ヒトの腎臓および尿路におけるヒトアルファディフェンシン5の発現
Mar 16, 2022
詳細情報：ali.ma@wecistanche.com
ジョン・デビッド・スペンサー他
概要
バックグラウンド：尿路の無菌性を維持するメカニズムは完全には理解されていません。 最近の研究は、感染から尿路を保護する上で抗菌ペプチド（AMP）の重要性を示唆しています。 ここでは、ヒトにおけるAMPヒトα-ディフェンシン5（HD5）の発現と関連性を特徴づけます肝臓正常な被験者と感染した被験者の尿路。
方法論/主な調査結果：ヒトから分離したRNAを使用肝臓、尿管、および膀胱組織について、定量的リアルタイムPCRを実行して、HD5をコードする遺伝子であるDEFA5が尿路全体で構成的に発現していることを示しました。 腎盂腎炎では、DEFA5の発現が肝臓。 イムノブロット分析を使用すると、HD5産生も腎盂腎炎で増加しました。 膀胱および尿管の尿路上皮に局在化したHD5を免疫染色する。 腎臓では、HD5は主に遠位ネフロンと収集尿細管で産生されました。 イムノブロットおよびELISAアッセイを使用すると、HD5は感染していないヒトの尿サンプルでは日常的に検出されませんでしたが、E.coli尿路感染症で尿中HD5産生が増加したことを意味します。
結論/重要性：DEFA5は、感染していない被験者の尿路全体に発現しています。 具体的には、HD5は、下部尿路の尿路上皮全体および肝臓。 感染すると、HD5の発現が増加します肝臓、およびレベルは尿中で検出可能になります。 私たちの知る限り、私たちの発見は、ヒトの腎臓におけるHD5の発現と産生を定量化した最初のものです。 さらに、これは感染した尿サンプル中のHD5の存在を検出した最初の報告です。 私たちの結果は、HD5が尿路の不妊を維持する上で重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています。
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序章
尿道は、尿道口を除いて、糞便フローラに近接しているにもかかわらず、通常は無菌です。 尿路がその無菌性を維持する正確なメカニズムはよく理解されていません。 尿路の防御に寄与する提案されたメカニズムには、尿の流れ、尿のpHと浸透圧の変化、定期的な膀胱排出、尿路上皮の化学的防御成分、および細菌刺激によるエフェクター免疫細胞の上皮の脱落/流入が含まれます[1]。 さらに、抗菌ペプチド（AMP）は、尿路の無菌性を維持する上で重要な役割を果たしていることが最近示されています[2]。AMPは、ほぼすべての生物によって産生される天然の抗生物質として機能し、自然免疫系の遍在する成分です。 AMPは、食細胞の白血球と上皮細胞によって発現されるカチオン性分子です。 人間や他の哺乳類では、ディフェンシンはAMPの主要なファミリーです。 ディフェンシンは通常、グラム陽性菌とグラム陰性菌、ウイルス、真菌、および原生動物に対して広域スペクトルの抗菌活性を持っています[2,3]。 ディフェンシンは最初にプレプロタンパク質として合成され、プロセシングを受けて成熟した生物学的に活性なペプチドになります[4]。 ヒトでは、ディフェンシンは、ジスルフィド架橋パターンに応じて、アルファディフェンシンまたはベータディフェンシンの2つのファミリーのいずれかに分類されます[5]。
尿路では、ベータディフェンシンは尿路上皮全体に広く発現しています。 を裏打ちする上皮細胞肝臓ヘンレループ、遠位尿細管、集合管は、ヒトベータディフェンシン1（hBD1）を構成的に発現します。 尿中レベルのhBD1は侵入した細菌を殺すには不十分ですが、hBD1は尿細管内腔の速効性抗菌コーティングを提供し、尿路上皮への細菌の付着を阻害することによって感染を防ぎます[6]。 最近の研究では、hBD1の酸化還元状態が抗菌力に大きく影響することが示されているため、還元ペプチドはジスルフィド結合酸化型よりもはるかに強力です[7]。 尿路上皮表面でのこれの重要性は決定されていません。 別のディフェンシンであるヒトベータディフェンシン2（hBD2）は、健康な腎臓組織では構成的に発現していません。 ただし、hBD2の発現は感染によって誘導されます[8]。
ベータディフェンシンとは異なり、上皮由来のアルファディフェンシンの役割は尿路で十分に説明されていません。 アルファディフェンシンHD5とHD6の発現と機能は、主に小腸で報告されており、パネスセルによって腸陰窩に分泌され、腸の微生物叢のバランスに寄与します[9]。 HD5は男性と女性の生殖管にも局在しており、感染を根絶するのに誘導可能で重要であることを示唆する証拠があります[10、11、12]。 尿中HD5は、回腸新膀胱再建および回腸導管尿路変更術を受けた患者で検出されており、HD5産生源は主に回腸パネート細胞に起因するとされています[13,14]。 HD5は、一般的な尿路病原性グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対して抗菌活性を持っています[15]。 HD5は、アデノウイルスやBKウイルスなどの尿路病原性ウイルスに対しても抗菌作用があります[16、17、18]。 この研究では、ヒトにおけるHD5発現の初期の説明と定量化を提供します肝臓さらに、不妊症や感染症の際の下部尿路での発現を定義します。
結果
DEFA5 mRNAは、ヒトの膀胱、尿管、および腎臓で構成的に発現しています。
定量的リアルタイムPCRは、テストされたすべての膀胱、尿管、および肝臓感染のない標本は構成的にDEFA5を発現した。 DEFA5の発現は、上部尿路よりも下部尿路で有意に大きかった（p=0 .014）。 膀胱（n=4）では、平均DEFA5発現は10 ng RNAあたり4,656637転写物であり、尿管（n=4）では、平均DEFA5発現は10 ngRNAあたり4,1126170転写物でした（図1A） 。 腎臓（n=6）では、平均DEFA5発現は10ngRNAあたり2,9376274転写物でした。 DEFA5の発現は、腎皮質、髄質、および骨盤で別々に分析されました。DEFA5の発現は、腎臓の領域によって有意に変化しませんでした（p=0。45）。
DEFA5の発現とHD5ペプチドの発現は腎盂腎炎とともに増加します
で実行される定量的リアルタイムPCR分析腎臓組織腎盂腎炎は、感染していない腎臓組織と比較して、DEFA5発現の有意な増加を示しました。 腎盂腎炎（n=6）の場合、平均DEFA5発現は10 ng RNAあたり7,82961,052転写物に増加しました（p=0。019）（図2A）。
ピエロン腎炎による発現のこの増加をさらに評価するために、我々は同じものに対してイムノブロット分析を行った。肝臓HD5ペプチド産生の同時増加を評価するためのリアルタイムPCR分析に使用される組織（図2B、中央のパネル）。ポリクローナルHD5抗血清を使用した免疫ブロット分析は、腎盂腎炎の腎臓組織で有意に高いHD5ペプチド産生を示しました（n {{5} }）非感染と比較肝臓組織（n=6）。 感染していない肝臓組織は300625ngHD5/グラムウェットティッシュ重量を表現しました肝臓腎盂腎炎を伴う組織は、6 0 0621 ng HD5 /グラムのウェットティッシュ重量（p、0.0001）を発現しました。 ブロットをGAPDHで再プローブしてローディングコントロールとして使用し（図2B、中央のパネル）、銀染色を行ってタンパク質のローディングが等しいことを確認しました（図2B、上部のパネル）。
HD5ペプチドは、人間の腎臓と尿路全体で生成されます
尿路におけるHD5産生を局在化するために免疫染色を行った。 免疫組織化学（IHC）は、HD5免疫反応性が、調査したすべての検体の尿管および膀胱の尿路上皮全体に存在することを示しました（n=4、図3）。IHCは、HD5が腎皮質の尿細管およびすべての髄質で産生されることも示しました。標本（n=6、図4）。 蛍光抗体法（IF）は、HD5の発現が遠位ネフロンと収集尿細管で最大であることを示しました（図5）。 間質と糸球体はHD5免疫反応性を示さなかった。 図3、4、および5に示す免疫染色は、HD5プロペプチド（Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を認識するマウスモノクローナル抗HD5抗体（8C8）を使用して実施しました。 HD5プロペプチドと成熟ペプチドを認識するウサギポリクローナル抗HD5抗体を使用した場合の結果も同様でした（データは示していません）。これは、HD5がプロペプチドとして保存されていることを示しています。
腎盂腎炎では、HD5免疫染色が著しく増加しました。HD5免疫反応性は、近位ネフロン、遠位ネフロン、および収集尿細管全体で増加しました（図4および図5）。 感染していない検体と同様に、糸球体と間質は感染を伴うHD5発現を示さなかった。 ネガティブコントロールはHD5免疫反応性を示さなかった。
感染したヒトの尿には、測定可能な濃度のHD5ペプチドが含まれています
前駆体proHD5を検出するウサギポリクローナル抗血清を使用したイムノブロット分析およびさらに処理された形態により、尿路病原性大腸菌に感染した15の試験尿サンプルのうち13で測定可能なレベルのHD5が同定されました（図6AおよびB）。 存在する場合、尿クレアチニンに正規化されたHD5レベルは、299.8〜669.7630 ng HD5 / mg尿Cr（110.67 ng / mL〜276.67 ng / mL）の範囲であり、これは11.10〜27.67 nmol/Lに相当します。 感染していない尿サンプル（n=15）、HD5は検出限界（、50 ng）以下でした。 前駆体proHD5のみを検出するマウスモノクローナル抗体（8C8）を使用した、同じ尿サンプルでの酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、テストした15の感染サンプルのうち13で測定可能なレベルのproHD5を検出しました。 尿中proHD5濃度は、存在する場合、122.78〜490.060.03 ng HD5 / mg尿中Cr（30.02 ng / mL〜200.5 ng / mL）の範囲でした（図7）。
討論
この研究では、ヒトにおけるHD5の初期特性評価を提供します肝臓、尿管、および膀胱。 HD5は、腸での侵襲性感染を防ぎ、感染中に生殖管でアップレギュレーションされる重要なAMPであることが示されています[11、18、19、20、21]。 HD5のような上皮由来のAMPは、尿路の不妊を維持する上で重要であることが示されています[8,22,23,24]。 これらの生来の粘膜防御の欠陥は、急性および/または慢性感染を引き起こす可能性があります[25,26]。
私たちの定量的リアルタイムPCRの結果は、DEFA5がヒトで構成的に発現していることを示しています腎臓、尿管、および膀胱。 DEFA5の発現は、尿路の流れと微生物叢の侵入点への接近の増加に続いて、上部尿路から下部尿路に向かって増加します。 私たちの知る限り、これはヒトの腎臓と膀胱におけるDEFA5の発現を定量化する最初の研究です。 最近、Townesらは、正常な遠位尿管がDEFA5を発現できることを実証しました[14]。 我々の結果はまた、DEFA5が構成的に遠位尿管によって発現されることを示唆している。 尿路でのDEFA5の発現は、胃腸組織で見られるものよりもほぼ100-倍低いですが、DEFA5の基底尿路上皮発現は、カテリシジン、hBD -1、hBDなどの前述の尿路アンプの発現に匹敵します。 -2、およびリボヌクレアーゼ7[6,8,22,24,27]。
健康状態と感染/炎症の両方の状態でDEFA5が高レベルで発現する成熟した消化管とは対照的に、定量的リアルタイムPCRデータは、DEFA5の発現が肝臓感染により大幅にアップレギュレーションされます[27、28、29]。 この誘導可能な発現パターンは、女性の生殖管におけるDEFA5の発現に類似しており、DEFA5の発現は唾液腺炎とともに増加します[30]。 尿路では、Townes et alは、回腸導管尿路変更術を受けたUTI患者においてDEFA5の尿管発現が増加する傾向を示しています[14]。
私たちのイムノブロット分析は、腎盂腎炎とともにHD5ペプチド産生が増加することを実証することにより、リアルタイムPCRデータを補完します。 このHD5産生の誘導性パターンは、ベータディフェンシンファミリーの一部のメンバーに見られるものと類似しています。hBD2は、尿路感染症および/または慢性腎盂腎炎を伴う誘導性産生パターンを示します[8、31、32]。 HD5ペプチドの産生は、炎症を伴う女性の上部生殖管と男性の尿道で増加することが示されています[11,30]。
免疫染色を使用して、HD5が尿管と膀胱の尿路上皮全体で均一に産生されることを示します。 UTIの大部分は膀胱に上昇する糞便フローラに起因するため、これらの結果は、微生物曝露が最も頻繁に発生する場所にHD5発現が存在することを示唆しています[33]。 したがって、HD5は、上行性微生物感染を防ぐのに理想的な位置にあります。 の中に肝臓、HD5は主に遠位ネフロンと収集尿細管で生成されます。 これらの発見は、HD5が最適な抗菌活性を持つように配置される場所で生産されることを示唆しています。 以前の研究では、ディフェンシンの抗菌特性は塩濃度に依存していることが示されています。塩濃度が高いと抗菌活性が低下します[23、34、35]。 遠位ネフロンと収集細管の低塩濃度は、HD5抗菌活性に好ましい環境を提供すると推測されます。
イムノブロットおよびELISA分析は、HD5が低レベルで尿中に分泌されることも示しています。 サイズ（8.1kDaおよび3.7kDa）とproHD5および完全に処理されたHD5の正電荷を考えると、一部の尿中HD5ペプチドは、少なくとも部分的に血漿濾液に由来する可能性があります。 それでも、HD5が血漿中に持続することを示唆する証拠はほとんどありません[27]。 さらに、尿中に現れるためには、HD5は近位尿細管の効率的なペプチド吸収メカニズムから逃れる必要があります[6,36]。 最後に、使用した尿サンプルは、アッセイを実行する前に遠心分離を行い、HD5の細胞源を除去しました。
検出された濃度では、完全に処理されたHD5の最小発育阻止濃度（MIC）は、一般的なグラム陰性の尿路病原菌に対して6〜10 mg / mLであるため、尿中のHD5は尿路病原性微生物に対して直接抗菌性を示す可能性は低いです[15]。 ただし、粘膜表面濃度は高くなる可能性があります。 さらに、イムノブロット分析は、HD5濃度が肝臓。 これらの結果は、HD5が尿路の粘膜防御に関与していることを示唆しています。 同様のパターンがhBD1で見られ、hBD1の尿中濃度は抗菌活性を示すには不十分ですが、尿細管の近くでより高いペプチド濃度が検出されます[6,31]。
IHCは、proHD5がHD5の主要な形式であることを示しているため肝臓また、成熟型とproHD5の両方が尿中に検出されるため、HD5は主に前駆体分子として分泌され、次にタンパク質分解処理を受けて成熟型を生成すると推測されます。これは消化管や泌尿生殖器と同様です[11,30,37]。 小腸では、パネート細胞がトリプシンを生成します。トリプシンはHD5プロペプチドを切断するため、完全に処理されたペプチドが腸内腔の主要な形態になります[37]。 男性の尿道では、HD5の主要なプロセシングおよび活性化酵素は、感染部位に動員された好中球によって提供される好中球プロテアーゼです[11]。 感染中の尿路でのHD5プロセシングに対する上皮トリプシノーゲン、尿中トリプシン、および/または好中球プロテアーゼの寄与はまだ決定されていません。 さらに、HD5機能（浸透圧、pH、およびカチオン濃度の変化）に対する尿環境の変化の影響もまだ決定されていません。
結論として、これは尿路におけるHD5の発現と産生を特定および定量化した最初の研究です。 我々の結果は、HD5が上皮由来のAMPであり、侵入する病原体の循環への移行を防ぐヒト尿路上皮の自然免疫において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。 HD5産生を調節する要因の解明は、UTIのリスクがある患者および慢性感染症の患者におけるUTIの病因への新たな洞察を与える可能性があります。
メソッド
研究承認
この研究に参加したすべての患者から、書面による同意が得られました。 18歳未満の被験者については、書面による親/保護者の同意が得られました。 NationwideChildren's Hospital（NCH）の施設内審査委員会は、同意プロセスと文書（IRB 07-00383）とともにこの研究を承認しました。
ヒトの組織および尿サンプル
感染していない遠位尿管および膀胱組織（n=4）は、再発性感染以外の理由で尿管再移植を受けた子供から得られました。 感染していない肝臓サンプル（n=6）は、腎腫瘍のために腎摘出術を受けた患者から得られました。 組織サンプルには、病気や炎症の肉眼で見える兆候はありませんでした。肝臓慢性腎盂腎炎の患者からの組織は、Cooperative HumanTissue Network（n=6）によって提供されました[38]。 2人の独立した病理医が腎盂腎炎の組織病理学的診断を確認しました。 組織サンプルを急速凍結するか、中性のホルマリン固定パラフィン包埋切片として保存しました。 感染していない腎臓組織の切片は、保管前に皮質、髄質、または腎盂に解剖されました（n=4）。
感染していない尿と感染した尿のサンプルは、NCH救急科または腎科クリニックに来院した子供たちから入手しました。 UTIの診断は、American Academy ofPediatricsGuidelines[39]に従って陽性の尿培養によって行われました。 感染した尿サンプルはすべて、.106 CFU/mLのE.coliでした。 尿のpH値は5.5から8.5の範囲でした（平均尿6.9）。 尿中イオン組成は測定されませんでした。 尿サンプルを遠心分離して尿沈殿物を除去し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加しました（Thermo Scientific、ロックフォード、イリノイ州、米国）。
リボ核酸の単離と逆転写
全RNAは、PromegaTotal RNA Isolation System（Promega、Madison、WI、USA）を使用して凍結組織から分離されました。 ForcDNA合成では、サプライヤーのプロトコル（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）に従って、オリゴ-（dT）12-18プライマーを使用してSuperscript III逆転写酵素で4〜8mgのトータルRNAを逆転写しました。
標準曲線のための遺伝子特異的プラスミドのクローニング
DEFA5およびGAPDHをコードするcDNAは、メーカーの指示に従って4- Topoプラスミドベクター（Invitrogen）にクローニングされました。 プラスミドの配列を決定して、正しいことを確認しました
構築物が得られた。 遺伝子特異的プラスミドの段階希釈を定量し（260での分光光度吸光度および臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動により）、リアルタイムPCRで使用して、各反応の標準曲線を作成しました。
定量的リアルタイムPCR
定量的リアルタイムPCRは、ヒトからの一本鎖cDNAを使用して実行されました肝臓、尿管、および7500リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を使用した特定のオリゴヌクレオチドプライマーペアを持つ膀胱組織PCRエキソンジャンクションスパニングプライマーを設計し、DNAstarH Laser Gene SeqBuilder（DEFA5フォワードプライマー）を使用して配列を確認しました：59- TCC CTC CTG CAG GTG ACCCCA-39およびDEFA5リバースプライマー59-GTGGCT CTT GCC TGA GAA CCT GA -39）。
簡単に説明すると、1 0 ng RNAに対応するcDNAは、2。0mMの各プライマーと16Light-Cycler-Fast Start DNA MasterSYBRGreenミックスを含む25ml反応でテンプレートとして機能しました。 PCR条件は、95uCで10分間の初期変性、続いて40サイクルで、各サイクルは94uCで30秒間の変性、64uCで30秒間のアニーリング、72uCで30秒間の伸長で構成されていました。 サイクルごとの蛍光発光を530nmでモニターし、7500Software V2.0.3（Applied Biosystems）を使用して分析しました。 遺伝子特異的プラスミド標準は、すべての反応セットに含まれていました。 ポジティブコントロールとして、回腸末端RNAを各反応セットに含め、結果を以前に発表された標準と比較しました[27]。
目的の産物のPCR増幅を確認するために、代表的なサンプルを1.5％アガロースゲルでの電気泳動によって分析しました。 臭化エチジウム染色により生成物を可視化し、DNAサイズ標準と比較して、予想される生成物サイズを確認しました（図示せず）。 さらに、すべてのPCR反応の融解温度プロファイル曲線が各反応の最後に決定されました。
HD5抗体
HD5プロペプチド（AA 20-94）および部分的に処理された形態（AA 36-94および56–94）は、市販のマウスモノクローナル（8C8）抗HD5抗体（Abcam）を使用して同定されました。HD5プロペプチドおよび成熟ペプチド（AA 63-94）は、前述のウサギポリクローナル抗血清を使用して同定されました[13,40]。
イムノブロット
同じのセクション肝臓定量的リアルタイムPCR分析に使用される検体（湿重量3〜6 mg）は、液体窒素中の乳鉢と乳棒を使用して粉砕され、プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーに溶解されました。 ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit（Norgen Biotek Corporation、Thorold、ON、Canada）を使用して、尿タンパク質を尿サンプルから抽出しました。 腎臓と尿のタンパク質濃度は、修正されたブラッドフォードアッセイを使用して定量化され、anOD280nmの読み取り値を使用して確認されました。 等濃度の腎臓組織または尿タンパク質を18％ドデシル硫酸ナトリウム勾配ゲルにロードし、電気泳動にかけました。 タンパク質の負荷を均等にするために、銀染色を行いました。
電気泳動分離後、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写しました。 TBS中の0.05％グルタルアルデヒドで固定した後、膜を5％無脂肪ミルクで30〜60分間ブロックし、ウサギポリクローナルHD5抗血清の1：1、000希釈液で一晩インキュベートしました。 。 洗浄後、1：10に希釈した抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG 000（Cell Signaling Technology、Danvers、MA、USA）を室温で1時間適用しました。 からの免疫ブロット肝臓組織はまた、抗GAPDH抗体（Sigma Aldrich）で室温で2時間プローブされ、次に上記の二次抗体とインキュベートされました。 タンパク質は、ECL検出システムと化学発光フィルムを使用して、製造元の指示（BioExpress、Kaysville、UT、USA）に従って視覚化されました。
得られたバンド強度を組換え標準proHD5タンパク質（Peptides International、Louisville、KY、USA）の段階希釈と比較することにより、HD5を定量しました。肝臓HD5濃度は、ウェットティッシュの重量に対して標準化されました。 尿中HD5濃度を尿中クレアチニンで割って、尿の希釈を考慮した標準化された尿中HD 5-対クレアチニン比（mg / mg）を確立しました。 尿中クレアチニン濃度は、Oxford Biomedical Researchクレアチニンマイクロプレートアッセイ（Rochester Hills、Michigan、USA）を使用して決定しました。
免疫組織化学
脱パラフィン、再水和、および抗原回復に続いて、ビオチンブロックおよび無血清タンパク質ブロックを実施しました（Superblock、ScyTek Laboratories、米国ユタ州ローガン）。 スライドを、モノクローナルマウスHD5（8C8）抗体（1：2 {{1 0}} 0; Abcam）またはウサギポリクローナル抗血清（1：500）とともに、4uCで一晩インキュベートした後、抗多価ビオチン化抗体を成人化しました。ストレプトアビジン/HRP（ScyTekLaboratories）。 切片は、0.02パーセントの過酸化水素を含む0.1パーセントのジアミノベンジジンテトラクロリドを使用して開発され、ヘマトキシリンで対比染色されました。 ネガティブコントロールセクションは、HD5抗体の代わりに非免疫血清とともにインキュベートされました。
免疫蛍光
二重標識免疫蛍光抗体法を実施して、HD5発現の局在化を支援しました。肝臓。 集合管は、ヤギポリクローナル抗ヒトアクアポリン-2抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）で主要細胞を二重標識しました[41]。 ヘンレループはマウスポリクローナル抗ヒトウロモジュリン抗体（Sigma-Aldrich）で二重標識され、近位尿細管はヤギポリクローナル抗ヒトアクアポリン-1（Santa Cruz）で二重標識されました[41,42]。 ローダミンロバポリクローナル抗ヤギ（Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA、USA）、ローダミンヤギ抗マウス（JacksonImmunoResearch Laboratories）、およびFITCロバポリクローナル抗ウサギ（Santa Cruz）が二次抗体として機能しました。
すべてのセクションは、上記のように準備されました。 それらは、HD5（1：200）（Abcam）、AQP -2（1：500）、ウロモジュリン（1：500）、AQP -1（1：400）に対するマウス抗血清の混合物と室温でインキュベートされました。 90分間の温度。 二次抗体を室温で90分間適用し、DAPIを含む封入剤を使用して切片を封入しました。 非免疫血清を陰性対照として使用した。 スライドをaLeicaDM4000B顕微鏡で検査し、Spot RTカメラ/ソフトウェア（Diagnostic Instruments、SterlingHeights、MI、USA）を使用してデジタル写真を撮りました。
ELISA
Link Biotin Antibody Labeling Kit、Novus Biologicals）マウスモノクローナル抗体を室温で2時間、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（Biolegend、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）を30分間添加しました。 TMB基質溶液と15分間インキュベートした後（Kem-En-Tec Diagnostics）、STOP溶液（Cell Signaling Technology、Danvers、MA、USA）で反応を停止し、450nmの波長で読み取りました。 ELISAアッセイからのHD5濃度を尿クレアチニンで割って、標準化された尿HD 5-対クレアチニン比（mg / mg）を確立し、上記のように尿希釈を説明しました。
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