タイトルのより簡潔なバージョンは次のとおりです: 近赤外分光法によるカンカ尿細管の 6 成分の同時測定
Sep 18, 2024
1。導入
キスタンケ（Cistanche、Hoffmg. Et Link）は、Orobanchaceae 科の植物の多年生ファネロガミック属です。カンカ属に属するほとんどの種は、中国で何千年もの間薬用植物として使用されてきました。優れた強壮剤としての評判を持っています。 「砂漠の高麗人参」として知られています。 Cistanche tubulosa は、多年生植物の Tamarix chinensis の根に絶対寄生する寄生虫です。それは中国薬局方に本物の情報源として記載されています。カンサス・ヘルバ（中国名：ロウコンロン）2005年版より。カンカ種に関する現代の薬理学的研究は 1980 年代に始まりました。薬理学的研究により、カンカ植物の抽出物には、腎臓欠乏症や老人性便秘の治療、学習および記憶能力の向上、抗アルツハイマー病、免疫力の強化、老化防止、抗疲労などの幅広い作用があることが示されました。過去 30 年間、包括的かつ体系的な薬理学的研究が植物化学的研究と組み合わされて、カンクサ属植物の根の有益な効果の物質的根拠が解明されてきました。これらの調査は、フェニルエタノイド配糖体 (PhG) が、腎不全、インポテンス、老化防止、抗アルツハイマー病の治療において重要な役割を果たしているカンカ植物の主な有効成分であることを示しています。中国薬局方では 2 つの PhG (エキナコシドとベルバスコシド) の含有量が必要とされていました。一方、カンカ属の植物に含まれるマンニトール、スクロース、グルコース、フルクトースなどの炭水化物は、下剤機能と炭水化物クラスターを持っています。カンカンクの植物便秘の治療に使用されてきました。
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C. tubulosa の野生資源は主に中国の新疆自治区南部のタクラマカン砂漠周辺地域に分布しています。伝統的な漢方薬 (TCM) として使用される他の多くの種と同様に、C. tubulosa は非常に経済的価値があり、野生の生息地では過剰採取によりほぼ絶滅しています。 C. tubulosa の栽培は、Cistances Herba の原料供給を確保し、野生植物資源を保護するために、1990 年代に中国で始まりました。 2017年の時点で、新疆のホータン県には約1万3千ヘクタールのC. tubulosaが栽培されている。 C. tubulosa の栽培拡大と品質の向上のためには、植栽技術の進歩が求められています。
C. tubulosa を栽培する主な目的は、これらの有効成分が豊富に含まれる Cistanches Herba を生産することです。ただし、有効成分の含有量は、カンサス・ヘルバPhG やオリゴ糖などは、製造中に多くの要因によって大きな影響を受ける可能性があります。 C. tubulosa の品質をリアルタイムで検出するシステムを研究する必要があります。したがって、短期間で大量のサンプルを分析するという要件を満たす高スループットな方法を開発する必要があります。従来、C. tubulosa の PhG や炭水化物などの主要な有効成分の測定は、通常、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用して行われていました。正確で信頼性がありますが、データの収集と処理には時間と労力がかかります。また、HPLCアッセイでは通常、粉砕、抽出、ろ過などのサンプル調製にも多大な時間と労力を要します。したがって、比較的大量のデータを取得するには、明確な原理と操作が簡単なツールが必要です。幸いなことに、近赤外分光法 (NIRS) は非破壊で迅速であるため、農産物、食品、医療サンプル、医薬品の評価に広く使用されています。したがって、NIRS は TCM の効率的な測定の要件に正確に一致する可能性があり、当然のことながら、NIRS は TCM 中の化合物の定性的同定と定量化に適用されています。
今回の研究では、以下の6つの有効成分の含有量を調べました。エキナコシド、ベルバスコシド、マンニトール、スクロース、グルコース、フルクトース2013 年から 2015 年に新疆のホータン県から収集された 116 バッチの C. tubulosa サンプル中の C. tubulosa が、HPLC によって初めて測定されました。その後、これら 6 つのコンポーネントの校正モデルが部分最小二乗回帰 (PLSR) 法を使用して確立されました。これらのモデルは、キャリブレーション セットの相関係数と予測誤差を使用して検証されました。結果は、開発した方法が C. tubulosa の定量分析の信頼できる方法として使用できることを示しました。
2. 結果
2.1. HPLC分析
の内容エキナコシドとベルバスコシド116 サンプルすべてについて、文献で明確に定義された HPLC-UV 法によって測定され、4 つの炭水化物 (マンニトール、スクロース、グルコース、およびフルクトース) は文献で明確に定義された HPLC-ELSD 法によって測定されました。サンプルの調製と測定方法はセクション 3.1 と 3.3 で説明しました。図 1 は、混合標準の特徴的なクロマトグラムを示しています。 6 つの有効成分すべてがベースラインで分離されているため、定量化できることがわかります。 HPLC メソッドはサンプルテストの前に検証されました。 HPLC 法の主な結果を表 1 に示します。エキナコシド測定法の良好な直線関係 (r=0.9998) と回収率 (98.5%) が結果に示されており、5 つすべての結果と同じです。コンポーネント。したがって、６つの有効成分の含有量を正確に把握することができる。決定されたすべての含有量範囲を表 1 にまとめます。
2.2. NIRS分析
図 2 は、C. tubulosa サンプルの NIR スペクトル (4000-10,000 cm-1 ) を示しています。すべてのサンプルで顕著な吸収ピークが 4000 cm-1 から 7500 cm-1 に現れましたが、穏やかな変動は 7500 cm-1 から 10,000 cm-1 に現れました。 NIR スペクトルのベースラインドリフトは、サンプルが粒子サイズや色などの要因の影響を受けやすいために発生しました (図 2A)。スペクトルの数学的前処理を使用して、不必要な情報の影響をある程度軽減しました。数学的前処理には、一次導出 (1 次導出)、二次導出 (2 次導出)、標準正規多様体 (SNV)、および乗法散乱補正 (MSC) が含まれます。図 2B は C. tubulosa の NIR スペクトルの 2 次導出を示しており、4000 ～ 4500 cm-1、5000 ～ 5500 cm-1、7000 ～ 7500 cm-1 の 3 つの領域で発生した顕著な変動が観察されます。
2.3.定量的校正モデルの確立
部分最小二乗回帰 (PLSR) は古典的なモデリング手法であり、結果の品質が高いため、定量的モデルに広く適用されています。 PLSR の利点には、優れた予測能力と比較的簡単な点が含まれます。 PLSR は、TCM の定量的校正モデルの確立にも広く適用されています [25]。前処理した近赤外スペクトルに基づいて、HPLC 分析データを真の値として PLSR 法を使用して、C. tubulosa の 6 つの有効成分の近赤外定量分析モデルを確立しました。 116 個のサンプルは、3:1 の比率でキャリブレーション セットと検証セットにランダムに分割されました。キャリブレーションに最適な条件は、低い RMSEC と高い相関係数によって選択されました。
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2.3.1.校正モデルの波長帯の選択
適切な波長帯域の選択は、校正モデル構築の重要なステップでした。この研究では、4000-7500 cm-1 (TQ アナリスト ソフトウェアによって推奨) と 4000-10,000 cm-1 の NIR 間隔スペクトルが比較されました。表 2 から、この範囲は 4000 cm-1 と 7500 cm-1 の間の間隔での校正には不適切であることが観察されました。 したがって、現在の研究では、6 つの化学成分のスペクトル間隔はすべて、次の間隔から選択されました。 RMSEC の性能と相関係数を比較すると、4000 ～ 10,000 cm-1 が得られます。
2.3.2.校正モデルの最適な因子数の選択
PLSR は、係数の計算によってスペクトル データの次元を削減することにより、データの変動の最大量を説明します。 「過小適合」問題は、限られた数の要因から生じる不十分な情報によって発生しました。ただし、モデルに導入された最適値よりも大きい係数を選択すると、「過剰適合」問題が発生します。 「過小適合」または「過適合」のいずれかによって、確立されたモデルの予測能力が低下します [22]。図 3 は、RMSECV と 6 つの化合物すべての係数の関係を示しています。したがって、RMSECV の最低値に対応する係数を選択しました。キャリブレーション モデルの係数の最適な選択を表 3 に示します。
2.3.3.校正モデルのスペクトル前処理の選択
キャリブレーション モデルにとってもう 1 つの重要な影響要因は、散乱とベースライン ドリフトの影響を軽減し、信号対雑音比を高め、不規則な変動を除去することを目的としたスペクトル前処理です。放射線散乱の影響を排除するために、乗法散乱補正 (MSC) および標準正規変量 (SNV) 法が使用されました。ベースラインドリフトの影響を解決するために、1 次微分スペクトルと 2 次微分スペクトルが比較され、2 次微分スペクトルが選択されました。望ましい効果を得るために、ノイズの拡大を防ぐために、導出前に Savitzky-Golay (SG) フィルター アルゴリズムを使用してスペクトルを平滑化しました。表 3 は、スペクトル前処理に関する情報と、校正モデルのその結果を示しています。
2.4.確立されたモデルの評価
優れた NIRS 校正モデルは、RMSEC と RMSEP の値が低く、相関係数 (r) が高く、RMSEC と RMSEP の差が小さい必要があります。選択した 6 つの化合物の校正モデルは、上記の手順に従って確立されました (表 3)。エキナコシドのキャリブレーションセットの RMSEC 値と r 値は、それぞれ 27.6 と 0.9808 でした。他の化合物モデルの性能パラメータを表 3 に示します。このことから、確立されたモデルは満足のいく予測結果が得られ、C. tubulosa の迅速な定量分析に使用できると結論付けることができます。校正モデルをよりわかりやすく視覚的に観察できるように、6 つの化合物の散布図を図 4 に示します。図 4 に示すように、ほとんどのドットが y=x という方程式を持つ回帰曲線の周囲に分布しているため、予測値と測定値の間にわずかな差が生じています。したがって、図 4 では優れた予測パフォーマンスが観察されました。
3. 材料と方法
3.1.サンプルの準備
2013 年から 2015 年にかけて、新疆自治区ホータン県から 16 個の C. tubulosa サンプルが収集されました。サンプルはすべて培養されたものですが、異なる成長段階で収集されました。サンプルの新鮮な重量は 20 g から 1000 g の範囲でした。天日乾燥後、乾燥サンプルを粉砕し、60-メッシュふるいにかけました。
3.2. NIR分光データ収集
サンプルの NIR スペクトルは、手持ちの光ファイバー反射アダプター。各スペクトルは 64 回のスキャンを平均して得られました。サンプルが同じ温度で分析されることを保証するために、NIR スペクトル スキャンの前に、すべてのサンプルを室温 (25 °C) に平衡化させました。実験室の湿度は周囲レベルに保たれました。
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3.3. HPLC データ収集
3.3.1.抽出の準備
1 グラムの C. tubulosa 粉末を三角フラスコ中で 50 mL の 50% メタノールで超音波処理 (500 W、40 KHz) で 30 分間抽出しました。抽出物は 4 °C で保存されました。抽出液の上清を濾過して、ＨＰＬＣ分析用のサンプルを得た。
3.3.2. HPLC-UV によるエキナコシドとベルバスコシドの同時測定
液体クロマトグラフィー分析は、2 つの LC-20ADXR 溶媒供給ユニット、LC-20AD ポンプ、SIL-20ACXR オートで構成される島津 UHPLC システム（島津、京都、日本）で実施されました。サンプラー、CTO-20AC カラム オーブン、SPD-M20A DAD 検出器、DGU-20A3R 脱気装置、CBM-20A コントローラー。
クロマトグラフィー分離に使用した Grace Prevail Carboodor ES カラム (150 × 2.1 mm、2.7 mm) は 35 °C に維持されました。移動相はアセトニトリル (A) と 0.1% ギ酸水溶液 (B) で構成され、次のようなグラジエント プログラムに従って送られました: 0 – 7 分、10 ～ 20% の直線グラジエントA; 7 ～ 15 分、20% A。移動相の流量は 0.4 mL/min でした。 UV モニタリングは 330 nm で実行されました。
3.3.3. HPLC-ELSD によるマンニトール、スクロース、グルコース、フルクトースの同時測定
HPLC は、G1322A デガッサー、G1311A クォータナリ ポンプ、G1311A オートサンプラー、G1316A カラム温度コントローラー、および G1315B DAD 検出器で構成される Agilent 1100 シリーズ LC システム (パロアルト、カリフォルニア州、米国) で実行されました。
クロマトグラフィー分離には Sigma Prevail Carboodor ES カラム (4.6 × 250 mm、5 µm) を使用し、カラム温度を 25 °C に維持しました。移動相はアセトニトリルと水 (77:23、v/v) で構成され、流速 0.7 mL/min で定組成的に供給されました。流出物は、デフォルトのパラメータを備えた蒸発光散乱検出器 (ELSD) を使用して監視されました。
3.4.データ処理
TQ Analyst (バージョン 8.0、Thermo Scientific、米国ウィスコンシン州マディソン) を使用して、キャリブレーションおよび検証セットの分割、スペクトルの数学的前処理、キャリブレーション モデルの確立、およびその他の計算を実行しました。 。図の作成には Origin (バージョン 9.1) が使用されました。
4. 結論
本研究では、これらを同時に分析するための迅速かつ非破壊的な方法を提案しました。エキナコシド、ベルバスコシド、マンニトール、スクロース、グルコース、フルクトース放医研による C. tubulosa における。 RMSEC、相関係数、RMSEP、および Rp 値の分析により、確立された定量的 NIR モデルを使用して、C. tubulosa の選択された 6 つの有効成分の含有量を正確に予測できることが実証されました。 HPLC と比較して、今回報告した NIRS 法は十分な定量分析能力を維持しながら、大幅な労力と時間を節約できます。したがって、ここで報告した方法は、C. tubulosa の品質管理に使用される可能性があり、C. tubulosa の培養および加工技術の開発を導く可能性があります。
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