CistancheSalsa細胞培養におけるフェニルエタノイド配糖体生合成に関与する過酸化水素応答性ESTの同定
Mar 17, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
J. CHEN et al
概要
過酸化水素は、植物の二次代謝産物生合成を誘発することができる効果的な非生物的エリシターです。 耐塩性薬用植物の細胞浮遊培養においてCistancheサルサ、生物活性成分の生産フェニルエタノイド配糖体（PeGs）はH2O2処理後に増加しました。 PeGに関連する遺伝子を特定するには(フェニルエタノイド配糖体）H2O2の影響を受ける生合成では、H2O2応答性遺伝子の抑制サブトラクティブハイブリダイゼーションライブラリを使用して構築しました。Cistancheサルサ細胞株と同定された105の発現配列タグ（EST）と85の遺伝子。 ESTライブラリの機能アノテーションと遺伝子オントロジー分析により、さまざまなストレス応答、二次代謝産物の生合成、および転写調節に関連する遺伝子が示されました。 その中で、PeGに関連する2つの遺伝子を特定しました(フェニルエタノイド配糖体）生合成経路（4-クマル酸補酵素Aリガーゼと桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ）、および2つのWRKYタイプの転写因子。 H2O2処理後の選択された遺伝子の発現は、RT-qPCRによって分析されました。 PeGの初期の転写増加(フェニルエタノイド配糖体）処理後の生合成経路遺伝子は、H2O2がPeGを誘導することを明らかにした(フェニルエタノイド配糖体）その重要な遺伝子のアップレギュレーションを介した生合成。
追加のキーワード：桂皮酸-4-ヒドロキシラーゼ、4-クマル酸補酵素Aリガーゼ、抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション。Cistancheサルサ. フェニルエタノイド配糖体。
序章
CistancheサルサHaloxylos ammodendrunの根にある多年生植物の寄生虫であり、中国西部の砂漠地帯で育ちます。 何世紀にもわたって、Cistanche種は伝統的な漢方薬として使用されてきました（Wang et al.2012）。 生物活性成分はフェニルエタノイド配糖体（PeGs）は、活性酸素種（ROS）のクリアランス、放射線防護、免疫力の強化、およびアンチエイジングに顕著な影響を及ぼします（Nan et al.2013）。 PeG(フェニルエタノイド配糖体）生合成Cistancheフェニルアラニンから開始され（図1補足）、合成されたカフェー酸はさらにグリコシル化されてさまざまなPeGを形成します(フェニルエタノイド配糖体）（Wang et al.2012）。 3つの主要なPeG(フェニルエタノイド配糖体）、エキナコシド、アクテオシド、および2'-アセチルアクテオシドは、Cistanche（小林ほか1984）。 でコンテンツを強化するためにCistanche細胞培養では、キトサン、プトレシン、Ag plus、浸透圧ストレスなど、さまざまなエリシターがテストされています（Ouyang et al。2005a、b、Cheng et al。2005、2006、Liu et al。2007、Liu and Cheng 2008）。 ただし、PeGに関与する遺伝子(フェニルエタノイド配糖体）生合成Cistanche、主にフェニルアラニン代謝経路遺伝子は、めったに識別されていません。 最近、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）をコードする遺伝子のみがCistanchedeserticolaで同定されました（Hu et al.2011）。 たとえば、桂皮酸からクマル酸への変換を触媒する可能性のある桂皮酸-4-ヒドロキシラーゼ（C4H）、およびリグニンとフラバノイドの必須遺伝子である4-クマル酸補酵素Aリガーゼ（4CL）をコードする他の遺伝子生合成は、で発見されていませんCistanche.
の細胞培養を使用しましたCistancheサルサPeGを研究する(フェニルエタノイド配糖体）生合成および関連する遺伝子発現。 また、効果的なエリシターH2O2がPeGに及ぼす影響についても調査しました。(フェニルエタノイド配糖体）生合成。 さらに、PeGに関与する初期応答遺伝子を見つける(フェニルエタノイド配糖体）生合成では、抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（SSH）を実行して、H2O2-応答遺伝子のcDNAライブラリーを構築しました。
図1.H2O2処理後にRT-qPCRによって決定された相対的な遺伝子発現。 CsWRKY 1 - WRKY転写因子（コンティグ0 7）、CsC4H 1 -シンナメート4-ヒドロキシラーゼ（コンティグ0 9）、Cs4CL 1 - 4-クマレート：リガーゼ（Contig03）、CsHSP1 -熱ショックタンパク質70kDa（Contig 01）、およびCsSOD 1 -スーパーオキシドジスムターゼ（Contig16）。 細胞を液体培地中で80ugdm -3 H2O2で2時間処理し、水で処理したコントロールと発現を比較しました。 プラスを意味します-3つの生物学的反復のSD; * --P <><>
材料および方法
CS2001細胞株は花びらから確立されましたCistancheサルサ（CA Mey。）ベックは内モンゴル県で収集され、継代培養されました。 培養方法は、以前に公開されたプロトコル（Liu et al.2007）と同様でした。 一般的に、継代培養には固体ムラシゲスクーグ（1962; MS）培地を使用し、PeGには液体培地を使用しました。(フェニルエタノイド配糖体）生合成（3 0 gdm-3グルコースと2。0mgdm -3インドール-3-酢酸を添加した改変MS培地でした）。 H2O2処理の場合、5。0±0.2 gの急速な増殖期間、通常は固体培地で継代培養してから20〜30日後に、250cm3三角フラスコ内の50cm3液体培地に接種しました。異なるH2O2濃度の有無にかかわらず、暗所で培養しました。 PeG(フェニルエタノイド配糖体）H2O2による10日間の誘導後の含有量は、メタノール勾配溶出を伴う逆相高速液体クロマトグラフィーに基づく以前に公開された方法（Liu et al。2007）に従って分析されました。
H2O2処理の2時間後の細胞を、ブフナー漏斗を使用して濾紙で培地から収集し、次に液体窒素で凍結し、粉砕して粉末にしました。 1cm3の2-メルカプトエタノールと1cm3の200 g dm {{1 0}}サルコシルの混合物を使用して、細胞粉末2gごとに溶解しました。および8cm3のGTCバッファー（5Mグアニジニウムイソチオシアネート、62.5 mM Tris-HCl、pH 8.0、6.25 mM EDTA、pH 8.0、5 mMチオ尿素、および10 mMジチオスレイトール）。 次に、細胞を氷上で15分間インキュベートし、次に1/3容量の8.5 M CH3COOK、pH 6.0を添加し、細胞を氷上で15分間インキュベートし、次に15 000gで15分間遠心分離しました。 。 上清を等量のイソプロパノールに加えてトータルRNAを沈殿させました。 全RNAは、RNeasyミニキット（Qiagen、Hilden、USA）により、製造元の指示に従ってさらに精製されました。 Oligotex mRNA midiキット（Qiagen）を使用して、全RNAからメッセンジャーRNAを単離しました。
フェニルエタノイド配糖体のCistancheサルサ
SSHライブラリは、PCR-select cDNAサブトラクションキット（Clontech、Mountain View、USA）を使用して、コントロールと30％H2O2-で誘発された細胞サンプルから生成されました。 ライブラリー構築のために、ゲル精製キット（Qiagen）を使用して生成物を別々に精製し、TAクローニングキット（Tiangen、北京、中国）を使用してpGEMベクターにクローニングしました。 独立したクローンからのプラスミドを単離し、T7プライマーを使用して配列決定した。 ライブラリーからのすべての発現配列タグ（EST）配列（ベクター配列を削除）は、CAP3（http://doua.prabi.fr/software/cap3）とのコンティグアセンブリに使用されました。 ESTはコンティグとシングルトンにグループ化されました。 それらは、NCBI（http：//blast.ncbi。nlm.nih.gov）のBLASTxプログラムを使用した相同性検索に使用されました。 次に、Blast2GO（http：// www。blast2go.com）を使用して、遺伝子オントロジー（GO）の用語に従って、シーケンスに注釈を付け、分析し、分類しました。
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）は、Bustinetal。 （2 0 09）。 PrimeScript RT試薬キット（Takara、Dalian、China）を使用して、0.5ugのトータルRNAからcDNAサンプルを合成しました。 RT-qPCRは、SYBR Premix Ex Taq IIおよびROXplusキット（Takara）を使用してABI 7300リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems、米国フォスターシティー）で3つの技術的複製を使用して実行されました。 プライマーは、タカラの指示に従ってオンラインのPrimer3ソフトウェアを使用して設計されました。 この研究で使用されたプライマーは表1補足にリストされています。 遺伝子発現は18SRNAに正規化され、その発現はすべてのサンプルで安定していました。
結果はRバージョン3.1.1を使用して分析され、差異の有意性はスチューデントのt検定によって検証されました。
結果
過酸化水素は、3つの主要なPeGすべての生合成を誘導しました(フェニルエタノイド配糖体）のCistancheサルサ浮遊細胞（表1）ですが、細胞増殖に明らかな影響はありません（図S2）。 エキナコシドの含有量は、1 0 ug dm -3 H2O2処理（P<0。05）後にすでに増加し、20ugdm後にはより高い増加が記録されました。 -3="" h2o2処理（p=""><0.01）であり、最大の増加は40、80、および160 ug="" dm-3h2o2処理後でした。="" アクテオシドについても同様の結果が示されていますが、その含有量は80="" ug="" dm-3h2o2処理後にピークに達しました。="" 2'-アセチルアクテオシドの生合成は、h2o2処理に対する感受性が低かった。="" その含有量の有意な増加（p=""><0.05）は、40 ugdm-3を超えるh2o2濃度でした。="" 80="" ug="" dm="" -3="">(フェニルエタノイド配糖体）コントロールよりも大幅に増加しました（P <0 .01）。="">
H2O2によってアップレギュレーションされる初期応答遺伝子が豊富なライブラリーを生成するために、Cistancheサルサ80 ug dm-3H2O2で2時間処理した浮遊細胞。 SSHライブラリの129個の組換えクローンをシングルパスシーケンスすると、ベクター配列を除外した後、105個のクリーンなESTが得られました。 これらの明確なESTはCAP3によるアセンブリに使用され、18個のコンティグと67個のシングルトンが生成されました（表2）。 したがって、85個の遺伝子がこのライブラリーで単離されました。 クリーンな105ESTの平均長は527bpであり、これは配列類似性に基づく機能分類に適しています。
フェニルエタノイド配糖体のCistancheサルサ
ライブラリーで得られた85個の遺伝子はすべて、BLASTxによってGenBank非冗長タンパク質データベースに対して配列類似性（0 .001以下のE値）で取得されました。 21個の遺伝子がデータベースにヒットを示さなかった、それらはに固有である可能性がありますCistancheサルサ。 BLASThitsの結果は、さらにGOおよびKEGGパスウェイエンリッチメント分析のためにBlast2GOソフトウェアにインポートされました。 BLASTヒットを伴う64の遺伝子のうち、50は他の種からの相同遺伝子の説明に従って注釈が付けられました。 注釈付きの遺伝子は、BLASTヒットの説明に従って名前が付けられました。 GO分析（図3補足）は、これらの50の遺伝子のうち、刺激への応答に関与する14の遺伝子と、代謝プロセスに関連する30を超える遺伝子があったことを示しています（表1および2）。 これらの遺伝子の中で、2つのPeG生合成経路遺伝子ホモログが予想通りに単離されました：4-クマル酸補酵素Aリガーゼ（Cs4CL1：Contig03という名前）と桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ（CsC4H1：Contig14という名前）。 さらに、RT-qPCRを実行して、H2O2処理後のライブラリーからの遺伝子の誘導発現を確認しました。
SSHライブラリから特定された必須遺伝子がH2O2処理に応答することを確認するために、2つのPeGの発現(フェニルエタノイド配糖体）生合成経路関連遺伝子（Cs4CL1、CsC4H1）、2つのROS誘導遺伝子（CsSOD1：Contig 16、CsHSP1：CISTH099）、および1つのWRKYファミリー転写因子様遺伝子（CsWRKY1：Contig 07）を処理後にRT-qPCRで測定しました。 H2O2を使用（図1）。 CsC4H1、Cs4CL1、CsSOD1、およびCsWRKY1の発現は、H2O2の2時間後に、それぞれ15-倍、3-倍、45-倍、および4-倍以上アップレギュレーションされました。処理。 CsHSP1の発現は、H2O2処理後にわずか1.8倍変化しました。
H2O2処理後のCsWRKY1、CsC4H1、およびCs4CL1の発現の経時変化をRT-qPCRでさらに分析しました（図2）。 CsC4H1とCs4CL1の発現は、16-時間の治療後に非常に増加し（それぞれ80-倍と50-倍以上）、32時間後にダウンレギュレーションされました。 CsWRKY1の発現は、4時間で20-倍以上アップレギュレーションされ、その後8時間から減少しました（図2）。
図2.80 ug dm -3 H2O2で処理した後のさまざまな時点でのCsWRKY1（A）、CsC4H1（B）、およびCs4CL1（C）の相対的発現。 式はコントロールに対して正規化されました。 （水で処理）。 プラスを意味します-3つの生物学的反復のSD; * --P <><>
討論
過酸化水素は、植物にさまざまな影響を与える有名な植物エリシターです。 ROSと同様に、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼなどで構成されるROSスカベンジングシステムを誘導でき、塩分、浸透圧、脱水の下流信号として機能します。
ストレス（Wi et al。2006、Kar 2011、Furlan et al。2013、Sathiyaraj et al.2014）。 植物におけるH2O2の生成は、Cistancheサルサ細胞培養。 予想通り、私たちの結果は、PeGが(フェニルエタノイド配糖体）の生合成ホンオニクサルサH2O2処理後に細胞培養を誘導しました（表1）。 3つの主要なPeGの内容(フェニルエタノイド配糖体）H2O2処理後に増加し、PeGs生合成におけるその極めて重要な役割を示しています。 SSHライブラリで強化された遺伝子は、PeGへの影響をさらに示唆しました(フェニルエタノイド配糖体）生合成誘導ホンオニクサルサ.
アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（CISTH069、Karyotou and Donaldson 2005）、h-キノンオキシドレダクターゼ（CISTH125、Bello、et al.2001）、CsSOD1、CsHSP1（Baruah et al.2014）などの多くの既知のH2O2-応答遺伝子および耐病性応答遺伝子（Contig10、Nanda、et al。2010）は、SSHライブラリーで濃縮されました（表3、表2補足）。 H2O2処理後に発現が誘導されたこれらの典型的なROS応答遺伝子のいくつかは、RT-qPCRによってさらに確認され（図1および2）、適格なSSHライブラリがここに構築されたことを示しています。 2つのPeG生合成経路遺伝子であるCsC4H1とCs4CL1もこのライブラリーで見つかり、これら2つの遺伝子発現はH2O2処理によって時間依存的に誘導されました（図2）。 これは、H2O2処理がPeGを誘発したことを示唆しています。(フェニルエタノイド配糖体）PAL経路遺伝子の調節を介した遺伝子レベルでの生合成。 ただし、PALおよびその他の下流のPeG生合成遺伝子（Wang et al。2012）はSSHライブラリで識別されませんでした。 ライブラリが十分にシーケンスされていないことが原因である可能性があります。 CsC4H1とCs4CL1が誘導する発現と、H2O2処理後のPeGs生合成の増加との関係は、さらなる分析によって明らかにする必要があります。
H2O2処理によって誘導されたPAL経路遺伝子に加えて、2つのWRKYファミリー転写因子（CsWRKY1、CsWRKY2）がSSHライブラリーで見つかり（表3および表2補足）、CsWRKY1誘導発現がRT-qPCRによって確認されました。 。 その発現は、2つのPAL経路遺伝子であるCs4CL1とCsC4H1の発現よりも早くH2O2処理に反応しました（図2）。 以前の研究から、いくつかのWRKY転写因子とPAL経路遺伝子の共発現がイネで観察されています（Gupta et al.2012）。 さらに、PAL遺伝子発現はOsWRKY03過剰発現変異体でアップレギュレーションされます（Liu et al.2005）。 上記の2つのWRKYファミリー転写因子もPeGに関与している可能性があります(フェニルエタノイド配糖体）生合成Cistancheサルサ。 興味深いことに、脱水関連のEST（CISTH067、CISTH064）がSSHライブラリで見つかりました。これは、H2O2処理が脱水応答性遺伝子の発現に関連していることを示唆している可能性があります。Cistancheサルサ他の植物で観察されたように（Schmidt et al。2013、Zhou et al.2013）。 1つのジベレリン（GA）シグナル伝達関連遺伝子、ジベレリン受容体gid1b-like（CISTH092）がSSHライブラリで特定され、GAシグナル伝達とH2O2処理の関係を示唆しています。Cistancheサルサ、これは大麦でも報告されました（Bahin et al.2011）。 ただし、これらの遺伝子がPeGに関連しているかどうかを確認するには、さらに多くの研究が必要です。(フェニルエタノイド配糖体）生合成。 上記の遺伝子の他に、ここで構築されたSSHライブラリは、BLASTヒットの有無にかかわらず遺伝子も表示します。 これは、C。サルサに対するH2O2の影響についての理解を深め、最初にPeGの生合成に関与するその遺伝子の情報を提供します。
結論として、PeGに対するH2O2の影響を評価しました(フェニルエタノイド配糖体）の誘導Cistancheサルサ細胞培養。 SSHライブラリーはH2O2処理後に構築され、選択された遺伝子の発現はRT-qPCRによって確認されました。 2つのPeG生合成経路関連遺伝子と他のH2O2-応答性遺伝子が同定されました。 これらの調査結果は、H2O2-によって誘発されるPeGの理解を深めます。(フェニルエタノイド配糖体）生合成Cistancheサルサ分子レベルで、遺伝子操作のための情報を提供しますCistancheサルサPeGを改善するための細胞培養(フェニルエタノイド配糖体）製造。
From：'Cistanchesalsa細胞培養におけるフェニルエタノイド配糖体生合成に関与する過酸化水素応答性ESTの同定'J. CHENetal。
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