CistancheDeserticola多糖類は骨吸収にどのように影響しますか？

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Cistanchedeserticola多糖類はRANKLシグナリングと活性酸素種の生成を阻害することにより破骨細胞形成と骨吸収を減衰させます

Dezhi Song et al

骨粗鬆症は、骨減少症と骨の微細構造の劣化を特徴とする代謝性疾患です。 破骨細胞は、骨基質を分解する主要なエフェクター細胞であり、それらの異常な機能が骨粗鬆症の発症につながります。 細胞代謝中の活性酸素種（ROS）の蓄積は、破骨細胞の増殖と分化を促進するため、骨粗鬆症において重要な役割を果たします。Cistancheニクジュヨウ多糖類（CDP）は抗腫瘍剤を持っています、抗炎症薬、および抗酸化活性。 ただし、CDPon破骨細胞の影響は不明です。 この研究では、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色、蛍光抗体法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、およびウエスタンブロット分析を利用して、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞形成とヒドロキシアパタイト吸収を抑制しました。 さらに、CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）また、Ctsk、Mmp9、およびAcp5を含む破骨細胞マーカー遺伝子の発現を阻害し、核因子κB（RANK）発現の受容体活性化因子に影響を与えませんでした。 メカニズム分析はそのCDPを明らかにしました(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞におけるRANKLを介したROS産生を弱める抗酸化酵素の発現を増加させ、活性化T細胞の核因子およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化を阻害します。 これらの結果は、CDPが過剰な破骨細胞活性によって引き起こされる破骨細胞症の治療の候補薬となる可能性があることを示唆しています。

キーワード骨吸収、Cistancheニクジュヨウ多糖類、MAPK、破骨細胞、活性酸素種

1|前書き

骨芽細胞によって媒介される骨形成と破骨細胞によって媒介される骨吸収との間のバランスは、骨代謝恒常性を維持する上で重要な役割を果たします（Manolagas、2000; Zhuet al。、2018）。 骨吸収が骨形成を超えると、骨量の減少と骨の微細構造の損傷を特徴とする骨粗鬆症が発生します（池田、2008）。 骨粗鬆症は高齢者や閉経後の女性によく見られる病気であり、その病因は完全には解明されていません（Cooper＆Melton、1992）。 エストロゲン欠乏症は骨粗鬆症の主な原因です（Manolagas、O'Brien、＆Almeida、2013）。 さらに、反応性酸素種（ROS）は、核因子κBリガンドの受容体活性化因子（RANKL）によって誘導され、破骨細胞形成に関連し（Yip et al。、2005）、したがって破骨細胞症の発症に寄与する可能性があります（Manolagas、2010）。 いくつかの研究では、Nrf2抗酸化物質の欠乏により、ROSレベルが上昇し、RANKLによって誘発される破骨細胞の分化が促進されることがわかっています（Hyeon、Lee、Yang、およびJeong、2013年）。 したがって、骨粗鬆症の治療のための治療戦略として、破骨細胞分化中のROS産生の減少を評価する必要があります。

破骨細胞は、単球またはマクロファージ造血系統に由来し、骨吸収を行う唯一の多核細胞です（Teitelbaum、2000）。 したがって、破骨細胞形成を含む研究は、骨代謝疾患の効果的な治療法を開発する上で非常に重要です（Lorenzo、2017）。 骨芽細胞と活性化T細胞によって産生されるマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）とRANKLは、破骨細胞形成を調節する重要なサイトカインです（Kim＆Kim、2016; Teitelbaum＆Ross、2003）。 RANKLは、破骨細胞形成中に活性化する重要な転写因子である活性化T細胞の核因子（NFATc1）の発現を誘導します（Ishidaet al。、2002）。 活性化されたNFATc1は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAcP）やカテプシンK（CTSK）など、破骨細胞形成と破骨細胞機能を調節する破骨細胞マーカー遺伝子の発現を促進します（Balkan et al。、2009; Crottiet al。、2008）。

Cistancheニクジュヨウ多糖類（CDP）はの肉質の茎から分離されていますCistanche免疫調節、抗腫瘍、老化防止、およびその他の薬理学的効果を備えています（Guo et al。、2016; Jia、Guan、Guo、＆Du、2012）。 CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）マウスミクログリア細胞（BV-2細胞; Nan et al。、2013）におけるリポ多糖誘発性一酸化窒素（NO）産生に対する抑制効果がありました。 さらに、アフェニルエタノイドに富む抽出物（ECD）Cistanche筋肉の損傷を減らし、乳酸の蓄積を遅らせ、エネルギー貯蔵を改善することにより、マウスの遊泳能力を高めました（Cai et al。、2010）。しかし、破骨細胞の機能と活動に対するCDPの影響は不明なままです。

この研究では、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLによる破骨細胞の分化と骨吸収を阻害します。 根本的なメカニズムはそのCDPでした(Cistancheニクジュヨウ多糖類）抗酸化酵素の発現を増強してROS産生を弱め、次にRANKL活性化NFATおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達カスケードを抑制します。 これらの結果は、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）過剰な破骨細胞の骨吸収によって引き起こされる骨粗鬆症の治療に使用される可能性があります。

2|材料および方法

2.1|材料

CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）（純度> 98％）はSolarbio（北京、中国）から購入し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1mMのストック濃度で調製しました。 抗体はc-Fos、CTSK、GSR、TRX1、NOS2、TRAF6、RANK、NFATc1、ERK、JNK、p38、リン酸化（p）-ERK、p-p38、p-JNK、および-アクチンに特異的です。 Cruz Biotechnology（カリフォルニア州サンノゼ）。 V-ATPase d2に対する抗体は、前述のように生成されました（H. Feng et al。、2009）。 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム（MTS）およびルシフェラーゼアッセイシステムは、Promega（Sydney、Australia）から入手しました。 組換えM-CSFはR＆D Systems（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入しました。 組換えGST-rRANKLタンパク質は、以前に記載されたように発現および精製された（Xu et al。、2000）。

2.2|細胞培養

RAW264.7細胞（マウスマクロファージ細胞）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、バージニア州マナッサス）から入手し、10％胎児ウシ血清、2 mMのL-グルタミンを添加した改変最小必須培地（Thermo FisherScientific、Scoresby、オーストラリア）で培養しました。 、100 U / mlのペニシリン、および100 ug / mlのストレプトマイシン（完全培地）。 骨髄由来単球（BMM）は、6週齢のC57BL / 6Jマウスから分離され、西オーストラリア大学の動物倫理委員会（RA / 3/100/1244）によって承認された手順に従って安楽死させました。軟組織を切除し、骨髄を大腿骨と脛骨から洗い流し、M-CSF（50 ng / ml）の存在下で完全培地で培養しました。

2.3|破骨細胞形成アッセイ

BMMをウェルあたり6×103細胞の密度で96ウェル培養プレートにプレーティングし、M-CSF（50 ng / ml）およびGST-rRANKL（100 ng / ml）を含む完全培地で、存在下または非存在下で処理しました。 CDPのさまざまな濃度(Cistancheニクジュヨウ多糖類）. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>3つの核）が破骨細胞として同定されました。

2.4|細胞毒性アッセイ

BMMを96ウェルプレートにウェルあたり6×103細胞で播種し、一晩放置して接着させました。 翌日、細胞をさまざまな濃度のCDPとともにインキュベートしました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）。 さらに48時間後、MTS溶液（20 µl /ウェル）を添加し、細胞とともに2時間インキュベートしました。 マイクロプレートリーダー（MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems、バージニア州シャンティリー）を使用して490nmでの吸光度を測定しました。

2.5|免疫蛍光染色

BMMは、M-CSF（50 ng / ml）の存在下で、ウェルあたり6×103細胞の密度で一晩播種しました。 次に、成熟破骨細胞が形成されるまで、細胞をM-CSFおよびGST-rRANKL（100 ng / ml）で刺激しました。 次に、破骨細胞をさまざまな濃度のCDPで処理しました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）4％パラホルムアルデヒドで固定する前に、48時間、0 .1％Triton X-100–PBSで透過処理し、PBS中の3％ウシ血清アルブミンでブロッキングします。調製した細胞をローダミン結合ファロイジンと45分間インキュベートしました。 F-アクチンは暗く染色されます。 次に細胞をPBSで洗浄し、核を4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で対比染色し、共焦点顕微鏡用のカバーガラスでマウントしました。

2.6|ヒドロキシアパタイト吸収アッセイ

破骨細胞活性を測定するために、6ウェルコラーゲンコーティングプレート（BD Biocoat; ThermoFisher Scientific）で培養したBMM（1ウェルあたり1×105細胞）をGST-rRANKL（100 ng / ml）およびM-CSF（50 ng / ml）で刺激しました。 ）成熟破骨細胞が生成されるまで（Zhou et al。、2016）。 次に、細胞解離溶液（Sigma-Aldrich）を使用して細胞をプレートから穏やかに剥離し、同数の成熟破骨細胞をヒドロキシアパタイトでコーティングした96ウェルプレート（Corning Osteoassay、ニューヨーク州コーニング）の個々のウェルに播種しました。 成熟破骨細胞は、CDPを含むまたは含まないGST-rRANKLおよびM-CSFを含む培地で培養されました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）示された濃度で。 48時間後、ウェルの半分を免疫組織化学的にTRAcP活性について染色し、上記のように、ウェルあたりの多核細胞の数を評価しました。 残りのウェルを10分間漂白して細胞を除去し、吸収された領域を測定できるようにしました。 吸収された領域を標準的な光学顕微鏡下で撮影し、Image Jソフトウェア（国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を使用して、破骨細胞によって表面吸収されたヒドロキシアパタイトの面積のパーセンテージを定量化しました。

2.7|ルシフェラーゼレポーターアッセイ

NFATc1転写活性化を調べるために、RAW264.7細胞にNFATc1応答性ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを安定的にトランスフェクトしました（Cheng et al。、2018; van der Kraan et al。、2013）。トランスフェクトした細胞を48ウェルプレートで密度1で培養しました。ウェルあたり0.5×105細胞、さまざまな濃度のCDPで前処理(Cistancheニクジュヨウ多糖類）1時間。 前処理後、細胞をGST-rRANKL（100 ng / ml）で24時間刺激し、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを製造元のプロトコル（Promega）に従って使用してルシフェラーゼ活性を測定しました。

2.8|定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析

全RNAは、メーカーのプロトコル（Thermo Fisher Scientific）に従ってTrizol試薬を使用して細胞から分離されました。 相補的DNAは、1ugのRNAテンプレートとオリゴdTプライマーを含むモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使用して合成されました。 特定の配列のポリメラーゼ鎖反応増幅は、次のプログラムを使用して実行されました：94度で5分間、続いて94度で40秒間、60度で40秒間、72度で40秒間の30サイクル、および5分間の最終伸長ステップ72度。 特定のプライマーの詳細情報を表1に示します。相対的なメッセンジャーRNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子Hmbsの発現に正規化することによって計算されました。

2.9|ウエスタンブロット分析

BMMは、6ウェルプレートでM-CSFを含む完全培地で培養し、GST-rRANKL（100 ng / ml）で指定時間刺激しました。 細胞を放射性免疫沈降溶解緩衝液で溶解し、タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリ（フッ化ビニリデン）膜（GE Healthcare、オーストラリア、シルバーウォーター）に転写しました。 膜を5％スキムミルクで1時間ブロックし、4度で一晩穏やかに振とうしながらさまざまな特異的一次抗体でプローブしました。 メンブレンを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートし、抗体反応性を強化化学発光試薬（Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で検出し、Image-quant LAS 4000（GE Healthcare）で可視化しました。

2.10|細胞内ROS検出

細胞内ROSレベルは、2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート細胞ROS検出アッセイキット（Abcam、メルボルン、オーストラリア）を使用して検出されました。 BMM（ウェルあたり5×103細胞）を96ウェルプレートで培養し、RANKL（100 ng / ml）、M-CSF（50 ng / ml）、およびCDPで72時間処理しました。 細胞内ROSレベルは、ROSの存在下で酸化して蛍光DCFになる2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテートを使用して測定しました。 細胞をハンクスバッファーで洗浄し、10 µMのDCFH-DAとともに暗所で30分間インキュベートしました。 画像は共焦点顕微鏡を使用して取得されました。

2.11|統計分析

すべてのデータは、特に明記されていない限り、3回繰り返して実行された少なくとも3つの実験を表しています。 データは平均±SDとして表されます。一元配置分散分析とそれに続くStudent–Newman–Keulspost hocテストを使用して、結果間の差の有意性を決定し、p<>

3|結果

3.1|CDPはRANKLによる破骨細胞形成と破骨細胞融合を阻害します

CDPかどうかを判断するには(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLによる破骨細胞形成を抑制できるため、最初にマウスBMMを使用して破骨細胞形成アッセイを実施しました（Liu et al。、2013; Song et al。、2016）。 BMMをRANKLとM-CSFで5日間処理し、CDPの濃度を上げました。 CDPは、CDPの濃度が高くなると、TRAcP陽性の多核細胞の数を減らしました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）5 µM以上に達しました（図1a、b）。 CDPを評価するには(Cistancheニクジュヨウ多糖類）毒性とこれらの結果が細胞死または数の反映ではないことを確認し、MTSアッセイを実施しました。 BMMは、CDPの投与量を変えて、RANKLとM-CSFで48時間処理しました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）。 CDPは、15 µM以下の濃度ではBMMの増殖に影響を与えませんでした（図1c）。

CDPの効果をテストするには(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞融合では、破骨細胞は、CDPの用量を変化させて、または伴わずに、RANKLおよびM-CSF治療で誘発されました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）。 破骨細胞をローダミン-ファロイジンとDAPIで染色して、破骨細胞あたりの核数を評価しました（図2a）。破骨細胞数と平均核破骨細胞数の両方がCDP後に減少しました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）処理（5〜10 µM;図2b、c）。 したがって、CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKL誘発破骨細胞形成および破骨細胞融合に対して用量依存的に阻害効果を示した。

3.2|CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKL誘発性骨破砕性ヒドロキシアパタイト吸収活性を弱める

CDPの効果を検出するためにヒドロキシアパタイト吸収アッセイを実施しました(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞機能について（図3a）。 24時間のインキュベーション後、ウェルあたりの破骨細胞の数は変化しませんでしたが、ハイドロキシアパタイトの吸収領域は、コントロールグループと比較して5および10 µMのCDPで処理することにより大幅に減少しました（図3b、c）。 これらの結果は、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）細胞毒性効果なしに破骨細胞形成と破骨細胞吸収活性の両方に強い阻害効果があります。

3.3|CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞マーカーの遺伝子発現を阻害します

CDPの抑制効果をさらに調査する(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞形成と破骨細胞骨吸収について、BMMをRANKLとM-CSFで5日間、さまざまな濃度のCDPで処理しました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）次に、.RT-PCRを実施して破骨細胞マーカー遺伝子の発現を検出した。 破骨細胞形成中の重要な転写因子であるNfatc1の発現はCDPによって阻害された(Cistancheニクジュヨウ多糖類）用量依存的に（図4a）。 さらに、CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）（5および10 µM）は、Mmp9、Ctsk、およびAcp5を含む骨吸収関連遺伝子の発現をダウンレギュレーションしました（図4b–d）。

3.4|CDPはNFATc1活性と下流のタンパク質発現を抑制します

CDPの効果を調べるには(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKL誘導NFATc1活性について、アルシフェラーゼレポーターアッセイを行いました。 CDPによる治療(Cistancheニクジュヨウ多糖類）、5 µM以上の濃度では、RANKL誘導性のNFATc1活性が有意に阻害されました（図5a）。 さらに、ウエスタンブロット分析はそのCDPを示した(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLおよびM-CSFで3日間および5日間処理したBMMでは、NFATc1およびc-Fosのタンパク質発現が有意に抑制されました（図5b）。 さらに、CDPの存在下では、V-ATPase-d2やCTSKなどの破骨細胞機能関連タンパク質の発現がダウンレギュレーションされました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）コントロールグループと比較して。 ただし、CDPはRANKの発現に影響を与えませんでした（図5b）。

3.5|CDPは、抗酸化酵素の発現を促進して、RANKL誘発性破骨細胞形成中のROS産生を除去します。

CDP依存性破骨細胞形成阻害の根本的なメカニズムを調べるために、BMMをPBSまたはCDPと一緒にRANKL（100 ng / ml）およびM-CSF（50 ng / ml）で処理しました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）72時間。 RANKLによって刺激された細胞内ROS産生に対するCDPの効果を調べました。 細胞内ROSレベルは、CDP（5および10 µM;図6a）によって減衰されたRANKL処理によって増加しました。 ROS陽性細胞の数とROS染色の強度の両方が、用量依存的な方法でCDP処理によって減少しました（図6b、c）。 ウエスタンブロット分析は、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLおよびM-CSFで3日間処理したBMMで誘導型一酸化窒素シンターゼ（NOS2）の発現を抑制しながら、チオレドキシン（TRX1）およびグルタチオンレダクターゼ（GSR）の発現を促進しました（図6d）。

CDPかどうかをさらに調査するには(Cistancheニクジュヨウ多糖類）ROS産生を減少させることにより破骨細胞の分化を抑制し、次にBMMをペルオキシド（10 µM）で処理して、細胞内の高いROS状態を模倣しました。 BMMはRANKLとM-CSFによって3日間誘導され、ウエスタンブロット分析とRT-PCRの結果は、過酸化物が対照群と比較してNFATc1とc-Fosの発現を促進することを示しました。 図5の結果と一致して、NFATc1とc-Fosの発現はCDPによって抑制されました。(Cistancheニクジュヨウ多糖類）一方、過酸化物はCDPの阻害効果を救いました（図6e、f）。 これらのデータは、CDPがROS産生を除去することによりNFATc1とc-Fosの発現を抑制したことを示しています。

3.6|CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKL誘発性破骨細胞形成中のMAPK経路を抑制します

次に、CDPの効果を調査しました(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLを介したTRAF6発現とMAPK経路活性化の治療。 無血清培地で2時間インキュベートした後、CDPの有無にかかわらずBMMをRANKLで60分間刺激しました。 CDP（10 µM）による刺激は、TRAF6の発現に影響を与えず、10分および20分でJNK2およびERK1 / 2のリン酸化を弱めました（図7）。 さらに、p38のリン酸化はCDPによって有意に阻害されました(Cistancheニクジュヨウ多糖類）対照群と比較した60分の治療（図7）。 これらのデータは、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞の形成と活性に対する阻害効果と一致して、RANKLが誘導するMAPKシグナル伝達経路を抑制します。

4|討論

「砂漠の高麗人参」として知られるCistancheは、免疫を調節し、老化や酸化ストレスの際に保護的に作用する能力で最近注目を集めています（Jia et al。、2012; Snytnikovaet al。、2012）。 Cistancheの主要な活性成分であるフェニルプロパノイド置換グリコシドは、マクロファージのNO活性を阻害することが示されています（Ahn、Chae、Chin、およびKim、2017年）。 さらに、Cistanche抽出物は、虚血後の再灌流心筋の酸化ストレスを軽減し、心臓保護につながるアポトーシス経路の阻害に重要な役割を果たしました（Yu、Li、＆Cao、2016）。 Cistanche、CDPの重要なコンポーネントとして(Cistancheニクジュヨウ多糖類）さまざまな薬理学的機能を持っています。 私たちの現在の研究では、CDPがROS産生とNFATおよびMAPK活性化を弱めることにより、RANKL活性化破骨細胞の分化と活性化を抑制することがわかりました。

酸性ホスファターゼとして、TRAcPはさまざまな細胞に存在し、破骨細胞や肺胞マクロファージに豊富に存在します（Snipes、Lam、Dodd、Gray、＆Cohen、1986）。 TRAcPは破骨細胞の特徴的な酵素であり、その発現は破骨細胞の機能と密接に関連しており、破骨細胞の活性と骨吸収の指標と見なされています（Minkin、1982）。 私たちの研究、CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）TRAcP陽性細胞の数を阻害し、RANKL誘発性破骨細胞形成がCDPによってブロックされたことを示しています(Cistancheニクジュヨウ多糖類）。 破骨細胞による骨基質の分解は、カテプシンK（CTSK）とMMPに依存します（Gruber、2015年）。 ここで、CDPは、Mmp9、Ctsk、Acp5などの破骨細胞機能遺伝子の発現を有意にダウンレギュレーションしました。

破骨細胞の分化と機能は、複数のシグナル伝達経路によって調節されています（Boyle、Simonet、＆Lacey、2003）。 RANKに結合した後、RANKLはアダプタータンパク質TRAF6を動員して、破骨細胞形成の重要な転写因子であるNFATc1の発現を活性化し、TRAcPやCTSKなどの破骨細胞特異的遺伝子発現に影響を与えます（X.Feng、2005; Takayanagi et al。、2002）。 この研究では、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞におけるRANKおよびTRAF6の発現には影響しませんでしたが、CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）BMMの破骨細胞形成中にRANKLが誘導するNFATc1の活性化を阻害しました。 さらに、電子を送達する過程でミトコンドリアによって生成されるROSは、破骨細胞の増殖と分化を促進し、骨基質の分解を調節することが実証されました（Ha et al。、2004）。 最近の研究では、RANKLがBach1の核内移行を誘導し、Nrf2を介した抗酸化酵素の産生を弱め、それによってマウスの細胞内ROS発現と破骨細胞形成を増強することがわかりました（Kanzaki et al。、2017）。 さらに、ホモシステインによる細胞内ROS生成の増加は、破骨細胞の形成と活性を増強しました（Koh et al。、2006）。 私たちの研究では、CDPがNOS2の発現を阻害し、TRX1やグルタチオンレダクターゼなどの抗酸化酵素の発現を促進することにより、破骨細胞におけるROSの蓄積を減少させることがわかりました。 NFATc1。また、過酸化物がCDPonNFATc1発現の阻害効果を救済することも発見しました。 したがって、我々のデータは、CDPがROSの蓄積を抑制してNFATc1の発現を阻害し、次に破骨細胞の形成と機能を抑制することを示唆しています。

ERK、JNK、およびp38はMAPKファミリーに属し、破骨細胞分化の調節にも関与しています（Seger＆Krebs、1995）。RANKLは、ERK、JNK、およびp38のリン酸化を増加させることによってMAPK経路を活性化します（Mizukami et al。、 2002）。 そのCDPを実証しました(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLを介したMAPK経路の主要タンパク質のリン酸化を抑制し、破骨細胞マーカー遺伝子の発現に対するCDPonの阻害効果に寄与しました。 私たちの知る限り、これはCDPの抑制効果を示す最初の研究です(Cistancheニクジュヨウ多糖類）invitroでのCDPの新しい作用機序を表すROS産生、NFAT、MAPK活性化に関する研究。

要約すると、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞形成とヒドロキシアパタイト吸収、およびCtsk、Mmp9、Acp5などの破骨細胞マーカー遺伝子の発現を軽減します。 CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLを介したROS産生、およびNFATとMAPKの活性化を抑制することができました（図8）。 まとめると、私たちの結果は、CDPが(Cistancheニクジュヨウ多糖類）ROSの過剰産生を伴う破骨細胞関連の状態の治療のための候補薬を表す可能性があります。

図8CDPの概略図(Cistancheニクジュヨウ多糖類）破骨細胞分化における機能。 CDP(Cistancheニクジュヨウ多糖類）RANKLによるROS産生、NFATc1およびMAPKの活性化を抑制し、破骨細胞形成を阻害します。 CDP、Cistancheニクジュヨウ多糖類; MAPK、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ; NFATc1、活性化T細胞の核因子; RANKL、核因子κBligandの受容体活性化因子; ROS、活性酸素種[カラー図はatwileyonlinelibrary.comで表示できます]

謝辞

この研究は、中国の自然科学財団（81572164）、中国の国家主要技術研究開発プログラム（2017YFC1103300）、広西省の自然科学財団（2016GXNSFAA380295）、および広西チワン族自治区の大学科学技術研究プロジェクト（KY2015YB054）によってサポートされました。 ）。 また、GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project（GKG13349003、1598013-15）、Western Australia Medical＆HealthResearch Infrastructure Fund、Arthritis Australia Foundation、TheUniversity of Western Australia（UWA）Research CollaborationAwards、およびAustralian HealthandMedicalによって部分的にサポートされています。研究評議会（NHMRC、No。1107828および1027932）。

利害の対立

著者は、利益相反がないことを宣言します

から： 'Cistancheニクジュヨウ多糖類Dezhi SongらによるRANKLシグナル伝達と活性酸素種の産生を阻害することにより、破骨細胞形成と骨吸収を軽減します。

---©2018WileyPeriodicals、Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp JCellPhysiol。 2018; 233：9674–9684