塩分摂取量の多さと野生マウスの自然腸内微生物叢への影響

1. はじめに

哺乳類の腸には複雑で多様な細菌群集が定着しており、宿主とともに微妙な共生関係を築いています[1、2]。この細菌群集は、代謝機能、免疫調節機能、栄養機能など、宿主にとって有用な多くの機能を発揮し [3-7]、腸内細菌叢の組成は、宿主の特定のニーズや生理機能に合わせて、生涯にわたって変化する可能性があります [1、8、 9]。腸の健康を促進する細菌の多くの有益な機能は、嫌気性発酵由来の代謝産物によって媒介されており [10-13]、腸内細菌異常状態は宿主の健康に大きな影響を与える可能性がある [2、11、14、15]。ライフスタイルが健康に与える影響に対する懸念の高まりにより、腸内細菌叢の関与とその翻訳的影響に対する科学的関心が高まっています[16、17]。実際、腸内細菌叢は、外因性 (例、ライフスタイル、食事、医療処置) および内因性 (例、宿主遺伝学、免疫および代謝制御) 因子の両方によって形成されます [8,18-20]。一般に、外因性要素が影響を与える影響を引き起こす可能性があり、食事は腸内細菌叢の組成と機能に影響を与える主な要因の 1 つであると認識されています [1、2、21]。過剰な塩分摂取などの西洋の食事成分は、免疫系に影響を与え、腸内細菌叢や病気を変化させることにより、宿主の恒常性を損なうことが知られています[18、22-37]。マウスの腸内細菌叢では、高塩分食（HSD）は、ラクトバチルス属、ビフィズス菌、ブラウティア、フェカリバキュラムなど、短鎖脂肪酸（SCFA）の生産者として悪名高い健康増進細菌の減少と関連しています[28、 29、38–41]、アッカーマンシアの存在量の増加と並行して、さまざまなモデル系で宿主の免疫と疾患に影響を与えることが示されている別の日和見的SCFA産生物質であるアッカーマンシア[42、43]。マウス動物モデルは、食事要因が腸内細菌叢、免疫系、疾患をどのように形成するかを研究するために頻繁に使用されます [29、44-46]。従来の実験用マウス (CLM) の使用は依然として多くの研究にとって有効な選択肢ですが、腸内細菌叢に焦点を当てたアプリケーションを適切に変換できない場合があります [47-49]。例えば、炎症性腸疾患(IBD)と肥満のマウスモデルにおける免疫学的およびメタボロミクス研究は、腸内細菌叢研究のトランスレーショナルアウトカムをほとんど予測できないことが示されている[50]。これは、腸の解剖学的構造、遺伝学、生理学が異なるなど、これらのモデルシステムに固有の多くの違いがあるためである可能性があります [16,50]。しかし、微生物叢と免疫の相互作用の研究にCLMを使用する場合の別の問題は、CLMにおける腸内細菌組成の家畜化であり、これは野生マウスと比較したCLM腸内細菌叢の複雑さと回復力の低下に反映されている[51]。衛生的で管理された環境の必要性は、潜在的な病原体や寄生虫の存在の減少に直面しており、その結果、野生マウスと比較してCLMの免疫系が「教育されていない」ことにつながると考えられています[51-53]。この問題に対処するために、免疫学的腸内細菌叢研究のトランスレーショナル問題を克服するために、C57BL/6 マウス由来の胚を野生マウスに移植して野生由来の腸内細菌叢を取得する野生動物マウスモデルが開発された[54]。このマウスモデルを含む最近の研究では、CLM と比較して実験的免疫療法のトランスレーショナル価値の予測において優れた結果が示されています [54,55]。さらに、野生動物の腸内細菌叢は、CLM と比較して抗生物質治療や高脂肪食に対する耐性と回復力が高く、ヒトのより複雑な状況に匹敵する[54,55]。しかし、腸内細菌叢、免疫系、およびCLMのさまざまな疾患モデルに対するHSDの影響は確立されているにもかかわらず、高塩分摂取が天然の野生由来の腸内細菌叢に及ぼす影響は不明です。この研究では、野生マウスと比較して、さまざまな腸内細菌生態系組成およびCLMの予測機能に対するHSDの影響を評価しました。

2. 材料と方法

2.1.動物と食事

野生型 C57BL/6 マウス (7 ～ 8 週齢のメス、n=20) を Charles River から購入し、ハッセルト大学の動物施設で標準化された条件下で飼育しました。野生マウス (C57BL/6 遺伝的背景、雄 n=12、雌 n=11) [54] は、標準化された条件下でハッセルト大学の動物施設に飼育されました。動物実験は、ハッセルト大学の動物実験倫理委員会 (ECAE) によって承認されました (ID201618A4V1、ID202235)。マウスは、12:12 時間の明暗サイクルで温度制御された部屋 (21 ～ 23 °C) で飼育されました (ケージあたり 4 匹のマウス)。以下の精製飼料は Ssniff (Soest、ドイツ) から購入しました: 0.5% NaCl/対照飼料 (E15430-04)、および 4% NaCl/HSD (E15431-34)。 HSD の場合、[28] に記載されているように、動物には E15431-34 に加えて飲料水中の 1% NaCl が与えられました。 CLM マウスは、対照群 (n=10) と HSD (n=10) に均等に分布しました。野生マウスの場合、雄と雌の個体も対照群と HSD 食餌群に均等に配分されました (対照群に雄 6 匹、HSD に雄 6 匹、対照に雌 5 匹、HSD に雌 6 匹)。

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2.2. DNA抽出

微生物 DNA 抽出は、QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) の修正プロトコルを使用して、[28] に記載されているように実行されました。簡単に説明すると、糞便ペレットを、0.5 mm ガラスビーズおよび 1.5 mL の溶解バッファー (ASL) (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を含む 2- mL エッペンドルフに加えました。ビーズ叩解を使用して、ペレットの機械的均質化を実行しました。完全な抽出は、若干の変更を加えて（プロテイナーゼ K のインキュベーション時間を 70 °C で 2 時間に延長）、メーカーのプロトコールに従って実行されました。 DNA 濃度は、NanoDrop ND-1000 分光光度計 (NanoDrop Technologies、米国デラウェア州ウィルミントン) を使用して評価し、16S rRNA 遺伝子増幅前に -20 °C で保存しました。

2.3. 16S rRNA 遺伝子の増幅と配列決定

16S rRNA 遺伝子配列は、以前に記載されているように [56]、V4 領域 (F515/R806) に特異的なプライマーを使用して増幅されました。簡単に説明すると、PCR 反応 (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix、Roche、Basel、CH、USA) ごとに 25 ng の DNA を使用し、98 °C で 30 秒間の初期変性を行った後、25 サイクル (98 °C で 10 秒) C、55 °C で 20 秒、72 °C で 20 秒）。反応は 3 回行い、サンプルごとにプールし、磁気ビーズベースのクリーンアップ システム (Agencourt AMPure XP、Beckman Coulter、Brea、CA、USA) によって精製しました。ライブラリーの調製は、Nextera テクノロジー (Nextera XT Index Kit、Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用してインデックス付きライブラリーを取得するための制限サイクル PCR によって実行され、続いて 2 回目の AMPure XP 磁気ビーズのクリーンアップステップが行われました。次に、インデックス付けされたサンプルを同じ濃度の 4nM に正規化し、プールし、会社のプロトコール (Illumina, Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) に従って、2 × 300 bp ペアエンド プロトコールを使用して Illumina MiSeq プラットフォーム PE300 で配列決定しました。

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2.4. 16S rRNA 遺伝子配列データの処理と統計解析

生のシーケンスは、QIIME 2 [57] パイプラインを使用して処理されました。長さと品質のフィルタリング (デフォルトのパラメータ) の後、リードはフィルタリングされ、DADA2 [58] を使用して運用分類単位 (OTU) に割り当てられました。分類学的割り当ては、VSEARCH アルゴリズム (https://github.com/torognes/vsearch; 22 年 11 月 9 日にアクセス) および Silva データベース v128 (https://www.arb-silva.de) によって実行されました。 /; 2 年 11 月 9 日にアクセスされました{{40}22)。次に、ASV テーブルは、すべてのサンプルが希薄化曲線の終点でプラトーに達するように、深さ 6.147 で希薄化によって正規化されました。アルファ多様性は、OTU の豊富さ (観測値)、Chao1、シャノン、シンプソン、インバース シンプソン (InvSimpson) 生態指数という 2 つの異なる指標を使用して評価されました。ベータ多様性については、Bray-Curtis の非類似性、Jaccard の類似性、加重および加重なしの UniFrac メトリクス [59] が原理座標分析 (PCoA) によって計算およびプロットされ、サンプル間の実際の距離が視覚化されました。 OTU カウント テーブルを正規化するために、サンプルあたり 6305 シーケンスの深さでレアファクションが 100 回実行されました。 OTU 分類割り当てから分類テーブルとして取得された出力は、正規化された OTU テーブルを分類レベル L2 (門)、L5 (科)、および L6 (属) のテーブルに折りたたむために使用されました。統計分析は、R (https://www.R-project.org/; 25 11 月 2022; バージョン 4.2.0) を使用して実行されました。 R パッケージ "vegan" (バージョン 2.6-4) [60] は、PCoA または主成分分析 (PCA) によってグループの組成の違いを比較するためのベータ多様性メトリクスを生成するために使用されました。パッケージとデータの分離は、擬似 F 比率 (「ヴィーガン」の「アドニス」機能) を使用した順列テストによってテストされました。グループ間のベータ多様性に関する分離は、距離行列を使用した順列多変量分散分析 (PERMANOVA、「ビーガン」の関数「アドニス」) によってテストされました。一方、グループ内の分散の差は、グループ分散の多変量均一性テスト (PERMDISP) によってテストされました。 、「ビーガン」の機能「betadisper」）。少なくとも 4 つのサンプルに存在しない分類群は分析から除外されました。分類群の相対存在量に関する差異は、最初に 4 つのグループ間の予備的なクラスカル・ワリス検定で評価され、次に以下の比較ペア間のウィルコクソン検定でさらに評価されました: CLM 対照対 CLM HSD、野生動物対照対野生動物 HSD、CLM 対照対野生動物対照、CLM HSD対野生動物HSD。野生動物とCLMの間の分類学的差異を評価するために、線形判別分析効果サイズ（LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; 2022年11月25日にアクセス）を使用して、属レベルで主な特徴を区別しました。 61]。 LEfSe の結果は、線形判別分析 (LDA) スコアのしきい値が 1.0 よりも高く、棒グラフとして表示されました。必要に応じて、多重比較の p 値は Benjamini-Hochberg 法によって調整されました。偽発見率 (FDR) 0.05 以下は統計的に有意であると見なされます。 * p 0.05 以下。 ** p 0.01 以下。 *** p 0.001 以下。食品中の異なる NaCl 含有量 (0.5% および 4% NaCl 食品含有量) のマイクロバイオーム間の機能の違いは、16s rDNA 遺伝子配列データからメタゲノムの機能内容を予測するバイオインフォマティクス ソフトウェア パッケージである PICRUSt2 によって分析されました (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/; 2022 年 11 月 29 日にアクセス。PICRUSt2 2.4.1) [62]。 PICRUSt2 パイプラインは、標準パラメーターを使用して、DADA2 からの代表的な配列とその存在量テーブルに適用されました (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; 2022 年 11 月 29 日にアクセス)。完全なパイプライン出力から、KEGG Orthology および MetaCyc 経路のメタゲノム予測が、予測関数を行、サンプルを列として表として構築され、HSD 体制における野生動物と CLM の腸内細菌叢の機能を比較するために使用されました。第一主成分 (PC1)、第二主成分 (PC2)、および第三主成分 (PC3) によって野生動物と CLM の間の変動に最も寄与した微生物群集予測関数が、2 つのモデルにおける HSD 消費に関するさらなる分析のために選択されました。次に、予測関数の存在量を含む行列を正規化し、中心対数比 (CLR) 値に変換し、野生動物と CLM の両方について log2mean 比 (HSD/対照) を計算しました。最後に、ウィルコクソン検定によってグループ間で log2mean 比を比較し、楔形プロットとしてプロットしました。グループ間の差異は、Wilcoxon 検定および Kruskal-Wallis 検定関数と、Holm または Benjamini-Hochberg 法によって調整された p 値を使用して、R ソフトウェアで統計的に比較されました。

3. 結果

3.1. HSDはCLMおよび野生動物の腸内微生物叢の多様性と構成に影響を与える

マウスの野生由来の腸内微生物生態系に対する HSD の影響を調査するために、野生マウスと CLM に HSD または対照食を与えました。マウスを 2 週間食事療法で維持し、その後 14 日目に採取した糞便ペレットから 16S RNA 遺伝子配列決定によって糞腸微生物叢の組成を調査しました (図 1A)。以前の報告と一致して、CLMおよび野生マウスの対照群とHSD群の間で体重に関して強い差異は検出されなかった[29]。ベースラインでの 2 つのモデル CLM と野生マウス間の腸内細菌叢の違いを評価するために、アルファ多様性 (Observed または Richness、Chao1、Shannon、Simpson、および Inverse Simpson インデックス)、ベータ多様性 (Bray-Curtis の非類似性)、および主要な分類上の違い。以前の研究[54]と一致して、野生動物の腸内細菌叢は、CLMよりも微生物が豊富であること（図1B、すべてのアルファ多様性指数）、およびCLMよりも明確でより不均一な微生物組成によって特徴づけられました（図1C、PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009、野生動物対 CLM、図 S1)。微生物の特徴に関しては、CLM マウスと野生マウスの腸内細菌叢は、異なる細菌分類群によって特徴付けられました (図 S1)。 Rosshart らと同様。 [54]、野生マウスの細菌分類群は、Intestinomonas、Desulfovibrio、Tuzzerella、Oscillobacter、Orodibacter、および病原性属 Helicobacter に属しており、このモデルの野生由来の非家畜化プロファイルを特徴付けています (図 S1)。

図 1. CLM (n=10/グループ) および野生動物マウス (野生動物 Ctrl の場合は n=11、野生動物 HSD の場合は n=12) の細菌組成に対する HSD の影響。 (A) 実験計画。 C57BL/6 CLM または野生マウスに 0.5% NaCl (コントロール、Ctrl) または高塩 4% NaCl (HSD) を与え、16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定によって特徴付けられる腸内細菌群集の腸を与えました。 (B) CLM と野生動物の糞腸微生物叢のアルファ多様性の指標。左から右に、次のインデックスが表示されます: 観測 (OUT リッチ)、Chao1、シャノン、シンプソン、シンプソン (逆シンプソン)。グループ間の差異は、Wilcoxon 検定によって統計的に評価されます。 (C) CLM 対野生動物 (上)、CLM 対照対 CLM HSD (左下)、および野生動物対照対野生動物 HSD (右下) の間の Bray-Curtis 非類似性メトリックからのベータ多様性順位の主座標分析プロット。グループ間の分離と均一性は、それぞれ PERMANOVA テストと PERMDISP テストによって計算されました。 * p 0.05 以下。 ** p 0.01 以下。 **** p 0 以下。0001.図 1. CLM (n=10/グループ) および野生動物マウス (野生動物 Ctrl の場合は n=11、野生動物 HSD の場合は n=12) の細菌組成に対する HSD の影響。 (A) 実験計画。 C57BL/6 CLM または野生マウスに 0.5% NaCl (コントロール、Ctrl) または高塩 4% NaCl (HSD) を与え、16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定によって特徴付けられた腸内細菌群集の腸を与えました。 (B) CLM と野生動物の糞腸微生物叢のアルファ多様性の指標。左から右に、次のインデックスが表示されます: 観測 (OUT リッチ)、Chao1、シャノン、シンプソン、シンプソン (逆シンプソン)。グループ間の差異はウィルコクソン検定によって統計的に評価されます。 (C) CLM 対野生動物 (上)、CLM 対照対 CLM HSD (左下)、および野生動物対照対野生動物 HSD (右下) の間の Bray-Curtis 非類似性メトリックからのベータ多様性序列の主座標分析プロット。グループ間の分離と均一性は、それぞれ PERMANOVA テストと PERMDISP テストによって計算されました。 * p 0.05 以下。 ** p 0.01 以下。 **** p 0.0001 以下。

HSD は、細菌の多様性の大幅な減少 (図 1B、すべてのアルファ多様性インデックス) および CLM の組成の顕著な微生物の変化 (図 1C、PERMANOVA p=0.001、PERMDISP p=0) を引き起こしました。 .1、CLM Ctrl と CLM HSD）。対照的に、野生マウスの腸内細菌叢は、CLM とは異なり、HSD では多様性が高いことを特徴とし (図 1B、観察インデックスと Chao1 インデックス)、CLM と比較して HSD では微生物組成の変化がそれほど顕著ではないことも特徴でした (図 1C、図 1C、観察インデックスと Chao1 インデックス)。 PERMANOVA p=0.001、PERMDISP p=0.5、野生の Ctrl と野生の HSD)。

3.2.野生マウスの腸内細菌組成はCLMよりもHSDに対する耐性が高い

野生動物と CLM の間の細菌組成の違いは、分類学的にさらに特徴付けられました。門レベルでは、相対存在量の点で最も豊富な門は、ファーミクテス門 (CLM: 52 ± 12%、野生動物: 32 ± 34%)、バクテロイド門門 (CLM: 24 ± 23%、野生動物: 57 ± 19%)、放線菌類 (CLM: 1{{10}} ± 7%、野生生物: 0.7 ± 1.3%) およびヴェルコバクテリオタ菌 (CLM: 24 ± 23%、野生生物: 0%/検出されません) (図 2)。腸内微生物プロファイルでは、野性マウスと CLM の間で、糞便サンプル中に検出されたすべての門の存在量がさらに異なることが示されました (図 2)。特に、コア微生物叢であるファーミクテス門、バクテロイド門、およびヴェルコミクロバイオータ門は、2 つのモデル間で大きく異なりました (図 2)。より具体的には、家族レベルでは、ラクトバチルス科、クロストリジウム科、ペプトストレプトコッカス科、およびアッカーマンシア科を含む、これまでにHSD感受性として報告されているほとんどの細菌[28]について、野生動物とCLMの腸内細菌叢で異なる寄与が観察された(図3)。これと一致して、前述の科の主要メンバーについて、野生動物と CLM サンプルの間で属レベルで同様の傾向が確認されました。これらの中で最も代表的なのは、ラクトバチルス、ローズブリア、ツゼレラ、フェカリバクルム、アッカーマンシアでした（図S1および4）。 HSD が CLM および野生動物の腸内細菌叢の組成に及ぼす影響をさらに特徴付けるために、さまざまな分類レベルでの食餌療法の影響も分析しました。門レベルでは、HSD 処理された CLM 腸内微生物叢は、ファーミクテス属の大幅な枯渇とヴェルコミクロバイオータの濃縮によって特徴づけられました (図 2)。しかし、野生動物サンプルでは主要な門はいずれも HSD の影響を受けませんでした (図 2)。家族レベルでは、CLM 腸内細菌叢は、ラクトバチルス科などの乳酸産生細菌、およびペプトスレプトコッカス科やクロストリジウム科などの SCFA 産生菌が大幅に減少していることが特徴でした (図 3)。さらに、HSD を与えた CLM では、アッカーマンシア科、ステレラ科、デフルビタレ科、およびエッガーテラ科の増加が観察されました (図 3)。対照的に、HSD は野生動物の腸内細菌叢のさまざまな細菌科に影響を及ぼし、その中には非常に豊富に存在する 2 つのムリバキュラ科とプレボテラ科があり、どちらも HSD により増加しました (図 3)。 CLMにおけるHSD効果に最も寄与した細菌調節には、アッカーマンシア属、パラサッテレラ属、およびエンテロラブダス属の増加、ならびにラクトバチルス属、ローズブリア属、ツゼレラ属、(ユーバクテリウム)酸化還元群、ムリバキュラム属およびアナエロボラックス属の減少が含まれた(図4)。 Roseburia を除いて、前述の属はいずれも野生動物の腸内細菌叢における HSD の影響を受けませんでしたが、Anaerovorax 属は CLM とは逆の傾向を示しました (図 4)。

図 2. CLM (n=10/グループ) および野生マウス (野生動物 Ctrl の場合は n=11、野生動物 HSD の場合は n=12) の腸内細菌叢の細菌門に対する HSD の影響。門の相対存在量に関する総組成は、各個体ごとの棒グラフ (上) と特定の門の箱ひげ図 (下) で示されます。統計的比較は、ウィルコクソン検定によってグループ間で実行されました。 * p 0.05 以下。 ** p {{10}}.01 以下。 *** p 0.001 以下。 **** p 0.0001 以下。

図 3. CLM の細菌ファミリー (n=10/グループ) および野生動物マウス (野生動物 Ctrl の場合は n=11、野生動物 HSD の場合は n=12) に対する高塩分食品摂取の影響。家族レベルの総構成は、各個人ごとの棒グラフ (上) と特定の家族の箱ひげ図 (下) で表されます。統計的比較は、ウィルコクソン検定によってグループ間で実行されました。 * p 0.05 以下。 ** p {{10}}.01 以下。 *** p 0.001 以下。 **** p 0.0001 以下。

図 4. CLM (n=10/グループ) および野生動物マウス (野生動物 Ctrl の場合は n=11、野生動物 HSD の場合は n=12) における細菌属の変化。属レベルでの全体的な相対存在量の寄与は、各個体ごとの円棒グラフ (上) と特定の属の箱ひげ図 (下) としてプロットされています。統計的比較は、ウィルコクソン検定によってグループ間で実行されました。 * p 0.05 以下。 ** p 0.01 以下。 *** p 0.001 以下。 **** p 0.0001 以下。

3.3. HSDはCLMの予測微生物機能に影響を与えるが、野生マウスでは影響しない

PICRUSt 2 の出力では、KEGG Orthology および MetaCyc 経路のアノテーションの両方について、野生動物 HSD と未処理の野生動物マウスの微生物群集機能の間に有意差は検出されませんでした。唯一の例外は、HSD による ATP 依存性ヘリカーゼの recG 遺伝子の機能増加です。 KEGG オーソロジー (図 5A)。 CLMに対するHSDの影響は、KEGG Orthologyの予測機能の大幅な低下によって特徴づけられ、その中にはデンプンとスクロースの代謝に関与する遺伝子spp（スクロース-6-ホスファターゼ）とpfkA（ホスホフルクトキナーゼ1）が含まれており、これは一致している以前の発見と合わせて [28] (図 5A)。さらに、HSDを与えられたCLMの腸内細菌叢は、膜輸送に関与する遺伝子（鉄輸送のfeoB、AB 2P AB 2 パーミアーゼタンパク質、AB 2A AB 2 ATP結合タンパク質）、グルタミン生合成（glnA）の予測機能の低下によって特徴付けられました。 、LacI ファミリー転写調節因子 (lacI、galR) およびトランスケトラーゼ (tktA、tktB) (図 5A)。 MetaCyc経路の場合、HSDはCLM腸内細菌叢の硝酸塩還元（脱窒経路）、ガラクトース分解（D-ガラクタル酸分解、D-グルカル酸のスーパー経路およびD-ガラクタル酸分解）、フェニルプロパン酸分解、脂肪分解に関連する予測機能を大幅に強化した。酸サルベージ、ブタン酸へのコハク酸分解、およびアミノ酸分解 (芳香族アミン分解、L-ロイシン分解) (図 5B)。さらに、以前の発見[28]と一致して、CLM の HSD 腸内細菌叢は、アミノ酸生合成 (L-アラニン生合成のスーパー経路、L-リジン生合成)、混合酸発酵の予測機能を失い、N-アセチルグルコサミン/N-アセチル-マンノサミン/N-アセチルノイラミネート分解およびデオキシリボヌクレオシド分解(ピリミジンおよびプリン分解、イノシン5リン酸生合成III)(図5B)。

図 5. 続き

図5. CLM（n=10/グループ）および野生動物（野生動物Ctrlの場合はn=11、野生動物HSDの場合はn=12）の腸内細菌叢における腸の予測メタゲノム機能に対するHSDの影響。 KEGG Orthology アノテーション (A) および MetaCyc 経路 (B) の楔形プロットとしてプロットされた PICRUSt2 出力は、HSD サンプルと Ctrl サンプル間の予測関数カウントの log2 平均比として表されます。すべての統計的比較は、Wilcoxon 検定によって Ctrl 群と HSD 群の間で実行されました。

4. ディスカッション

複雑で多様な野生動物の腸内細菌叢は、特定の疾患モデル [51] や高脂肪摂取 [54,55] などの食事療法に対してより耐性があることが知られています。しかし、これまでの研究では、マウスの野生由来の腸内細菌叢に対する高ナトリウム摂取の影響を評価したことはありません。ここで我々は、CLMと比較してHSDが野生動物の腸内微生物叢にどのような影響を与えるかを初めて調査した。興味深いことに、我々の結果は、CLMと比較して、野生動物のマイクロバイオームが組成レベルと予測機能レベルの両方でHSD障害に対してより耐性があることを実証しました。塩分を多く摂取すると、腸内微生物叢の組成や免疫恒常性が変化するため、心血管疾患や自己免疫疾患などのさまざまな疾患のリスクが悪化する可能性があることが十分に確立されています[25、29、31、34、63-65]。以前の報告と一致して、CLM における腸内微生物叢の HSD 誘発性変化は、微生物の多様性、組成、および予測機能の大幅な変化によって特徴付けられました [28]。ペプトストレプトコッカス科およびラクトバチルス属、ローズブリア属、およびツゼレラ属などの健康増進細菌は、CLM における相対存在量の点で減少しましたが、アッカーマンシア属は HSD を与えられたグループで大幅に増加しました。また、Defluvitaleaceae、Enterorhabdus、および Parasutterella において、HSD の相対存在量がより高いことも検出されました。興味深いことに、パラステッレラ属は、CLM とヒトの両方の腸内細菌叢の中心的な構成要素であり、糖分解菌およびコハク酸の生産者として機能します [66]。 Eggerthellaceae 科の Enterorhabdus と Suttellaceae 科の Parasutterella はどちらも IBD 患者に豊富に存在することが知られており [67,68]、HSD が疾患の発症にどのように影響するかをさらに示しています。しかし、興味深いことに、野生マウスでは、CLM などの HSD 誘発微生物シフトの類似した実体は示されませんでした。それにもかかわらず、観察されたOTUとChao1指標のHSDでは野生動物の多様性が大幅に増加し、野生動物の腸内細菌叢のHSD撹乱に関与した分類群はわずかで、その中にはアナエロボラックスの増加とエリシペラトクロストリジウム属、ロゼブリ属、およびラクノスピラ科の減少が含まれていた。 UCG-004属。ローズブリアは、HSDを与えられた野生動物マウスと比較して、HSDを与えられたCLMが依然としてこの細菌の存在量が多いという特徴があるにもかかわらず、対応する対照と比較してHSDグループ間で共通に共有される唯一の細菌サインであった。注目すべきことに、ローズブリアなどの酪酸生成細菌は、潰瘍性大腸炎患者では相対的に存在数が低いことが示され[69]、この減少はヒト被験者のIBD遺伝的リスクと相関していることも観察された[70]。これは、Roseburia や Lactobacillus などの細菌属の変化が高血圧のリスクと関連しており、おそらく西洋の食事によって促進されることが判明した以前の発見と一致しています [71]。腸の細菌組成も腸の運動性と生理機能に関連している[72]。

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Anaerovorax 属は、腸の生理機能に異常があり、運動性が低下しているマウスで以前に観察されています [73]。しかし、野生マウスの HSD における Anaerovorax の濃縮は、腸の恒常性と適切な機能の観点から、この分類群の異なる役割につながる可能性があります。以前の発見と一致して、CLMのHSDグループではアッカーマンシア属の増加が観察されました[28]が、野生マウスの腸内細菌叢にはこの属が枯渇しており、これはこのモデルに関する以前の研究とも一致しています[51、 53–55]。アッカーマンシア属は、宿主の免疫学的および代謝プロファイル（例、肥満および2型糖尿病）の改善にプラスの効果があるため、プロバイオティクスの可能性がある[42,74-77]が、そのマイナス効果のため、この属の役割はまだ不明である。結腸直腸がん[78]、パーキンソン病[79,80]、多発性硬化症患者[81]における臨床転帰との相関。 MetaCyc経路で得られた以前の結果[28]と一致して、HSD時のCLMは、KEGGオルソロジーのデンプンおよびスクロースの代謝に関連する予測微生物機能の低下を示しました。しかし、HSDを与えられた野生動物マウスの腸内細菌組成のわずかな変化は、予測される細菌機能に大きな変動を引き起こすことができず、野生動物由来の腸内微生物叢と代謝/生態ネットワークがはるかに安定しており、より容易に環境に適応できる可能性があることを示しています。 CLM腸内生態系と比較したHSD誘発性の食事の変動にはさらなる調査が必要です。言及する価値があるのは、食事療法の違いによる腸内細菌ネットワークに対する腸内真菌群集の影響の可能性である。以前の研究では、細菌と真菌の間の潜在的な相互作用が宿主の免疫系の恒常性と疾患の発症にどのように関与しているかがすでに示唆されています[82-85]。これに関連して、CLMは野生マウスと比較して細菌の複雑さが低いためさらに制限されており、これが多様な腸内菌叢の確立を妨げる可能性がある[54]。将来の研究では、野生動物モデルを使用することで、腸内細菌叢と宿主免疫の設定における腸内真菌群集の寄与を決定できるようになります。要約すると、我々の研究は、大量のナトリウム摂取が、家畜化されたCLM腸内細菌群集と比較して、天然の野生由来の腸内微生物生態系にどのような影響を与えるかについてのデータを提供する。私たちの研究は、HSDが野生マウスの細菌分類群や腸内細菌叢に、CLM由来の家畜化された腸内細菌叢に与えるのと同様には影響を及ぼさないことを実証しました。この相違は、高脂肪食などの他の食餌療法や条件について以前に述べたように[54,55]、より複雑な腸内生態系に対する食事介入の影響を再現し推定するには、天然のマウスモデルシステムにおける将来の研究が必要であることを示しています。人間と同じように。

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