkat/L単位の酵素活性に変換されました。
尿素の測定次の手順を使用して尿素を測定しました。200µLの試薬R1（TrisバッファーpH 7.8、ADP、ウレアーゼ、およびGLDH）と200 µLの試薬R2（2-オキソグルタレート、NADH）を自動的にピペットでキュベットに入れました。続いて容量4µLのサンプルを混合した後、混合物を混合し、37°Cで30秒間インキュベートしました。 続いて、λ= 340 nmでの吸光度を測定し、さらに60秒後に吸光度を再度測定しました。 30秒後およびさらに60秒後の吸光度値を計算に使用しました。 値を相互に差し引き、その結果を検量線に従って尿素含有量に変換しました。
ビウレット法を使用した総タンパク質の測定ビウレット法による総タンパク質の測定については、別の出版物[9]に詳しく説明されています。 合計180µLのビウレット試薬（15 mM酒石酸カリウムナトリウム、100 mM NaI、5 mM KI、および5 mM CuSO4）をピペットでキュベットに入れ、続いて45 µLのサンプルを入れました。 37°Cで10分間インキュベートした後、波長λ= 546nmでの吸光度を測定しました。 ここでの原理は、アルカリ性環境でのペプチド結合とCu（II）の反応であり、青紫色を形成します。 試薬のみの吸光度値とサンプルとの10分間のインキュベーション後の吸光度値を計算に使用しました。
3.5.2。 スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ（CAT）の測定SOD活性の測定、市販のキット（19160 SOD、Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して、SOD活性（SOD、EC 1.15.1.1）を決定しました。 測定は、BS 400自動分析装置（Mindray、深セン、中国）のプラスチックキュベットで実行されました。 まず、200 µLの試薬R1（20×バッファー希釈WST溶液）をピペットでキュベットに入れ、試薬を37°Cで108秒間（1分、48秒間）インキュベートしました。 次に、20 µLのサンプルをピペットで取り、378秒（6分18秒）で、20 µLの試薬R2（167×バッファー希釈酵素溶液）を添加して反応を開始しました。 混合物を72秒間（1分、12秒間）インキュベートした後、λ= 450nmで吸光度を測定しました。 反応速度を180秒（3分）測定し、9秒ごとに吸光度を読み取った。 機器は、キャリブレーション式に従って、1分あたりの吸光度の平均増加（ΔA）と測定サンプルのSOD活性を計算しました。 結果はU/mLで表され、続いてタンパク質のmgに変換されました。
3.5.3。 メタロチオネイン含有量の測定血液、肝臓、および腎臓ドブネズミの分析は、示差パルスボルタンメトリー（DPV）を備えた吸着伝達ストリッピング技術（AdTS）を使用して実行されました。 分析のために、分析された上澄みの2 0 0 µLを採取し、測定容器内で1 800 µLのBrdiˇcka試薬と混合した後、電気化学的測定自体を実行しました。 アッセイは、以前に記載されたプロトコル[37]に従って実施された。 従来の3電極接続が使用されました。 作用電極は、液滴面積が0。4 mm2のつり下げ水銀滴電極（HMDE）であり、参照電極はAg / AgCl / 3 M KClであり、補助電極は白金電極でした。 塩基電解質（1 mmol・L1 [CO（NH3）6]Cl3および1mol・L1のアンモニウム緩衝液; NH3（aq）とNH4Cl、pH 9.6）を測定サンプルごとに交換しました。 DPVパラメータは次のとおりです。初期電位0。7V、最終電位1.75 V、バブリング5秒、堆積時間24 0秒、変調時間0。0 5秒、インターバル時間0.25秒、電位ステップ0.00105 V、スキャンレート0.0042 V / s、変調振幅0.02505V。MT測定は、VAスタンド693測定ユニットに接続され制御された695オートサンプラーで構成される測定デバイスで実行されました。 693 VA TraceAnalyserコントロールユニット（すべてMetrohm、Herisau、Switzerland）による。 Julabo F25（Julabo、Seelbach、Germany）を使用して、測定システム全体を4°Cに冷却しました。 得られたボルタモグラムをVAデータベース2.2プログラム（Metrohm、Herisau、Switzerland）にエクスポートし、分析されたサンプルを99.999パーセントの純度のアルゴンの活発なバブリングによって脱酸素化しました。
3.5.4。 サンプルの血液、肝臓、および腎臓の分解におけるカドミウム含有量の測定 Ethos Oneマイクロ波抽出器（Milestone、ソリーゾレ、イタリア）を肝臓の分解に使用し、肝臓血液サンプルの分解には、Multiwave 3 0 00 Microwave Extractor（Anton Paar Graz、オーストリア）を使用しました。 鉱化作用は、65％硝酸（HNO3超純）（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）と30％過酸化水素（H2O2超純）（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して湿式で行われました。肝臓または肝臓サンプルを一連のTeflflonコンテナに量り取り、5 mLの65パーセントHNO3、3mLの30パーセントH2O2、および2mLのMilliQH2Oをサンプルに追加しました。 容器を閉じ、製造元の指示に従って機器を始動しました。 マイクロ波分解は210°Cで40分間続きました。 その後、サンプルを45分間冷却し、PEコンテナに4°Cで保管しました。 合計0.01gの血液サンプルを一連のガラス容器に量り取り、300 µLの65パーセントHNO3と200 µLの30パーセントH2O2をサンプルに添加しました。 容器を閉じ、製造元の指示に従って機器を始動しました。 マイクロ波分解は140℃の温度で40分間続きました。 その後、サンプルを45分間冷却し、AASで測定するまで4°Cで保存しました。
原子吸光分析によるカドミウムの定量カドミウムは、Agilent 280/240シリーズAAシステムデバイス（Agilent Technologies）で測定されました。 肝臓と肝臓サンプルはアセチレン-空気炎（Fa AAS）で分析され、血液サンプルは228.8 nmの波長で電熱噴霧（ETA AAS）によって分析されました。 ETAAASでの分析の場合は0–2 0 µg・L、FaAASの場合は0– 10 mg・L1の濃度のキャリブレーションシリーズを、カドミウムの標準溶液（Analytika Praha、 Prag、チェコ共和国）、濃度1。000±0.002g・L1。 これに続いて、一連のキャリブレーションソリューションの測定と検量線の作成が行われ、その後、血液、肝臓、および肝臓サンプルを測定しました。
3.6。 統計分析すべての測定は3回行った。 外れ値はGrubbsテストで識別され、除外されました（合計で2つの外れ値が見つかりました）。 統計分析の前に、データは対数変換によって変換され、Tukey HSD事後検定を使用した一元配置分散分析（各時点で個別）によって分析されました。 統計的有意性のしきい値は、p<>
4.結論
さまざまな病気からの保護に役立つ物質である植物の二次代謝産物の中から新薬を探すという最近の製薬および経済の傾向があります。 ブドウの種子がマトリックスに含む重要な生物学的に活性な成分のおかげで、それらは医療目的で使用することができます（そしてすでに使用されています）。 ブドウ種子抽出物は、有毒な重金属カドミウムによって引き起こされる酸化ストレス関連の損傷から組織を保護することが知られています。 この保護は、おそらく使用されたブドウの種子のフェノール組成に影響されます。 この研究では、フェノール含有量がかなり高い半耐性品種Cerasonから調製されたブドウ種子抽出物について、カドミウムによる変化に対する保護効果をテストしました。 研究されたGSEは、単独で投与された場合に血漿抗酸化活性を増加させ、肝臓のカドミウム含有量を低下させ、腎臓同時投与されたときのラットの。 したがって、肝マーカー酵素ALTおよび肝臓カドミウムによって引き起こされたマーカークレアチニンはGSEによって減速されました。 さらに、カドミウムによって引き起こされる抗酸化酵素SODおよびCATの活性の低下は、GSEの同時投与によって遅くなりました。 これらの結果は、GSEが重金属の影響に対する強力な保護剤であることを示しています。
