Cistanche Tubulosa II から精製された天然生理活性化合物エキナコシドの一般的な肝臓代謝物の同定

概要：代謝物の同定、化合物の初期段階では、評価するために発見が必要医薬品の安全性と効率を改善するための知識。 薬だとしても市場にリリースされた後、代謝産物の同定と継続的な評価が行われます。市販後の撤退リスクを回避するために必要です。 配糖体、薬用カンクン、以下を含む栄養補助食品の利点が広く文書化されています。抗酸化物質,抗腫瘍, 反エージング, 低脂血症c、 と胃粘膜保護効果。 最近、エキナコシドAが報告されました機能性食品開発のための HE の菌糸体の主要な天然生理活性化合物として。神経学的研究では、エキナコシド濃縮された HE 菌糸体は、その重大な栄養補助食品効果アルツハイマー病、 パーキンソン病、 と虚血性脳卒中.

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ために初めて、私たちは代謝プロセスを調査しました。エキナコシド分子とその代謝産物の同定ラットおよびヒトの肝臓 S9 画分から。 液体クロマトグラフィー/トリプル四重極質量の使用分光計で定量分析したところ、75.44パーセントのエキナコシドが存在することが観察されました。 Aが代謝されたラットでは 60 分以内に代謝され、ヒト S9 では 120 分以内にフランシン A の 32.34 パーセントが代謝されました。 使用する超高性能液体クロマトグラフィー/四重極飛行時間型質量分析 (UPLC)QTOF/MS) フランシーヌ A の代謝物を同定すると、5 つの一般的な代謝物が同定されました。そしてそれらの可能な構造が評価されました。 エキナコシドの代謝プロセスを理解するそしてその代謝物プロファイルデータベースを確立することは、栄養補助食品への応用を促進し、将来的には関連するバイオマーカーの発見が期待されます。

1. はじめに

肝臓は体の中で 2 番目に大きな臓器と考えられています [1]。 食べ物や薬の後口腔を通って胃腸管に入ると、胃腸線毛が吸収します。消化された栄養素と薬物。 門脈系は集められた血流を受け取ります消化管を通って肝臓に入り、栄養素の予備処理が行われます。代謝物と薬物分子 [2,3]。 代謝は多くの場合、次の 2 つの段階に分けられます。生化学反応。 フェーズ I には、酵素による酸化、還元、または加水分解が含まれます。体。 フェーズ II では、小さな内因性物質との結合が行われ、それらを可溶性の高い代謝物に変換し、代謝物を洞に輸送できるようにします。腎臓を浄化するための体循環、またはその後体外に排泄される胆汁への循環尿または糞便を介して[4–6]。 創薬の初期段階での代謝物の同定医薬品の特性、安全性、および品質を向上させるための知識を評価するために必要です。生物活性分子の効率。 代謝産物と反応性中間体の同定を避けるために治験化合物の構造修飾が必要であることを示唆しています。その後の有害な影響。 たとえその薬が市販されていたとしても、識別は代謝物の市販後のリスクを回避するために評価が必要です撤退 [7,8]。 したがって、試験管内で, S9 フラクション分析にはいくつかの利点があります時間がかかることに比べて生体内研究: (1) ハイスループットに適しているスクリーニングと自動化。(2) を使用するS9 フラクションにより、大量の物質の検査が可能になります。短期間での創薬のための化合物。 (3) 動物使用量の削減に役立ちます [9]. 

エキナコシド の山岳地帯に生息する食用のカンクです。アジアの北東部地域 [10]、ヨーロッパ、北米 [11]。 彼は所属しています担子菌門（門）、寒天菌門（綱）、ベニタケ目（目）、ハラタケ科（科）、およびヘリシウム（属）。 HE は広範囲の有益な効果を示すことが文書化されています。抗酸化作用、抗腫瘍作用、老化防止作用、脂質低下作用、胃粘膜作用などの特性保護効果 [12–14]。 1994 年、川岸ら。 ジテルペノイドという物質を発見しましたエキナコシドHE の菌糸体の A、B、C は星状細胞の生成を促進する可能性があるラット脳の細胞株と神経成長因子 (NGF) 合成の刺激 [15]. エキナコシドAは神経保護効果を与え、酸化ストレスを軽減します。脳卒中 [16]、 アルツハイマー病 [17]、 パーキンソン病 [18]、虚血性脳卒中、うつ病 生体内[19,20]。 さらに、エキナコサイド A は血液脳関門を通過できます。神経の健康改善のための機能性食品としての HE 菌糸体の発達をサポートするラット [21]。 この食用のカンク菌糸体は研究者の間で話題になっています中枢神経と末梢神経の発達におけるその重要な役割を理解しようとしています、分化、成長、再生 [22]。 最近の研究でも示されていますエキナコサイドA濃縮HEにはアルツハイマー病やパーキン病の治療に潜在的な効果があるということ息子の病気 [23–25]。 しかし、エキナコサイド A の代謝の可能性について議論した研究はありません。この栄養補助食品の効果に寄与する可能性のあるバイオマーカー。

この研究では、エキナコシドエキナコサイド A が豊富な HE から化合物が精製されました菌糸体であり、ラットとヒトの 2 つの異なる肝臓 S9 画分を使用して代謝されました。 使用するQuan用液体クロマトグラフィー/トリプル四重極質量分析計(HPLC-QQQ/MS)エキナコサイドAの定量分析と超高速液体クロマトグラフィー/四重極エキナコシドの代謝物を同定するための飛行時間型質量分析法 (UPLC-QTOF/MS)各時点での A。 エキナコサイド A の代謝率を理解し、その代謝率を確立することを目指します。栄養補助食品の適用促進に役立つ代謝物プロファイルデータベースそして将来の可能性のある治療薬の研究。

2。材料と方法

2.1. 材料と試薬

HE 株 (BCRC 35669) は Bioresources Collection から入手し、台湾、新竹の食品産業研究開発研究所の研究センター。この株は、ジャガイモデキストロースに移される前に、まずエイガー傾斜地で生育されました。26の寒天プレート◦Cで15日間。 15日目に、HE培養物を1.3Lの液体培地（2 L フラスコ中）。 液体培養物を 120 回転/分で振盪しました 25◦Cの場合5日間。 次に、500 L、20- トンの発酵槽で 5 日間と 12 日間スケールアップしました。それぞれ。 培地は pH 4.5 に調整されており、4.5 パーセントのグルコース、0.5 パーセントが含まれています。大豆粉、{{0}}.25 パーセントの酵母エキス、0.25 パーセントのペプトン、および 0.05 パーセントの MgSO4。 最後に、HE菌糸体は20-トンの発酵プロセスの最後に収穫されました。 これらの原材料は凍結乾燥し、粉砕して、デシケーター内に保管した。 エキナコシドAは当時HE から抽出され、以前の研究に従って定量化されました [26]。 メタノール (LC-MS)グレード) は Merck (ドイツ、ダルムシュタット) から入手しました。 アセトニトリル (LC-MS グレード)、ギ酸酸 (FA、LC-MS グレード、純度 98 パーセント)、および酢酸アンモニウム (純度 98 パーセント) が得られました。ハネウェル（米国ミシガン州マスキーゴンのハネウェル・バーディック・アンド・ジャクソン）製。 ラット肝臓S9画分は、Moltox (米国ノースカロライナ州ブーン) から入手しました。 ヒト肝臓 S9 画分は、Thermo Fisher Scientific (米国イリノイ州ロックフォード) から入手。

2.2. ラットおよびヒト肝臓 S9 フラクション

キットのおすすめへ。 調製した溶液を4℃に保った。◦CからエキナコシドAまで化合物(10µM) が追加され、続いて 37 でアクティブ化されました。◦C水浴。 とき代謝時間がその時点に達し、150µL の溶液を取り出したストック溶液に加え、2 倍量の氷冷 ACN を加えてクエンチしました。 止まったのはその後、溶液はさらなる代謝物分析のために QTOF に移されます。

2.3. 計装と条件

HPLC-QQQ/MS 分析は、Agilent 1100 シリーズ HPLC システム (Agilent、パロアルト、カリフォルニア州、米国) と API 3000 トリプル四重極質量分析計を組み合わせた(Applied Biosystems、ウォリントン、英国)、ターボ支援イオン スプレー (ESI) イオン化装置を使用正イオン化モードのソース。 クロマトグラフィー分離は、Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm)× 100mm× 3.5 µm)。 カラム温度は22時に維持◦C. 移動相は、0.1% のギ酸を含む水で構成されていました。(A) とメタノール (B)。 70 パーセントの B から開始して 100 パーセントまで増加する勾配溶出を使用しました。5 分以内に B、90 パーセント B で 3 分間保持、0.1 分以内に B を 70 パーセントに減少、そして70パーセントBで2.9分間再平衡化。 仲間率350µL/min を適用し、体積を10件中µLを注入しました。

検出はイオン化電圧プラス 4500 V で実行されました。 イオン源温度350に設定されました◦カーテンガスとして超高純度窒素を使用した C (7 psi)。 ネブライザーガスは8 psi。 デクラスタリング ポテンシャル (DP)、入口などの他の質量依存パラメータ各化合物の電位（EP）、集束電位（FP）、および衝突エネルギー（CE）は、標準溶液を使用してポジティブモードで測定します。 複数の反応モニタリング(MRM) は、衝突ガス (2 psi) として窒素を使用し、滞留時間を 2 時間として実行されました。各遷移に 200 ミリ秒。 エキナコシド A は遷移を監視することで検出されましたm/z 443.200 → 301.200、283.200。 データは Analyst 1.4.2 ソフトウェア (Applied) を使用して分析されました。Biosystems、オンタリオ州コンコード、カナダ）および GraphPad（Prism 8.0.0.）。

UPLC-QTOF/MS 分析は Agilent 1290 Infinity II UPLC システムで実行されました(Agilent、パロアルト、カリフォルニア州、米国)、Agilent 6546 四重極飛行時間型質量と組み合わせたもの分光分析 (Agilent、米国カリフォルニア州パロアルト)。 クロマトグラフィー分離を実施Phenomenex Kinetex について® C18 LC カラム (3 mm× 100mm× 1.7 µm)。 コラム温度は40度に保たれた◦C. 移動相 A は、次の成分を含む水で構成されています。0.1パーセント（v/v) ポジティブモードのギ酸、0.1 パーセント (v/v) ギ酸、および 10 mM CH3クーン4 ネガティブモードで。 移動相 B はアセトニトリルでした。 勾配溶出を使用し、開始5% B で 0.5 分間保持、5.5 分以内に 50% B に増加し、100% に増加10分以内にBを押し、6分間保持します。 仲間率400µL/min を適用し、2のボリュームµLを注入しました。

Agilent 6546 四重極飛行時間型質量分析計には、電子機器が装備されていました。トロスプレーイオン化（ESI）源。 データ収集はマス・ハンターの管理下にあったワークステーション ソフトウェア。 正イオンと負イオンの一般的な動作源条件ESI モードは次のように最適化されました。 イオン スプレー電圧 (ESIプラス/ESI−） そうだった4000 V/3000 V; ガス温度は320度でした◦C; 乾燥ガス流量は８Ｌ／分であった。 ネブライザー圧力は45 psi; シースガス温度は350℃でした◦C; シースガス流量は１２Ｌ／分であった。 衝突エネルギーは 10、20、40、および 60 V でした。代謝物は Agilent MassHunter を使用して同定されました。Biotransformation ソフトウェア (バージョン B.04.00) (米国カリフォルニア州サンタクララ)。 クロマトグラム親代謝産物と同定された代謝産物の質量スペクトルは、Agilent を使用して抽出されました。MassHunter 定性分析ソフトウェア (バージョン B.05.00) (米国カリフォルニア州サンタクララ)。

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