高血糖はマクロファージとその前駆体に訓練された免疫を誘導し、アテローム性動脈硬化を促進する

バックグラウンド：

糖尿病の心血管リスクは、血糖降下療法にもかかわらず高いままです。 高血糖がマクロファージの訓練された免疫を誘発し、永続的なアテローム形成促進特性を促進すると仮定しました。

また、さまざまな文献で、カンカという植物が免疫力向上に大きな効果があることも知りました。 カンクンは、幅広い免疫調節機能を持つ伝統的な漢方薬です。 因子の放出、免疫器官の機能の改善、および人体の免疫力を高めるその他の方法。 したがって、人々は日常生活の中でカンカを適度に食べることで免疫力を高め、さまざまな病気を予防および治療することができます.

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方法:

対照マウスおよび糖尿病マウスの骨髄由来マクロファージを生理的グルコース (5 mmol/L) で増殖させ、RNA シーケンス (n=6)、トランスポザーゼ アクセス可能なクロマチン シーケンスのアッセイ (n=6) にかけました。 ）、および高血糖誘発性訓練免疫の決定のためのクロマチン免疫沈降シーケンス（n=6）。 糖尿病を有する(n=9)または糖尿病を有さない(n=6)マウスから(正常血糖)Ldlr -/- マウスへの骨髄移植を使用して、インビボでのその機能的重要性を評価した。 高血糖誘発性の訓練された免疫の証拠は、対照被験者 (n=16) と比較して、糖尿病患者 (n=8) のヒト末梢血単核細胞、およびレーザー キャプチャー マイクロダイセクションによって切除されたヒト アテローム性動脈硬化プラーク マクロファージで求められました。 .

結果：

マクロファージでは、高細胞外グルコースは、解糖依存メカニズムを介して、炎症誘発性遺伝子の発現とアテローム形成促進の機能特性を促進しました。 糖尿病マウスの骨髄由来マクロファージは、生理的グルコースで培養した場合でもこれらの特性を保持しており、高血糖によって誘発された訓練された免疫を示しています。 糖尿病マウスから（正常血糖）Ldlr -/- マウスへの骨髄移植は、大動脈基部アテローム性動脈硬化症を増加させ、訓練された自然免疫の疾患関連で持続的な形態を確認した。 造血幹細胞および骨髄由来マクロファージのトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン、クロマチン免疫沈降、および RNA シーケンス解析の統合アッセイにより、糖尿病における炎症誘発性プライミング効果が明らかになりました。 開いたクロマチンのパターンは、転写因子ラント関連転写因子 1 (Runx1) に関与しています。 同様に、2 型糖尿病患者のアテローム硬化性プラーク マクロファージと末梢白血球のトランスクリプトームは、Runx1 標的が豊富であり、ヒト疾患における潜在的な役割と一致しています。 in vitro での Runx1 の薬理学的阻害は、訓練された表現型を阻害しました。

結論:

高血糖によって誘発される訓練された免疫は、血糖値の上昇を標的とすることが糖尿病の大血管リスクを軽減するのに効果がない理由を説明し、疾患の予防と治療のための新しい標的を示唆している可能性があります。

キーワード:

糖尿病 ◼ エピジェネティクス ◼ グルコース ◼ 炎症 ◼ マクロファージ

糖尿病は、心筋梗塞を含むアテローム性動脈硬化症およびその合併症のリスクが高いことに関連しています。 集中的な血糖降下療法は、1 型糖尿病患者の血管リスクを低下させるのに効果的ですが、その効果は数年間延期され 2、一時的に血糖のコントロールから切り離されます.3 2 型糖尿病では、血糖降下は効果がないか、または急性心筋梗塞などのアテローム性動脈硬化関連の血管転帰に対する中程度の効果.

アテローム性動脈硬化症は、修飾リポタンパク質の沈着と保持、および太い動脈の壁への免疫細胞の蓄積を特徴とする慢性炎症性疾患です。 マクロファージは、アテローム性動脈硬化のすべての段階で重要であり、治療標的として広く認識されています. マクロファージは、Toll 様受容体リガンドであるリポポリサッカライド (LPS) およびインターフェロン (IFNα) に応答する炎症誘発性 (M1)、またはインターロイキン (IL )-4 ですが、生体内での機能範囲は間違いなくより複雑です.9

高血糖は、アテローム性動脈硬化の進行を悪化させ、プラークの退行を遅らせます 10。炎症誘発性遺伝子の発現の増加と、M2-関連遺伝子発現の誘導に対する抵抗性を伴います.10,11 単球とマクロファージでは、細胞のエネルギー経路は細胞と12 IL-4 に応答して、M2 マクロファージは主に脂肪酸を代謝し、酸化的リン酸化に依存します 13 対照的に、M1 マクロファージは、これらの代謝変化は、サイトカイン刺激の結果として発生しますが、マクロファージ機能も決定する可能性があります.16 さらに、最近の報告では、単球およびマクロファージ代謝の変化が好気的解糖またはメバロン酸経路の活性化を含む17,18、エピジェネティックな修飾とクロマチン構造の変化を通じて、長期の自然免疫細胞記憶（訓練免疫と呼ばれる）を誘導します.19循環訓練された単球の長期持続性は、再プログラミングによって駆動されます彼らの骨髄 (BM) 前駆細胞の.20

アテローム性動脈硬化に関する糖尿病性高血糖記憶の原因は、血糖値の上昇に反応して訓練された免疫であるという仮説を立てました。 したがって、我々は、単球およびマクロファージ機能の高血糖誘発性疾患関連変化、およびこれらの変化が正常なグルコースの回復後も持続するかどうかを判断しようとしました。 細胞機能、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、およびエピゲノミクスの研究を組み合わせて、高血糖がどのように代謝を変化させ、エピジェネティックな修飾を通じて長期的な活性化を調節するかを定義しました。 これらの変化が造血幹細胞 (HSC) レベルおよび分化したマクロファージでどのように発生するかを調べました。 機能的重要性は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルで BM 移植によってテストされ、その結果は、レーザー キャプチャー マイクロダイセクション (LCM) によってヒト末梢血およびアテローム性動脈硬化プラークから抽出されたマクロファージの尋問によって検証されます。 私たちの調査結果は、糖尿病の大血管合併症が従来の血糖降下療法に抵抗することを説明するかもしれません。

方法

データ リソース

この研究で生成されたデータは、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus に寄託されており、アクセッション番号 GSE176068 でアクセスできます。

動物

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >13.9mmol/Lを安楽死させ、組織を採取した。

細胞株

すべての細胞株は、37 度、5% CO2 で培養されました。 L929 細胞は、10% のウシ胎児血清 (FBS)、2% のペニシリン-ストレプトマイシン、および 2mmol/L のグルタミンを添加した Roswell Park Memorial Institute 培地で増殖させました。 L929 細胞を 7 ～ 8 日間、完全にコンフルエントになるまで増殖させ、ならし培地を除去し、アリコートに分割し、必要になるまで-20 度で保存しました。 皮膚由来のマウス内皮細胞を、10% FBS、2% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 2mmol/L グルタミンを含む 25mmol/L グルコース DMEM で培養しました。

BM由来マクロファージ

この研究で使用された BM 由来マクロファージ (BMDM) は、マウスの大腿骨と脛骨から BM を洗い流し、組織培養処理されていないペトリ皿に完全な 5 mmol/L グルコース DMEM (10% FBS、2% ペニシリン添加-ストレプトマイシン、および 2 mmol/L グルタミン) と、分化用の 20% の L929 細胞馴化培地。 7 日間の分化後、BMDM をポジティブに選択し、2 x 105 細胞/mL の密度で播種し、10 ng/mL 組換えマウス インターフェロン-(IFN - ; R&D Systems、英国) プラス 100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich、英国)、10 ng/mL 組換えマウス IL-4 (R&D Systems、英国)、または使用前 16 時間の培地のみのコントロール. BMDM は、さまざまな血糖条件 (最終濃度が 11 または 20 mmol/L グルコースになるようにグルコースを添加した 5 mmol/L グルコース DMEM) または浸透圧制御条件 (マンニトール; 5 mmol/L グルコース DMEM) でも同時に培養されました。プラス 15 mmol/L マンニトール)。 代謝研究は、10 mmol/L ジクロロアセテート (Sigma-Aldrich、英国) または 1 mmol/L 2- デオキシ-d-グルコース (Sigma-Aldrich、英国) の非存在下または存在下で実施されました。

HSCの分離

HSC は、MagniSort Mouse Hematopoietic Lineage Depletion Kit (ThermoFisher Scientific、英国) を使用して、マウスの大腿骨と脛骨から BM をフラッシュし、マーカーとインキュベートして系統拘束細胞 (CD3、CD4、B220、Ter119、および Gr1) を除去し、 HSC。 HSC は、100 ng/mL LPS と 10 ng/mL IFN を加えた、完全な 5 mmol/L DMEM (または示された野生型刺激の場合は 20 mmol/L グルコースまたはマンニトール) 中の 5 mL 蛍光活性化細胞選別チューブで培養しました。 - または 10 ng/mL 組換えマウス IL-1 (R&D Systems、英国) をウエスタンブロット分析の場合は 16 時間、トランスポザーゼ アクセス可能なクロマチン シーケンス (ATAC-seq) 分析の場合は 2 時間。

BMDM In Vitro 記憶モデル

マウス BM は、1、2、4、または 7 日間、5 または 20 mmol/L グルコースで上記のように BMDM に分化しました。 BMDMs は接着によって積極的に選択され、完全な 5 mmol/L DMEM に再播種され、48 時間インキュベートされて、グルコースの正規化の期間が与えられました。 BMDMs は、0.25、0.5、1、5、または 10 µmol/L Ro の非存在下または存在下で 16 時間、10 ng/mL IFN と 100 ng/mL LPS またはコントロール メディアで使用するために刺激されました。 5-3335 (Merck Millipore、英国) 遺伝子発現解析に使用する前。

マウス単球の分離

メーカーのプロトコルに従って、EasySep Mouse Monocyte Isolation Kit (Stemcell Technologies、カナダ) を使用して、末梢血からマウス単球を分離しました。 細胞を直ちに静的接着アッセイに使用した。

Seahorse XFe 96 リアルタイム ATP レート アッセイ キット

細胞外フラックス分析は、製造元の説明書に従って、BMDM (ウェルあたり 8 x 104 細胞; 動物および条件あたり 5 つの複製ウェル) で XFp RealTime ATP Rate Assay キットを使用して実行されました。 さまざまな濃度のグルコース (5 または 20 mmol/L) またはコントロール (マンニトール; 注入ポート A) アッセイ培地を注入する前に、3 つのベースライン酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定しました。 さらに 7 回の測定後、化合物オリゴマイシン (2 µmol/L; 注入ポート B) と組み合わせたアンチマイシン A (0.5 µmol/L) とロテノン (0.5 µmol/L; 注入ポート C)、XFp リアルタイム ATP レート アッセイからキットは、3 つの後続の測定で順次注入されました。 解糖によって生成された ATP の量と ATP レート インデックス (mitoATP 生成率/糖分解 ATP 生成率) は、Wave (バージョン 2.6、Agilent) で自動的に計算されました。

静的接着アッセイ

皮膚由来のマウス内皮細胞を、12- ウェル プレートのカバーガラス上でコンフルエントになるまで増殖させ、10 ng/mL の組換えマウス腫瘍壊死因子 (R&D Systems, UK) で 16 時間活性化しました。 刺激されていない、または IFN と LPS で刺激された末梢血単球 (または 5 mmol/L グルコースで培養されたストレプトゾトシン糖尿病マウスの BMDM) は、メーカーの指示に従って、PKH67 蛍光セル リンカー キット (Sigma-Aldrich、英国) で緑色に蛍光標識されました。 標識細胞を内皮細胞にカバーガラスあたり 5×104 細胞の密度で 1 時間添加した後、培地と接着していない細胞を除去し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで固定しました。 カバースリップごとに 4 つの画像が取得されました。 接着した標識細胞の数を数えた。 そして、カバースリップごとの画像が平均化されました。 表示された画像は、ImageJ で均等に明るさが調整されています。

泡沫細胞アッセイ

非刺激または刺激 (LPS プラス IFN-) BMDM を 12- ウェル プレートのガラス カバースリップ上で増殖させ、25 μg/mL DiI アセチル化低密度リポタンパク質 (LDL; Bioquote、米国) と共に 48 時間インキュベートしました。 培地と残りの DiI アセチル化 LDL を除去し、細胞を PBS で 3 回洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで固定しました。 脂質はオイルレッドOで染色され、カバースリップはDAPIマウントされました。 オイル レッド O 染色の位相コントラスト画像と核の蛍光画像を撮影し (カバースリップあたり 4 画像)、ImageJ ソフトウェアを使用して脂質の量または細胞数をそれぞれ定量化するために使用しました。 次に、画像あたりの脂質面積を画像あたりの細胞数に正規化し、結果を 5 mmol/L グルコース対照サンプル (BMDM グルコース実験の場合) および対照サンプル (糖尿病 BMDM 実験の場合) の倍数変化として表します。 表示される画像は一様に明るさ調整されています。

糖尿病BM移植実験

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13.9 mmol/L および同年齢のコントロール CD68-GFP マウスを BM ドナーとして使用しました。 ドナーマウスから BM を採取し、5×106 個の生細胞を致死量の照射 (2×500 ラド) を行った LdLr-/- レシピエント B6.129S7- Ldlr-tm1Her/J マウス (JAX ストック番号 002207) に静脈内注射しました。 ）。 移植後、すべてのレシピエント動物は、12 週間、西洋式の食事 (オープン ソース ダイエット D12079B、脂肪 1%、kcal 40%) に置かれました。 末梢血単核細胞 (PBMC) のフローサイトメトリー分析と生着レベルのモニタリングおよび白血球集団数の評価のために、生着後 4、8、および 12 週間で全血を採取しました。 移植後 4 週間ごとに評価される移植は、細胞を抗 CD45 で染色し、総 CD45 プラス集団中の CD45 プラス GFP プラス細胞の相対比率を評価することによってモニターされました。 12 週目に、マウスを安楽死させ、全血を採取し、トリグリセリド、非エステル化脂肪酸、LDL、および高密度リポタンパク質コレステロール測定のために血清を処理しました。 マウスを PBS で灌流し、続いて 4% パラホルムアルデヒドで一晩灌流および固定しました。 心臓と大動脈を解剖し、処理するまで 70% エタノールに入れました。

大動脈根プラーク分析と免疫蛍光

プラーク負荷を定量化するために、パラホルムアルデヒドで固定された大動脈根を最適な切断媒体に入れ、心房に平行な平面で切断しました。 プラーク体積、プラーク脂質含有量 21 およびコラーゲン含有量を定量化するために、大動脈起始部に均等に分布した 5 つの切片を Masson-Goldner トリクローム染色 (Merck、英国) しました。 簡単に説明すると、切片をブアン溶液で室温で 1 時間再固定し、流水で 5 分間洗浄し、製造元の指示に従って 2 回目の 70 パーセント エタノール インキュベーションからマッソン ゴールドナー染色キット プロトコルにかけました。プロトコルのタイミング。 次に、キシレンで湿ったスライドをNeo-Mountでマウントし、カバーガラスで密閉しました。 プラークの特徴は Image Pro Plus ソフトウェア バージョン 6.0 (Media Cyber​​netics、Silverspring、MD) で定量化され、データはすべてのセクションの平均として表示されました。

次に、隣接する6つの切片で免疫蛍光法を実施しました。 切片は、マクロファージ含有量について GFP (ウサギ抗 GFP、A6455、Invitrogen) またはマクロファージ マーカー ガレクチン -3 (ヤギ抗ガレクチン 3、AF1197、R&D Systems) で染色され、平滑筋細胞含有量については -actin (ウサギ抗平滑筋アクチン、ab32575、Abcam PLC)、およびエピジェネティック マーク H3K4me3 (ヒストン H3 [トリメチル K4] に対するウサギ ポリクローナル、Ab8580、Abcam PLC) および H3K27ac (ヒストン H3 [アセチル K27] に対するウサギ ポリクローナル、Ab4729、アブカム PLC)。 免疫蛍光染色のために、切片をPBSで室温で5分間再水和し、DAKOブロッキングバッファー（Agilent、UK）で1時間ブロックしました。 一次抗体をDAKOで1 μg/mLに希釈し、4℃で一晩切片に加えました。 二次抗体を DAKO で 1:200 に希釈し、室温で 1 時間添加しました (ロバ抗ウサギ [A488]、A21206、Life Technologies; ロバ抗ヤギ [A594]、A11058、ThermoFisher Scientific)。 切片は最終的に DAPI マウントされました (DAPI および DABCO を含むグリセロール マウント メディア、アブカム、英国)。 蛍光画像は、Image Jソフトウェアで分析しました。

遺伝子発現

ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）で全ＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２{{２}}００ ＵＶ可視分光光度計で定量化した。 ｃＤＮＡ合成は、製造業者の説明書に従って、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において０．２から２μｇのＲＮＡを用いて行った。 B2m (Mm00437762)、Il-6 (Mm00446190)、Il-1 (Mm00462531_ m1)、iNos に特異的な Taqman プローブを使用して、5 ng/μL の cDNA でリアルタイム定量的 PCR を実行しました。 (Mm00440502)、Ym1 (Mm00657009)、および Fizz1 (Mm00556208)。 定量的 PCR は、QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher) で UNG を含む TaqMan ユニバーサル マスター ミックス II を使用して実行されました。 すべての PCR データは、内部ハウスキーパー遺伝子発現 (B2m) に対して正規化され、2-ΔCT 法によって分析され、相対的な mRNA 発現が計算されました。

ウエスタンブロット分析

細胞を氷冷PBSで洗浄し、放射免疫沈降アッセイ溶解緩衝液(150mmol/L NaCl、1.{5}}% IGEPAL CA-630、0.5で溶解した。パーセントのデオキシコール酸ナトリウム、0.1 パーセントの SDS、50 mmol/L Tris、pH 8.0)、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤が添加されています。 タンパク質濃度は、アッセイの指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（Pierce BCA Protein Assay Kit、ThermoFisher Scientific、UK）によって決定されました。 等濃度のタンパク質をロードし、SDS-PAGE ゲル (4% ～ 12% Bis-Tris Gel、Life Technologies、UK) で泳動して分離しました。 タンパク質をニトロセルロース膜（Bio-Rad、英国）に移し、ハウスキーパーおよびローディングコントロールとしてのアクチン（マウス抗- -アクチン[15G5A11/E2]、Invitrogen）で示される特異的抗体でプローブした。 膜が開発され（SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate、Thermo Scientific、UK）、Biorad Image Stationで化学発光によって検出されました。

人間のサンプルとプラーク マクロファージの LCM 分離

すべての臨床調査はヘルシンキ宣言によって実施され、サンプルは英国のヒト組織法 (2004 年) に基づいて保管されました。 研究は関連する倫理審査委員会によって承認され、すべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 頸動脈内膜切除術を待っている患者が募集され、手術時に頸動脈プラークが新たに収集されました（患者の特徴は、データ補足のExcelファイルIにまとめられています）。 外植された頚動脈プラークは、氷冷した無菌ＰＢＳで洗浄され、最適な切断媒体で急速冷凍され、処理されるまで－８０度で保存された。

LCM は、適応した「ガイド スライド」アプローチを使用して、PALM Microbeam LCM システム (Carl Zeiss GmbH、ドイツ) で実施されました。 ガイド スライドは 3 つの連続したセクションで構成されました。最初のセクションは、微細解剖学的位置の決定を支援するために Masson-Goldner 染色キット プロトコルで染色され、次の 2 つはいずれかのマクロファージ (マウス抗ヒト CD68 [クローン KP{{7} }]、Dako、Cambridge UK) または平滑筋細胞 (マウス抗ヒト-アクチン [クローン 1A4]、Dako、Cambridge UK)。 後続のセクション (最大 15) を LCM メンブレン スライド (ThermoFisher Scientific、英国) に切り取り、すぐに処理できるようにクレシル バイオレットで染色しました。 マクロファージ細胞クラスターは、PALM RoboSoftware（バージョン4.5、Carl Zeiss GmbH、ドイツ）を使用したガイドスライド染色に基づいて手動で識別されました。 Zeiss PALM AdhesiveCap (Carl Zeiss GmbH、ドイツ) で、3 ～ 5 x 106 µm2 の合計関心領域をレーザーでキャプチャしました。 製造業者のプロトコルに従って、細胞を直ちに溶解し、ドライアイス上で急速冷凍し、RNAがRNEasyマイクロキット（Qiagen、UK）で抽出されるまで-80度で保存しました。

ヒトプラークマクロファージマイクロアレイ

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5は、RNA増幅、ビオチン化、および遺伝子発現マイクロアレイ分析に進められました。 これらのサンプルは、さらなる処理のためにCambridge Genomic Services (英国ケンブリッジ大学病理学科) に提出されました。 増幅とビオチン化は、Ovation Pico WTA V2 キット (Nugen Technologies Inc、米国) を使用して実行され、その後、2 つの Illumina Human HT12 v4.0 BeadChip (Illumina、米国) でランダムな順序でハイブリダイゼーションを変更して、バッチを最小限に抑えました。 /チップ変動。 Illumina BeadArrays は、Bioconductor ビーズ アレイ パッケージ (バージョン 2.24.0)24,25 で通常の指数正規化を使用して処理されました。 プローブ セットは、極端な値を回避するために、最大四分位範囲に基づいて遺伝子ごとに折りたたまれましたが、すべてのサンプルにわたる変動性を捉えました。 注釈のないコントロールプローブセットは、さらなる分析から除外されました。 21036 遺伝子の最終リストの発現差 (DE) は、Bioconductor limma パッケージ (バージョン 3.30.13)26 で評価され、糖尿病患者と対照患者を比較し、症候性/無症候性状態を調整しました。 直交データセットとグループごとに 8 つのサンプルが利用可能であることを考慮して、P の比較的寛大な調整値を使用しました。<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

ヒト単球の分離

末梢静脈血 (15 ～ 20 mL) は、K2- EDTA でコーティングされたチューブ (BD Vacutainer、ニュージャージー州) で健康なドナーから採取され、1 時間以内に処理されました。 製造元の指示に従って、Accuspin Histopaque-1077 カラム (Sigma-Aldrich、米国) で全血を遠心分離することにより、血漿および単核細胞に富む画分を得ました。 単核細胞が濃縮された画分は、製造元の説明されたプロトコルに従って、ネガティブ選択ビーズ分離キット (CD16 枯渇なしの EasySep ヒト単球濃縮キット、StemCell Technologies、カナダ) を使用して単球分離に使用されました。

ヒト末梢血単核細胞の分離と刺激

ストックホルムのカロリンスカ研究所（2011/1002-31/1 and 2009/1881-31/1）で地方および地域の倫理的承認を得た後、糖尿病患者と対照患者が臨床研究のために募集されました。 製造元の指示に従って、SepMate (StemCell Technologies) および Lymphoprep (StemCell Technologies) で一晩絶食させた後に収集した末梢血サンプルから PBMC を分離しました。 分離した PBMC を凍結し、90% FBS と 10% ジメチルスルホキシドで保存しました。

保存した PBMC を解凍し、遠心分離 (500g で 10 分間) により PBS で洗浄し、生存細胞を計数し、生理的 (低) グルコース DMEM、10% FBS、2 中の 12- ウェル組織培養プレートの個々のウェルにプレーティングしました。 mmol/L l-グルタミン、および 1 パーセントのペニシリンとストレプトマイシン。 ＰＢＭＣを一晩休ませ、ＰＢＳビヒクルまたは１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳおよび１０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＦＮ－（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で６時間処理した。 刺激後、ＰＢＭＣをＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ）に溶解し、急速冷凍し、－８０℃で保存した。 記載されているように、ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）に供した。

メタボロミクスと代謝物測定

単離されたヒト単球は、最終濃度が 20 mmol/L グルコースとなるようにグルコースを補充した培地で、完全な 5 mmol/L グルコース DMEM 中、サンプルあたり 3.5 x 105 細胞の密度で培養されました。 、または 15 mmol/L マンニトールを含む培地を 5 mL 蛍光活性化細胞選別チューブに 12 時間入れます。 ドライアイス上で氷冷メタノールで２０分間抽出することにより細胞溶解物を調製し、液体窒素中で瞬間凍結した。 分析当日、サンプルをボルテックスし、10 000 g で 10 分間、4 ℃ で遠心分離しました。 プールされた品質管理サンプルは、各サンプル抽出物 60 µL を混合して調製し、分析実行全体を通して定期的に分析して、メソッドの性能を確認しました。 サンプルを 0.1- µm Ultrafree-MC 遠心フィルター (5000g、3 分) でろ過し、液体クロマトグラフィー - 質量分析バイアルに移しました。 非標的メタボロミクス分析は、前述のように実行されました.27 簡単に言えば、70000 の質量分解能で動作する極性切り替え (正負) 取得を使用して、Q-Exactive Orbitrap に接続された Thermo Ultimate 3000 超高速液体クロマトグラフィーでサンプルを分析しました。半値全幅。 親水性化合物は Merck Sequant ZIC-HILIC カラム (150×4.6 mm、粒子サイズ 5- µm) でクロマトグラフィー分離し、疎水性化合物は Thermo Accucore aQ RP C18 カラム (150×2.1 mm、2.{{38 }} µm 粒子サイズ）。 代謝物は社内データベースを使用して同定されました。

BMDM および HSC 代謝産物の測定では、細胞を前述のように 1 ウェルあたり 5 x 105 の密度で培養し、培養上清を ABX Pentra 400 (Horiba) で実行してグルコースを測定しました (ABX Pentra Glucose PAP CP、Horiba、UK)。および乳酸（ABXペントラ乳酸）レベル。 測定値は、細胞の存在下ではなく同じ条件下でインキュベートされたコントロールの完全な細胞培養培地に存在するグルコースおよび乳酸の濃度に対して正規化されました。 メーカーの指示に従って、BMDM細胞溶解物を使用してコハク酸レベルを測定しました（Succinate Assay Kit、Abcam、UK）。

ATAC-seq分析

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 bp。 DNA 濃度は Qubit 蛍光光度計 (Life Technologies) で測定し、ライブラリーのサイズ分布は Bioanalyser DNA HighSensitivity Chip (Agilent、英国) で評価しました。 ライブラリーの増幅は、カスタム Nextera プライマーを使用して実行されました。

読み取りの品質を管理し、残りのアダプターをトリミングしました。 次に、読み取りは、「センシティブ ローカル」モードで Bowtie (バージョン 2.2.6) を使用してマウス ゲノム (Mm10) にアラインされました。 アラインされた読み取りをフィルタリングして、低品質の一致 (マッピング品質が 10 以下) またはミトコンドリア配列にマッピングされた読み取りを削除しました。 アラインメント開始位置は、MACS2 (バージョン 2.1.129) でのピーク呼び出しの前に、ストランドを意識した方法 (4 bp、-5 bp、28) でシフトされました。 DiffBind (バージョン 2.4.830) とピーク中心 (summits=100) および edgeR.31 を使用して、異なる結合領域を特定しました。

次に、ゲノム領域濃縮アノテーション ツール (バージョン 3.0).32 次に、異なるピーク領域を MEME-クロマチン免疫沈降 (ChIP; バージョン 4.12.0) で分析し、33 包括的なモチーフ分析を実行して、濃縮された既知または未知の結合モチーフを特定します (濃縮モチーフE<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

ラント関連転写因子 1 ターゲットの同定

ATAC-seq 領域の MEME-ChIP により、ラント関連転写因子 1 (RUNX1) が IL-1 と刺激されていない糖尿病 HSC の両方の潜在的な調節因子として同定されました。 MEME GOMo (バージョン 4.12.0)33 を使用して、コンセンサス RUNX1 モチーフ (MA002.2) についてマウスおよびヒトのプロモーター (-1000、プラス 200) をスキャンしました。 Gene Ontology エンリッチメント分析に加えて、GOMo はターゲットとして識別された遺伝子のリストを返します。 これらのヒットは、経験的なP値を持つマウスとヒトの両方に結合した保存されたプロモーターに制限されていました<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

RNA-seq解析

5 mmol/L で培養し、LPS と IFN- で 6 時間刺激したコントロールまたは糖尿病の BMDM (n=6)、または刺激していないコントロール細胞を RNA-seq 解析に使用しました。 簡単に言えば、製造元の指示に従って、mirVana mRNA / miRNA Isolation Kit（ThermoFisher Scientific、UK）でRNAを分離しました。 総 RNA の量は Qubit Fluorometric Quantitation システム (Life Technologies) で定量化され、RNA の完全性数は Experion Automated Electrophoresis System (Bio-Rad) で決定されました。 RNA-seq ライブラリーは、TruSeq Stranded mRNA LT サンプル調製キット (Illumina、英国) を使用して、Sciclone および Zephyr 液体処理ロボット (PerkinElmer、英国) の両方を使用して調製しました。 ライブラリー濃度は Qubit Fluorometric Quantitation システム (Life Technologies、英国) で定量化され、サイズ分布は Experion Automated Electrophoresis System (Bio-Rad、米国) で評価されました。

配列決定のために、サンプルを等モル量で希釈してプールし、CeMM の Biomedical Sequencing Facility によって 50- bp シングルリード構成で Illumina HiSeq 3000/4000 機器で配列決定しました。 Illumina Real-Time Analysisソフトウェアによって提供されるベースコールは、その後、Illumina2bamツール（1.17.3）を介して個々のサンプル固有のバイナリアライメントマップファイルに逆多重化（BamIndexDecoder）する前に、バイナリアライメントマップ形式（Illumina2bam）に変換されました。 ライブラリは、CeMM の Biomedical Sequencing Facility によって調製および配列決定されました。

Gencode (バージョン M16) 注釈付きの遺伝子カウント モード (quantMode GeneCounts) で STAR (バージョン 2.5.3a34) を使用して、読み取りをマウス ゲノム (GRCm38/ mm10) に合わせました (介在遺伝子の重複を避けるためにメガ トランスクリプト Gm20388 を削除しました)。 カウントを R (バージョン 3.3.3) にロードし、edgeR (バージョン 3.16.535) で分析しました。<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5 は DE と見なされました。 DE テーブルと遺伝子リストは、データ補足の Excel ファイル II (未刺激) およびデータ補足の Excel ファイル III (LPS および IFN 刺激) として含まれています。 edgeR 関数 cpm を使用して、ヒート マップおよびその他のプロットのカウント (データ補足の Excel ファイル IV) を対数正規化しました。 ヒート マップは、R パッケージ ヒートマップ (バージョン 1.0.836) で生成されました。 糖尿病患者におけるＤＥ遺伝子中のＲＵＮＸ１標的遺伝子分析の過剰発現は、対照ＬＰＳ＋ＩＦＮ−サンプルと比較して、ヒトアレイデータについて以前に記載されたように実施された。

ChIPシーケンシング

合計 1×106 細胞/mL を 1 % ホルムアルデヒドで室温で 10 分間固定し、PBS で洗浄し、-80 度で保存しました。 製造元の推奨に従って、細胞を Chromatin EasyShear Kit–Low SDS (Diagenode、ベルギー) でせん断し、Bioruptor Pico 超音波処理装置 (カタログ番号 B01080010、Diagenode、ベルギー) で超音波処理しました。 MAGnify クロマチン免疫沈降システム (Thermo Scientific) を使用して、抗ヒストン H3 (トリメチル K4; ab8580) または抗ヒストン H3 (アセチル K27; ab4729) を使用してクロマチン フラグメントを選択しました。 配列決定ライブラリーは、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit を使用して製造元の指示に従って調製しました。 手短に言えば、精製されたChIPまたは入力DNAを末端修復し、Aテールにした後、アダプターライゲーションを行いました。 アダプターを連結した DNA は、SPRI Ampure XP ビーズ (Agencourt) を使用してサイズを選択し、イルミナ対応のシーケンシング プライマーを使用して濃縮しました。 最終ライブラリーは SPRI Ampure XP ビーズで精製してアダプター二量体を除去し、CeMM の Biomedical Sequencing Facility で Illumina HiSeq 3000/4000 プラットフォームと 50- bp シングルリード構成を使用して配列決定しました。

バイオインフォマティクス

刺激を受けていない BMDM におけるクロマチンの開放性と遺伝子発現との関係を調べるために、糖尿病と対照の ATAC-seq ピーク (log2 倍の変化) および近接遺伝子の mRNA レベル (log2 倍の変化) をピアソン線形相関によって比較しました。

ATAC-seq、H3K4me3 ChIP-sequencing (ChIPseq)、および H3K27ac ChIP-seq 実験からの読み取りは、Integrative Genome Browser を使用して代表的なサンプルで視覚化されました。トラックの高さは、読み取り深度の体系的な違いを説明するために、実験および細胞の種類ごとにスケーリングされます。

統計分析

すべての非配列決定データの統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアで実行されました。 データは、Shapiro-Wilk正規性検定によって正規分布について分析されました。 2 つのグループ間の比較は、2- スチューデント t 検定または正規分布または非正規分布データのマンホイットニー U 検定によってそれぞれ計算されました。 複数のグループ間の比較は、ボンフェローニ事後補正を使用した1-方法または2-方法のANOVA分析によって計算されました。 データは、正規分布データの場合は平均±SD、非正規分布データの場合は中央値±四分位範囲として報告されます。 いくつかの複製およびその他の統計の詳細は、図の凡例に記載されています。 in vivo および in vitro 実験の両方で、n は個々の動物または個々の健康なボランティアまたは患者の数です。 倍数変化は、平均試験条件値を平均対照値で割った値として計算されます。

結果

糖尿病性高血糖は細胞代謝を変化させ、炎症誘発性遺伝子の発現と機能を促進する

好気性解糖は炎症誘発性 (M1) 遺伝子発現を増加させ 37、高血糖は M1- 関連遺伝子発現も促進します 10,11 したがって、細胞外グルコースが高いと解糖が促進され、マクロファージの M1 表現型への分極が促進されるという仮説を立てました。 .

初代ヒト単球のメタボローム解析は、高細胞外グルコース (20 mmol/L) が、浸透圧が一致した生理学的グルコース (5 mmol/L) 条件と比較して代謝プロファイルをシフトすることを示しました。 経路分析 (図 1A) は、高グルコースがトリカルボン酸サイクル (FDR、0.002) およびピルビン酸代謝 (FDR、0.005) の有意な変化を引き起こすことを明らかにし、コハク酸、リンゴ酸の増加 (図 1B)、乳酸、およびピルビン酸 (図 1C) レベルを、代謝物セットの濃縮分析 (図 1D) でそれぞれ示し、ワールブルグ効果 (FDR、0.04) を強調しています。

図 1. 高グルコースは細胞代謝を変化させます。 代謝経路分析。 (B) コハク酸、リンゴ酸、(C) 乳酸およびピルビン酸、(D) ヒト単球細胞ライセート メタボロミクス サンプル (n=5) の代謝物セット濃縮分析 (Metaboanalyst) の個々の測定値。 マウス骨髄由来マクロファージの細胞外フラックス分析 (Seahorse bioanalyzer; n=6 個の動物) は、さまざまな細胞外グルコースに応答して、(E) 細胞外酸性化率 (ECAR) および (F) 酸素消費率 (OCR) を測定しました。浸透圧制御（マンニトール）、および代謝阻害剤注射。 高グルコース (G) は解糖系 ATP (glycoATP) 産生を増加させ、(H) ATP 速度指数 (ミトコンドリア ATP 産生率/糖 ATP 産生率) を低下させ、より解糖系の表現型へのシフトを示しています。 データは、（BおよびC）2-ウェイANOVAまたは（E–H）1-ウェイANOVAとボンフェローニ事後検定によって分析されました。 示されているすべてのデータは平均値±標準偏差です。 AU は任意の単位を示します。 FDR、誤検出率。 TCA、トリカルボン酸。 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

高グルコース (20 mmol/L) に応答した、より解糖 (および酸化が少ない) 表現型がマウス BMDM で確認され、細胞外酸性化速度の増加、解糖 ATP 産生の増加 (2- 倍; P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

この解糖速度の増加は、解糖ジクロロアセテートの阻害剤によって妨げられました (データ補足の図 Ia および Ib)。

BMDM では、高グルコースはどちらも炎症誘発性 M1- 関連 Il-6 の発現を促進しました (2.7- 倍; P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

図 2. 高グルコースはマクロファージ遺伝子の発現と機能を変化させます。 M1 (リポ多糖 [LPS] プラス インターフェロン [IFN-] 刺激) 骨髄由来マクロファージ (BMDM) (A) Il-6 および (B) は、ジクロロ酢酸 (DCA) の存在下または非存在下での遺伝子発現です。 M2 (インターロイキン -4 刺激) BMDM (C) Ym1 および (D) Fizz1 遺伝子発現。 A ～ D、定量的ポリメラーゼ連鎖反応データは B2m 発現に対して正規化されています。 n=7 から 10。E、内皮細胞へのマウス単球接着の画像定量化 (n=5)。 F、画像あたりの細胞数によって正規化された、BMDMによるアセチル化低密度リポタンパク質の取り込みの画像定量化。 代表的な (G) 蛍光 PKH67- 標識マウス単球の内皮細胞への静的接着画像、および (H) オイルレッド O (ORO) および DAPI 染色泡沫細胞画像。 すべてのデータ (A ～ H) は平均±SD として示されています。 (A–D) 1- ウェイ ANOVA または (E および F) 2- ウェイ ANOVA と Bonferroni 事後分析。 各ポイントは、個々 の動物 (静的な接着と泡沫細胞形成の 4 つの画像の平均) を表します。 AU は任意の単位を示します。 NS は有意ではありません。 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

炎症の促進に対するその影響を考慮して、次に、高細胞外グルコースがアテローム発生に関連する単球およびマクロファージの機能を変化させるかどうかをテストしました.<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

糖尿病マウスの BM 由来細胞は、高血糖によって誘発される訓練された免疫を示す

次に、糖尿病のマウスモデルを使用して、グルコースの正常化後でも、高血糖がマクロファージに持続的な炎症性変化を引き起こすかどうかをテストしました。 非糖尿病の年齢が一致したコントロールマウスと、高血糖がストレプトゾトシンによって誘発され、in vivoで6週間維持された同系糖尿病マウスからBMを取得しました（データ補足の図IIIa〜IIId）。 細胞は、生理的グルコース (5 mmol/L; 図 3A) の下で BMDMs に分化しました。 刺激後、糖尿病マウス由来の BMDM は、M1- 関連 Il-6 遺伝子発現の増強を示した (4.1- 倍; P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

図 3. 糖尿病マウスの骨髄 (BM) 由来マクロファージ (BMDM) は、遺伝子発現において高血糖記憶を示します。 A、糖尿病および対照 BMDM プロトコルの概略図 (n=10–12)。 (B) Il-6 の M1 遺伝子発現解析 (P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

さらに、活性化された内皮への接着が増加しました (6.3- 倍; P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

図 4. 糖尿病マウスの骨髄由来マクロファージ (BMDM) は、グルコースの正常化にもかかわらず機能の変化を示します。 糖尿病マウスの BMDM は、5 mmol/L (n=5–8) で区別されました。 A、内皮細胞への BMDM 接着の画像定量化 (n=8)。 B、画像あたりの細胞数によって正規化された、BMDMによるアセチル化低密度リポタンパク質の取り込みの画像定量化。 代表的な (C) 内皮細胞への蛍光 (PKH67) 標識 BMDM の静的接着画像、および (D) Oil Red O (ORO) および DAPI 染色泡沫細胞画像。 すべてのデータは平均値±SD として示され、各点は個々の動物を表します (静的接着と泡沫細胞形成の 4 つの画像の平均)。 データは、ボンフェローニ事後検定を用いた 2- 方法の ANOVA によって分析されました。 IFN- はインターフェロンを示します。 LPS、リポ多糖。 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

高血糖誘発性の訓練された免疫がアテローム性動脈硬化を促進する

したがって、アテローム性動脈硬化症における高血糖誘発性の訓練された免疫の機能的重要性をテストするために、正常血糖コントロールまたはストレプトゾトシン誘発糖尿病ドナーマウス（血糖、33.9±6.9mmol / L）からBMをアテローム性動脈硬化症を起こしやすい（正常血糖）Ldlr-/に移植しました。 - レシピエントマウス (図 5A)。 いずれの場合も、ドナーマウスは、ヒト CD68 プロモーターの制御下で GFP のトランスジェニックでした.40 PBMC のフローサイトメトリー解析により、効果的で同等の生着が示され、CD45 プラス GFP プラス CD11b または Ly6C のいずれかに陽性の細胞の存在が確認されました (データ補足の図 IVa および IVb)。 西洋型の食事で 12 週間後、血中脂質測定値 (データ補足の図 IVc および IVd) またはフローサイトメトリーで評価した白血球サブセット (データ補足の図 IVe) に差はありませんでした。

糖尿病性 BM を受けたマウスはアテローム性動脈硬化症の著しい増加を示し、大多数は非糖尿病性レシピエントの最大のアテローム性動脈硬化負荷を超えていました (プラーク面積の中央値、44461 µm2 [四分位範囲、18368–59597 µm2] 対 79809 µm2 [44745–177740 µm2] ; マン・ホイットニー、P=0.036)。 これらのマウスは、プラークのマクロファージ含有量の増加も示しました (P=0.052; データ補足の図 V)、脂質に富む壊死コア領域 (2.8- 倍、P{{18 }}.0076; データ補足の図 VIa)、脂質に富む壊死核の割合 (2.4-fold、P=0.046; データ補足の図 VIb)、しかしなしコラーゲン含有量（プラークパーセント; データ補足の図 VIc および VId）または平滑筋細胞（プラークパーセント; データ補足の図 VIe および VIf）の違い。

HSC における高血糖誘発性の訓練された免疫は、エピジェネティックな再プログラミングにつながる代謝の変化によって駆動される

高血糖マウス由来の BM がアテローム性動脈硬化を促進するという実証と、in vitro で BMDM に見られる持続的な炎症誘発性遺伝子発現および機能的応答を考慮して、この記憶は BM 由来細胞における訓練された免疫の発現であると推論しました。 訓練された免疫は、H3K4me3 や H3K27ac などのクロマチンを変化させるエピジェネティック マークを長期にわたって誘発する細胞代謝の変化と関連しています.17,18,41。 、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球系細胞：CD3-、CD4-、B220-、Ter119、Gr1-は、細胞外グルコースが高い条件で培養され、グルコース取り込みと乳酸産生の増加を示し、解糖の調節不全を示しました(P<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

大動脈起始部プラークでは、H3K4me3 陽性に染色されたマクロファージ関連核の割合は、糖尿病ドナーから BM を受け取ったマウスで高かった (1.8- 倍、P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

図 5. 糖尿病性骨髄 (BM) は、長期間のグルコース正常化にもかかわらずアテローム性動脈硬化を促進します。 A、BM移植実験の模式図。 B、骨髄移植の 12 週間後のマウスの末梢白血球集団のフローサイトメトリー分析。 C、糖尿病ドナーまたは対照ドナー CD68- GFP BM を受けた Ldlr-/- マウスからの代表的な大動脈起始部の画像。 Masson Trichrome 染色 (左) および BM 移植由来マクロファージ (緑色は緑色蛍光タンパク質 [GFP] を示す) またはすべてのマクロファージ (赤色はガレクチン -3 [GAL3] を示す) の免疫蛍光染色。 (D) プラーク量の画像定量化 (P=0.036)。 ボンフェローニ事後検定を用いた 1- way ANOVA によって分析された平均±SD として示されるデータ (B)、またはマンホイットニー U 検定によって分析される中央値±四分位範囲 (D)。 コントロール n=6、糖尿病患者 n=9。 E、糖尿病またはコントロール BM 移植を受けた Ldlr-/- マウスからの代表的な大動脈起始部の画像。 F、GAL3マクロファージ陽性領域内でH3K4me3またはH3K27acについて陽性に染色された核のパーセンテージの定量化。 各データ ポイントは、個々 の動物を表します (平均、6 セクション; n= 7 ～ 10)。 平均値±標準偏差で表示。 一元配置分散分析。 BMDM は BM 由来のマクロファージを示します。 HSC、造血幹細胞。 IFN-、インターフェロン-; LPS、リポ多糖。 *P<0.05.

この一連の非コーディング ゲノム領域の生物学的関連性を調べるために (推定されるシス調節機能に重点を置いて)、糖尿病細胞でアクセシビリティが向上したクロマチンの領域を 2 つの最も近い遺伝子 (10{{ 以内) に割り当てました。 11}}0 kb) を生成し、Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool で分析しました.33 この経路分析により、白血球の活性化 (3.3- 倍; FDR, 0.0005 )、およびマクロファージにおける LPS 寛容化に関連する遺伝子 (2.7- 倍; FDR、0.0009)。 分離した高グルコースがクロマチン修飾を誘発する可能性があるかどうかを理解するために、ATAC-seq を使用して、IL-1 刺激の非存在下でコントロールおよび糖尿病マウスの HSC を調べました。 刺激されていない HSC は 357 の異なるピーク (FDR が 0.2 以下) を示し、そのうち 51% はコントロールと比較して糖尿病由来の細胞へのアクセスが増加し、その大部分はイントロン (48%) または遺伝子間 (21%) 領域にありました。

HSC でのこれらの発見を踏まえて、次に、派生した BMDM でのクロマチンのアクセシビリティと遺伝子発現を調べました。 非刺激または炎症誘発性刺激 (LPS プラス IFN-) 条件下で、コントロールおよび糖尿病マウスの BMDM で ATAC-seq および RNA-seq を実行しました。 糖尿病マウスの BMDM は、刺激されていない条件下で 1047 の異なる領域 (FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5)。 まとめると、ATAC-seq と RNAseq のデータは、糖尿病が炎症誘発性刺激に対する誇張された反応のためにマクロファージをプライミングしたことを示唆しています。

図 6. 糖尿病は H3K4me3 と H3K27ac のレベルとクロマチンのアクセシビリティを変化させます。 トランスポザーゼ アクセス可能なクロマチン シーケンス クロマチンのすべてのアッセイの MA プロットは、(A) 刺激されていない、または (B) 刺激された骨髄由来マクロファージ (BMDM) を読み取ります。<0.05, fold change >1.5) はピンク色で強調表示されています (1047 刺激なし、40 刺激あり、n=6)。 C、H3K4me3 および H3K27ac の可変領域は、造血幹細胞 (HSC) およびコントロール対糖尿病マウスからの BMDM におけるクロマチン免疫沈降シーケンスによって定量化されました (グループあたり n=6)。 D、HSC、非刺激 BMDM、および炎症性刺激 BMDM (リポ多糖 [LPS] プラス インターフェロン [IFN]) における H3K27ac および K3K4me3 の平均カバレッジのヒストグラム。刺激されていない BMDM のアクセシビリティ (vs コントロール; n=405) と、選択されていない領域のバックグラウンド レベルとの比較。

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5)、差分 ATAC-seq ピークの倍数変化と DE の倍数変化を比較しました。 連続変数として調べると、クロマチンの変化と近接遺伝子の発現との間に強い相関がありました (R=0.65; P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >注釈付き転写開始部位から 1 kb。 それらの遺伝子プロモーター領域（転写開始部位±1 kb）が最も可能性の高い調節標的を表すため、これらのエンハンサーに近接する遺伝子に注目しました。 ATAC-seq は、特異的に開いたクロマチンの 405 領域を特定しました (P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

図 6. 糖尿病は H3K4me3 と H3K27ac のレベルとクロマチンのアクセシビリティを変化させます。 トランスポザーゼ アクセス可能なクロマチン シーケンス クロマチンのすべてのアッセイの MA プロットは、(A) 刺激されていない、または (B) 刺激された骨髄由来マクロファージ (BMDM) を読み取ります。<0.05, fold change >1.5) はピンク色で強調表示されています (1047 刺激なし、40 刺激あり、n=6)。 C、H3K4me3 および H3K27ac の可変領域は、造血幹細胞 (HSC) およびコントロール対糖尿病マウスからの BMDM におけるクロマチン免疫沈降シーケンスによって定量化されました (グループあたり n=6)。 D、HSC、非刺激 BMDM、および炎症性刺激 BMDM (リポ多糖 [LPS] プラス インターフェロン [IFN]) における H3K27ac および K3K4me3 の平均カバレッジのヒストグラム。刺激されていない BMDM のアクセシビリティ (vs コントロール; n=405) と、選択されていない領域のバックグラウンド レベルとの比較。

これらの違いは、BMDM では減少しました (図 6D)。これは、一部には、分化後の非糖尿病起源細胞で H3K27ac が増加したためです。 ただし、H3K4me3 マークは HSC のこれらのプロモーターで増加し、識別可能な違いは、サイトカイン刺激後を含め、分化したマクロファージで持続します (図 6D)。 一過性 H3K27ac および持続性 H3K4me3 マークのこのパターンは、組織培養 (データ補足の図 VIII) およびマウス プラーク マクロファージの免疫組織化学 (図 5E および 5F) の両方における我々の発見と一致しています。

ATAC-seqによって特定された特異的に開いたクロマチンの領域は、近接遺伝子の転写の変化と非常に有意に関連していました。 さらに、クロマチンアクセシビリティ (糖尿病対コントロール) の違いの定量化と、近接遺伝子の mRNA 発現レベルの変化との直接比較は、高度に相関していました (R=0.5; P=6.2e −15; 図 7A)。 関連するゲノム遺伝子座でのこれらの効果を調べるために、以前に解糖誘導性訓練免疫に関係していた 2 つの遺伝子のプロモーターでの ATAC-seq、H3K4me3 ChIP-seq、および H3K27ac ChIP-seq データと、炎症の促進に関与する産物を組み合わせました (Il -6) およびグルコース代謝 (Hk1)。 これらの遺伝子は、転写開始部位にアクセス可能なクロマチンの領域を示し、これらのゲノム遺伝子座に H3K4me3 および H3K27ac ピークが関連付けられています (図 7B)。

どの転写因子が高血糖誘発性の訓練された免疫のこのパターンのメディエーターとして関与している可能性があるかについての洞察を得るために、糖尿病条件下でアクセシビリティが向上したクロマチンの領域でモチーフ濃縮分析を実施しました。 大幅に濃縮された転写因子モチーフには、以前に免疫記憶と関連していた RUNX1 (FDR、0.0001)、46、PU.1 (FDR、0.04)、および CCCTC 結合が特に含まれていました。因子 (FDR、1.8×10−7; 図 8A)。 結合モチーフのアクセシビリティに基づいて転写因子 RUNX147 が関与していることを示したので、LPS および IFN- 刺激 BMDM の DE 遺伝子の中で RUNX1 標的遺伝子が有意に過剰に存在するかどうかを調査しました。 この分析により、1348 個の DE 遺伝子のうち 95 個が RUNX1 の標的として特定されました (P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

ヒト プラーク マクロファージの機能プロファイルがマウス マクロファージの機能プロファイルと一致するかどうかを確認するために、糖尿病マウスとコントロール マウスの刺激 BMDM で測定された発現を持つ 39 個の M1 および M2 遺伝子のセットと比較しました (図 3G)。 これらは、正または負の対数倍変化 (糖尿病対コントロール) によって要約され、2 型糖尿病患者のヒトプラークマクロファージの同等の変化 (対コントロール) と比較されました。 フィッシャーの正確確率検定では、糖尿病患者と対照被験者で上方制御または下方制御された遺伝子について、マウス BMDM とヒト プラーク マクロファージのデータ セットの間に有意な関係が示されました (P=0.0155; オッズ比 6.83)。

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >一致した非糖尿病対照と比較した3000個の遺伝子。 変化した遺伝子の遺伝子セット濃縮分析は、炎症反応 (P=1.70×10-5) および IL-6 JAK STAT3 シグナル伝達 ( P=0.0221)、活性酸素種および活性窒素種の生成 (P=0.0049)、IL-/IL-シグナル伝達 (P=0.0110) を含む Reactome 経路、および Toll 様受容体 1/2 カスケード (P=0.0033)。 これらの経路は、これらの末梢細胞も、糖尿病マウスの BMDM で報告したものと同様のプライミング特性を示したことを示しています (図 3G)。

最後に、高血糖誘発性訓練免疫応答における RUNX1 の因果的役割の可能性をさらに調査するために、生理的または高グルコースで以前に分化した BMDM を 5 mmol/L グルコースに戻し、薬理学的 RUNX の非存在下または存在下で刺激しました。 1-特異的阻害剤 Ro5-333551 (図 8D)。 高グルコースで分化した細胞は、Il-6 の発現増加を示した (2- 倍、P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

図 8. RUNX1 高血糖誘発性訓練免疫の役割。 トランスポザーゼ アクセス クロマチン シーケンス (ATAC-seq) のアッセイで特定された上位 3 つの転写因子モチーフは、非刺激対照造血幹細胞 (HSC; n{{6 }}）。 (B) 糖尿病患者 (n=6) または対照 (n=6) 骨髄 (BM) 由来マクロファージ (BMDM) の RNA シーケンス (RNA-seq) 分析からの差次的に発現する遺伝子の教師なし階層クラスタリングリポ多糖 (LPS) とインターフェロン (IFN-) で刺激されます。 (C) 糖尿病 (n=8) またはコントロール (n=16) レーザー キャプチャ マイクロダイセクション ヒト頸動脈プラーク マクロファージ サンプルからの差次的に発現する遺伝子の教師なし階層的クラスタリング。 B および C、ラント関連転写因子 1 (Runx1) 標的遺伝子 (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

議論

集中的な血糖コントロールにもかかわらず、糖尿病患者では心血管合併症が高率で持続する. 高血糖は、好気性解糖を促進することによって BM HSC の永続的な変更を誘導し、特定のパターンのクロマチン アクセシビリティをもたらし、分化したマクロファージに持続する炎症誘発性プライミング状態の証拠を示します。 私たちの調査結果は、転写因子、特に RUNX1 が訓練された免疫のメディエーターとして関与していることを示しています。 RUNX1 の薬理学的阻害は、in vitro での高血糖誘発性訓練免疫のこれらの症状を取り除きました。

細胞代謝の変化は、微生物産物または酸化 LDL やリポタンパク質 (a) などの内因性アテローム生成物質による短時間の刺激の後に発達する自然免疫記憶を表す用語である、訓練免疫を誘発する可能性があります。カンジダ・アルビカンスの細胞壁成分である は、デクチン-1-Akt-mTOR-HIF-1経路の活性化を介して媒介され、酸化的リン酸化から好気性解糖への切り替えを引き起こします (ワールブルグ効果)。実際、解糖とトリカルボン酸サイクルからのいくつかの代謝産物は、ヒストン修飾酵素の補因子として作用し、クロマチンのアクセシビリティを決定します。 たとえば、ヒストン アセチルトランスフェラーゼとデアセチラーゼはアセチル-CoA と NAD プラスを必要とするのに対し、Tet や JmjC などのデメチラーゼは補因子として -ケトグルタレートを使用します.乳酸レベルの上昇に由来するアセチル化.55

グルコース代謝とエピジェネティックな修飾の間の直接的な関連は、糖尿病患者の高血糖記憶を示唆する観察と相まって、高血糖自体が細胞代謝の変化を引き起こし、糖尿病の自然免疫記憶につながる可能性があるという仮説を導きました。 α-グルカンの場合、マクロファージでの好気性解糖の増加により、ヒストン 3 Lys4 トリメチル化 (H3K4me3) およびヒストン 3 Lys27 アセチル化 (H3K27ac) が増加しました。 これらのクロマチン修飾マーカーは両方とも、高グルコースによる解糖の状況で増加しました。 ここおよび以前の研究で示されているように、炎症 (例: Il-6) およびグルコース代謝 (例: Hk1) に関連する遺伝子のプロモーター上に H3K4me3 が豊富に存在していました。フマル酸は、ヒストンおよび DNA デメチラーゼのアンタゴニストとして作用することが報告されており 54、これと一致して、高血糖細胞ではトリカルボン酸回路の代謝産物であるコハク酸とリンゴ酸が増加することもわかりました。

Metropolis ら 20 は、骨髄細胞前駆細胞におけるα-グルカン誘導性自然免疫との関連で、サイトカインが訓練免疫を媒介できることを示しました。 具体的には、受容体アンタゴニスト アナキンラによる IL-1 の阻害は、グルカン誘導の訓練免疫を阻害しました。 欧米の食事は、BM 前駆細胞でエピジェネティックな再プログラミングを誘導し、インフラマソームを介した訓練された免疫につながることも示されており、IL-1 シグナル伝達経路が訓練された免疫に関与していることを示しています.56 IL-1 が複数の病理学的プロセスを媒介することを考えると、糖尿病では、IL-1 が訓練された免疫の発達において高グルコースの影響を増強するかどうかを調べました。 糖尿病だけでもクロマチンのアクセシビリティに影響を与えたが (PU.1、RUNX1、および CCCTCbinding factor を示唆するモチーフ分析による)、IL-1 の影響は、糖尿病によってプライミングされた細胞との関連で、さらに顕著であった (関連するERG、ZNF263 [ジンクフィンガータンパク質263]、およびRUNX1)。 これは、マクロファージが高血糖によってプライミングされたが、2 番目の刺激に応答してより鮮やかな変化を示すという階層関係を示唆しています.43 実際、プロモーターでのクロマチン状態の変化が、異なるマクロファージ活性化刺激間の複雑な機能的相互作用の根底にある可能性があることがよく認識されています。 例えば、IFN- は多くの LPS 誘導性遺伝子を活性化することはできませんが、プロモーターでヒストンのアセチル化とクロマチンのリモデリングを誘導することができ、それによって LPS に応答して将来の活性化のために細胞をプライミングします.57

開いたクロマチンの部位でのモチーフ分析により、RUNX1 結合部位の濃縮が検出されました。 機能的な観点から、RUNX1 は HSC の生成と維持、および多様な系統の分化に必要です.58 単球とマクロファージでは、RUNX1 は PU.1 (ここにも関与) と協力して、マクロファージのコロニー刺激因子 (コロニー刺激因子) を調節します。 -1)受容体であり、マクロファージの生存、分化、および拡大に不可欠です.59 単球接着で観察された機能的記憶効果に関連して、RUNX1は、リンパ球機能関連抗原 1/CD11a.31 の制御核因子κBサブユニットp50に結合するRUNX1は、転写コアクチベーターとして相乗作用を発揮します.60 まとめると、マクロファージにおけるRUNX1機能が、アテローム発生に重要なプロセスの調節に向けて強力に収束しているという証拠があります。

したがって、RUNX1の推定制御下にある遺伝子を、マウスBMDMに由来する細胞の転写プロファイルと、関連するヒトの in vivo 設定からのマクロファージと相互参照しました。 糖尿病の存在下でのヒトのアテローム性動脈硬化プラーク マクロファージと BMDM は、以前に炎症とアテローム性動脈硬化に関連していたいくつかを含む、RUNX1- 制御遺伝子の DE を示しました.49,50 私たちの研究は、最近インビトロで6日間培養された糖尿病由来のヒトマクロファージは、LPSおよびIFN-または腫瘍壊死因子-で刺激されると、炎症性プライミングを維持し、炎症性表現型に過分極する.

興味深いことに、これらの RUNX1 標的遺伝子のいくつかは、糖尿病患者のプラークマクロファージ、すなわち CRNKL1 および PLA2G5 で発現の増加を示しますが、ZNF32 (ジンクフィンガータンパク質 32) および NUP214 (ヌクレオポリン 214) のような他のものは、糖尿病患者と非糖尿病患者でより低い発現を示しました。プラークマクロファージ。 これは表面的には一貫性がないように見えるかもしれませんが、RUNX1 は遺伝子発現を促進し、転写抑制因子として作用することが実証されています.62 これは主に、HDAC1 や HDAC663 などのヒストン脱アセチル化酵素とヒストンメチルトランスフェラーゼの動員を通じて発生します.62 さらに、RUNX1 の物理的相互作用は、クロマチンとの結合は、細胞子孫の同定に貢献できます。 例えば、有糸分裂中の RUNX1 相互作用の破壊は、上皮から間葉への移行につながります。 RUNX1 に対する標的を絞った介入は、マクロファージにおける高血糖誘発性の訓練された免疫の下流の影響における RUNX1 の関与のさらなる証拠を提供します。

末梢マクロファージ単独での高血糖誘発性の訓練された免疫の誘導は、疾患の進行を促進した可能性がありますが、訓練された免疫の長期的な影響と末梢骨髄細胞の比較的短い寿命を考えると、訓練された免疫も誘導された可能性が高いと推論しました最近、α-グルカンと西洋型の食事で実証されたように、HSCのレベルで.不可欠な炎症成分を伴う重要な病理であるアテローム性動脈硬化症の進行を促進します。 糖尿病マウスから正常血糖のアテローム性動脈硬化を起こしやすいマウスにBMを移植すると、病変の進行に顕著な影響があり、脂質に富む壊死コアの増加と関連しており、ヒトの糖尿病で見られるアテローム性動脈硬化の進行型と一致しています.65

この研究は、高グルコース/高血糖の影響の調査を中心に構築されています。 糖尿病の主要な特徴である高血糖の長期的な影響を特徴付けるために、2型糖尿病マウスモデルではなく、糖尿病のストレプトゾトシンマウスモデルを使用しました。ブドウ糖の効果に関する研究。 1 型糖尿病と 2 型糖尿病の間には、実質的に重要な違いがあります。 しかし、高血糖はその診断に一般的であり、それぞれの心血管リスクを引き起こし、長年にわたって両方のタイプの糖尿病の治療とモニタリングの主な標的となっています. ここで報告された新たに特定された高血糖誘発性の訓練された免疫は、他の多くの潜在的な影響（例えば、食事中の砂糖、66 パターンの血糖上昇、67 付随する高脂血症 57）に関するより具体的な調節を考慮して、将来的に精緻化されることを期待しています。

私たちの調査結果は、糖尿病のアテローム性動脈硬化性合併症の管理に重要な意味を持っています。 最も重要な、骨髄細胞および BM 前駆細胞のアテローム形成促進特性は、血糖値の正常化後も持続します。 これは、従来の治療法の有効性の欠如を説明するのに役立つ可能性があり、糖尿病の血管リスクと合併症の管理へのアプローチに根本的に挑戦しています. 代謝ドライバーと特定のエピジェネティックな修飾の同定は、潜在的な新しい治療標的も推奨しています。

記事の情報

2020 年 2 月 27 日受領。 2021年6月23日受付。

所属

心血管内科、オックスフォード大学ラドクリフ医学部、英国 (LE、NA、ATB、JB、JTC、MA、KZ、RA、TJC、MJC、KMC、RC、RPC)。 オーストリア科学アカデミー分子医学研究センター、ウィーン、オーストリア (TK、AFR、CB)。 生理化学 II 部門、医療生化学および生物物理学科、カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデン (HG-A.、CEW)。 呼吸器内科およびアレルギー科 (HG-A.、CEW) および内科 (H7) (JL、MR)、カロリンスカ大学病院、ストックホルム、スウェーデン。 ケネディ リウマチ研究所、オックスフォード大学、英国 (ALC、TEK、IAU)。 人工知能と意思決定支援研究所、医療統計、情報学、およびインテリジェントシステムセンター、ウィーン医科大学、オーストリア (CB)。 Bioinfo、プランタジネット、オンタリオ州、カナダ (MEL)。 内科、Radboud 大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ (NPR.、MGN)。 ドイツ、ボン大学 (MGN)、生命医科学研究所 (LIMES)、ゲノミクス & 免疫調節部門。

謝辞

著者は、リサ ヘザー、マリア ダ ルス スーザ フィアロ、トーマス ミルンの支援に感謝します。 RPC、NA、および LE がこの研究を考案しました。 LE は、記載されているすべての in vitro 実験、遺伝子発現解析、免疫ブロッティングを実行しました。 MA は、ヒトサンプルの研究に貢献しました。 CEWとHG-A。 質量分析ベースのメタボロミクスを実行しました。 JTC は、ヒト プラーク マクロファージ LCM の作業とアレイの準備を行いました。 LE は、JB の指導と MJCALC の監督の下で Seahorse Bioanalyser 実験を行い、セルソーティング分析を行いました。 LE は、RNA シーケンス サンプルを準備しました。 LE は、TEK の指導と IAU の監督の下で ATAC seq サンプルを準備しました。 NA は、すべての ChIP シーケンシング細胞の準備を行いました。 配列決定は、CB の監督の下、TK と AFR によって行われました。 MEL と ATB はシーケンス データのアラインメント、正規化、および品質管理を実行し、LE はダウンストリーム分析を実行しました。 MEL および ATB は、アレイおよびシーケンス データ解析を実行しました。 KZ、RA、および RC が動物調査を主導しました。 LE、NA、TJC、NPR、および MGN は、実験計画と実行に参加しました。 RPC、LE、NA、および MEL が原稿を作成しました。 すべての著者は、原稿の最終提出を読み、承認しました。

資金源

この作品は、英国心臓財団センター オブ リサーチ エクセレンス オックスフォード (RE/13/1/30181)、英国心臓財団プロジェクト助成金 (Drs Akbar and Choudhury: PG/18/53/33895)、国立衛生研究所によって支援されました。 Oxford Biomedical Research Center、Tripartite Immunometabolism Consortium–Novo Nordisk Foundation (grant NNF15CC0018486; Choudhury、Udalova、Rydén、Channon、Wheelock 博士)、糖尿病スペクトラム疾患における代謝物関連炎症: グルコースを超えた新しい標的 (MeRIAD–Novo Nordisk Foundation) 、助成金 0064142、Choudhury 博士、Udalova 博士、Rydén 博士、Channon 博士)、4- 年の英国心臓財団博士号 スチューデントシップとドリス フィールド トラスト (エドガー博士)。 Wellcome Trust Center for Human Genetics の High-Throughput Genomics Group は、Wellcome Trust グラント リファレンス 090532/Z/09/Z および MRC ハブ グラント G0900747 91070 によって資金提供されました。 オーストリアのウィーンにあるオーストリア科学アカデミーの分子医学のためのCeMM研究センターの生物医学的配列決定施設。 Riksen 博士と Netea 博士は、助成契約 667837 の下で、欧州連合の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラムから資金を受け取りました。Netea 博士は、ERC Consolidator Grant (No. 310372) とオランダ科学研究機構によって支援されました。

開示

なし。

補足資料

データ補足図 I ～ XI

データ補足 Excel ファイル I ～ VII

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ローレンス・エドガー博士*; Naveed Akbar、Ph.D.*; Adam T. Braithwaite 博士。 トーマス・クラウスグルーバー博士。 エクトル・ガラール・アヤラ博士。 ジェイド・ベイリー、DPhil; Alastair L. Corbin、DPhil; Tariq E. Khoyratty、DPhil; ジョシュア・T・チャイ、DPhil; Mohammad Alkhalil、DPhil; アンドレ・F・レンデイロ博士。 Klemen Ziberna、DPhil; Ritu Arya、MRes。 Thomas J. Cahill、DPhil; クリストフ・ボック博士。 Jurga Laurencikiene、Ph.D.; マーク J. クラブツリー博士。 Madeleine E. Lemieux 博士。 Niels P. Riksen、MD、Ph.D.; Mihai G. Netea、MD、Ph.D.; クレイグ・E・ウィーロック博士。 キース・M・シャノン医学博士。 Mikael Rydén、MD、Ph.D.; Irina A. Udalova、Ph.D.; リカルド・カーニサー博士。 ロビン P. チョードリー、DM。

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