高リン食はラット腎臓における Bmp2 および Spp1 MRNA 発現の上方制御を誘導します

発生メカニズムを解明するために、腎石灰沈着症によって引き起こされる高リン（P）食では、骨形成タンパク質 2 やオステオポンチンなどの骨関連タンパク質に焦点を当てました。 この研究では、ラット腎臓における Bmp2 および Spp1 の mRNA 発現に対する高リン食の影響を調査しました。 ウィスターラットを 2 つのグループに分け、対照食 (対照グループ) または高リン食 (高リングループ) を与えました。腎臓カルシウムリン濃度は、対照群と比較して高リン群で有意に増加した。 Bmp2 と Spp1 の両方の mRNA 発現は、対照群と比較して高 P 群で有意に増加しました。 これらの結果は、高リン食が Bmp2 と Spp1 の上方制御を誘導することを示しています。腎臓のmRNA.

キーワード:高リン食、腎石灰沈着症、Bmp2、Spp1、腎臓、 ねずみ

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導入

腎石灰沈着症カルシウム（Ca）が沈着するのが特徴です。腎実質. 食物リン特に (P) は、この障害の発症において極めて重要な要因です。 高リン食の投与により、体内の Ca 濃度が増加することが示されています。腎臓腎実質内の Ca 沈着1-6）。 腎石灰沈着症の発症に対する高リン食の影響は進行中の研究の焦点となっているが、この障害の発症の原因となるメカニズムについてはほとんど知られていない。 したがって、この問題をタイムリーに解決する必要があります。

私たちは、透過型電子顕微鏡を用いた組織学的検査により、高リン食を与えたラットの尿細管中にハイドロキシアパタイト様の針状結晶が観察されたことを報告しました6, 7)。 X 線微量分析により、高リン食によって誘発される Ca 沈着は主に Ca と P からなることが示されました 7)。 これらの結果は、高リン食によって誘発される Ca 沈着がヒドロキシアパタイトの一種であることを明らかにしました。 この発見に基づいて、腎石灰沈着症の発症は骨形成におけるものと同様のメカニズムによって制御されていると仮定します。 したがって、本研究は骨形成タンパク質 2 (BMP2) などの骨関連タンパク質に焦点を当てました。 BMP2 は骨形成誘導活性を示す骨形成因子である 9)。 異所性骨形成を誘導する因子としてBMP2が同定されたことは注目に値する10,11)。 したがって、BMP2 が腎石灰沈着症の発症に重要な役割を果たしている場合、腎臓におけるこのタンパク質の発現は高リン食によって上方制御されるだろうという仮説を立てました。 本研究は、高リン食がタンパク質のmRNA発現に影響を与えるかどうかを判断することを目的としました。腎臓のBmp2.

一方、我々の以前の研究では、免疫組織化学的解析により、高リン食が尿細管におけるオステオポンチン（OPN）の発現を上昇させることが報告されており、OPNが高リン食によって誘発されるCa沈着の発生に関与している可能性が示唆されています12)。 そこで、腎臓におけるSpp1 mRNA発現の変化も調べました。

本研究の結果は、高リン食によって誘発される腎石灰沈着症の発症の原因となるメカニズムについて貴重な洞察を提供する可能性があります。

材料と方法

動物と食事。 本研究は東京農業大学の動物使用委員会によって承認され、すべての動物は同大学の実験動物の管理と使用に関するガイドライン（承認番号 300049）に従って維持されました。

雌ラットは雄ラットよりも腎石灰沈着症を発症しやすいことに注意することが重要です13,14)。 さらに、高リン食が雌ラットの尿細管における OPN 発現を増加させることを報告しました 12)。 次に、本研究では実験動物としてメスのラットを使用しました。 生後 4 週間の雌 Wistar ラット (Clea Japan、東京、日本) を個別のステンレス鋼の金網ケージに収容しました。 実験期間中、ケージは、12-時間の明暗サイクル（明、0800-2000時間）、温度22±1度、相対湿度60％で照明が制御された部屋に置かれました。 65%。

実験食の組成を表 1 に示します。実験食は AIN-93G 食 15) を参考に調製しました。 実験食には 2 つの異なるリン濃度が含まれていました (対照食、0.3%、高リン食、1.5%)。 以前の研究で、高リン食中のリン濃度は 1.5% に設定されました。食事中のリン濃度1.5% の場合、重度の腎石灰沈着症 6, 7, 12, 14) および高 OPN 発現 12) が誘発されます。 すべての実験食は同じ濃度の Ca (0.5%) を持っていました。 実験飼料の分析によって決定されたリンおよびカルシウム濃度を表 1 に示します。研究の開始前に、すべてのラットを 7 日間順応させ、その間、対照飼料と脱イオン水を自由に摂取させました。 。 順応期間の後、ラットを同様の平均体重を持つ 2 つのグループにランダムに分け、対照食 (対照グループ) または高リン食 (高リングループ) のいずれかを 14 日間与えました。 ラットには、実験期間中、割り当てられた実験食と脱イオン水を自由に摂取させた。 実験期間の終わりに、麻酔混合物（メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノール）の腹腔内注射によりラットを安楽死させ、分析のために血液および腎臓のサンプルを収集した。 血液サンプルを遠心分離し、上清を血清サンプルとして使用しました。 腎臓を摘出し、腎被膜を廃棄した。 の血清と腎臓のサンプル分析に必要になるまで－80度で保管しました。 右腎臓はBmp2およびSpp1 mRNAの定量分析に使用され、左腎臓はCaおよびP濃度の分析に使用されました。

ミネラル分析。

実験食と腎臓のサンプルをマッフル炉内で 550 度で 48 時間灰化し、分析のためにミネラルを 1 mol/L の HCl で抽出しました。 実験食および腎臓中の Ca 濃度は原子吸光光度法により測定した16)。 試験食および腎臓中のリン濃度は Gomori の方法を用いて分析した 17)。

Bmp2 および Spp1 mRNA の定量分析。

メーカーの仕様書に従って TRIzol 試薬 (Life Technologies, CA, USA) を使用して、ホモジナイズした腎臓から全 RNA を単離しました。 RNA の量と純度は、NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国) を使用して評価しました。 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Life Technologies) を使用して cDNA を合成し、SYBR Select Master Mix (Life Technologies) を使用して定量的リアルタイム RT PCR を行いました。 特定のプライマー18-20）をBmp2（フォワード、5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3';リバース、5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'）、Spp1（フォワード、5'-）の分析に使用しました。 TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3' ; 逆方向、5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3'）、および Gapdh（順方向、5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3' ; 逆方向、5'-GCAT CACCCCATTTGATGTT-3） ')。 リアルタイム PCR 反応は、StepOne リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems、カリフォルニア州、米国) を使用して実行され、mRNA 発現レベルは Gapdh mRNA レベルに正規化されました。 対照群の値を1.00とした。

統計分析。

結果は、6 匹のラットの各グループの平均値 ± SEM として表示されます。 F 検定を実行して分散の均一性を決定した後、スチューデントの t 検定を使用して 2 つのグループ間の有意差を決定しました。 分散の均一性が等しくない場合は、スチューデントの t 検定の代わりにウェルチの t 検定が使用されました。 差は p < 0 で有意であるとみなされました。05

結果

体重、食物摂取量、血清分析。

最終体重および食物摂取量は、対照群と比較して、高Ｐ群で有意に減少した（表２）。

腎臓の重量とミネラル濃度。

腎臓の湿重量および乾重量は、対照群と比較して高リン群で有意に増加しました（表 3）。 腎臓の Ca および P 濃度も、対照群と比較して高リン群で有意に増加しました。

腎臓の Bmp2 および Spp1 mRNA 発現。 高 P グループの Bmp2 mRNA レベルは、コントロール グループと比較して有意に増加しました (図 1A)。 Spp1 の mRNA 発現も、対照群と比較して高 P 群で有意に増加しました (図 1B)。

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