虚血性腎障害の新規初期尿中バイオマーカーとしての好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの同定
Mar 22, 2022
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JAYA MISHRA、* QING MA、* ANNE PRADA、* MARK MITSNEFES、* KAMYAR ZAHEDI、* JUN YANG、†JONATHAN BARASCH、†、およびPRASAD DEVARAJAN *
* Nephrology＆Hypertension、シンシナティチルドレンズホスピタルメディカルセンター、オハイオ州シンシナティ; および†腎臓学、医師および外科医の大学、コロンビア大学、ニューヨーク、ニューヨーク
概要。
急性腎臓虚血性損傷に続発する障害（ARF）は、依然として一般的で壊滅的な問題である可能性があります。 トランスクリプトーム全体の調査戦略を使用して、腎虚血後非常に早期に誘導される腎遺伝子を特定しました。そのタンパク質産物は、ARFの新規バイオマーカーとして機能する可能性があります。 プラス- 10-倍にアップレギュレートされる7つの遺伝子が同定され、そのうちの1つ（Cyr61）が腎虚血後に誘導されることが最近報告されました。 予期せぬことに、他の6つの転写産物の誘導はARF分野にとって目新しいものでした。 この研究では、これらの以前は認識されていなかった遺伝子の1つ、すなわち好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）がさらに特徴づけられました。これは、プロテアーゼ耐性のある小さな分泌ポリペプチドであり、その結果、尿中で容易に検出される可能性があるためです。 虚血後初期のマウスにおけるNGALmRNAおよびタンパク質レベルの顕著なアップレギュレーション肝臓確認されました。 NGALタンパク質の発現は、主に増殖細胞核抗原陽性近位尿細管細胞で、後期エンドソームのマーカーと共局在する点状の細胞質分布で検出されました。 NGALは、ARFのマウスモデルとラットモデルの両方で、虚血後の最初の尿排出量の尿で容易に検出されました。 尿中のNGALの出現は、腎臓虚血およびN-アセチル- -D-グルコサミニダーゼおよび2-ミクログロブリンなどの他の尿マーカーの出現に先行した。 尿細管細胞からのNGALの起源は、in vitro虚血性損傷を受けた培養ヒト近位尿細管細胞で確認され、NGAL mRNAは細胞内で急速に誘導され、NGALタンパク質は軽度のATP枯渇から1時間以内に培養培地で容易に検出されました。 NGALは、シスプラチン誘発腎毒性のあるマウスの尿でも容易に検出され、これもN-アセチル- -D-グルコサミニダーゼと2-ミクログロブリンの出現に先行していました。 結果は、NGALが虚血性および腎毒性の初期の高感度で非侵襲的な尿中バイオマーカーである可能性があることを示しています腎臓けが.
Cistancheハーブ腎障害を治療することができます
急性腎臓失敗虚血性または腎毒性損傷に続発する（ARF）は、臨床腎臓学において依然として一般的で壊滅的な問題であり、支持療法の大幅な進歩にもかかわらず、死亡率は持続的に高くなっています（1–4）。 数十年にわたる先駆的な研究により、持続的な血管収縮、尿細管閉塞、細胞の構造的および代謝的変化、およびARFの病因における炎症反応の役割が明らかになりました（4–7）。 これらの研究は動物モデルでの治療アプローチの成功への道を開いたが、ヒトでのトランスレーショナルリサーチの努力は期待外れの結果をもたらした（2–4）。 この理由には、虚血および腎毒素に対する腎臓の多面的な反応、および治療開始の遅延を伴うARFの初期マーカーの不足が含まれる可能性があります（4–8）。
これらの無数の分子基盤を早期に解明する試み腎臓応答は、虚血性ARFなどの複雑な生物学的プロセスのゲノムワイド分析のための新しいツールを生み出した機能ゲノミクスの最近の進歩によって促進されました（8–11）。 cDNAマイクロアレイ法は、数千の遺伝子の並行および定量的発現プロファイルを提供し、バイオインフォマティクスツールと組み合わせると、生物学的経路の遺伝子を識別し、新規遺伝子の機能を特徴付け、疾患サブクラスを検出できます（9）。 このスクリーニング技術を使用して、虚血後の最初の数時間以内に発現が0-倍にアップレギュレートされる7つの遺伝子のサブセットを特定しました。腎臓けがマウスモデルで。 これらの転写産物の1つであるシステインリッチタンパク質61（Cyr61）は、ごく最近、腎虚血によって誘導されることが確認されました（8）が、他の6つの差次的に発現する遺伝子の挙動はARFの文献では新しいものです。 この研究では、これらの以前は認識されていなかった遺伝子の1つ、すなわち好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）をさらに特徴づけることを選択しました。これは、特にプロテアーゼ耐性があるため、尿中で検出できる可能性のある小さな分泌ポリペプチドであるためです。 我々の結果は、NGALが虚血性および腎毒性の新規初期尿バイオマーカーを表す可能性があることを示しています腎臓けが.
材料および方法
腎虚血のマウスモデル-再灌流傷害
我々は、短期間の構造的および機能的結果が腎臓虚血は以前に文書化されています（11–15）。 簡単に説明すると、体重25〜35 gのオスのSwiss-Websterマウス（Taconic Farms、ニューヨーク州ジャーマンタウン）を12：12- hの明暗サイクルで飼育し、餌と水を自由に摂取させました。 動物をペントバルビタールナトリウム（5 0 mg / kg腹腔内）で麻酔し、直腸温を37度に維持するために加温テーブルに置いた。 3つの別々のプロトコルが使用されました：（1）ARFのない片側性虚血、（2）ARFのある両側性虚血、および（3）両側性の軽度の無症候性虚血。 片側性虚血実験では、左腎茎を非外傷性血管クランプで45分間閉塞し、その間、腎臓を温かく湿らせた。 次に、クランプを外し、腎臓の血流の戻りを観察し、切開部を縫合した。 マウスを温めたケージで回復させ、時限採尿を行った。 再灌流の0、3、12、または24時間後、動物に再度麻酔をかけ、腹腔を開き、定量的比色分析キット（Sigma、ミズーリ州セントルイス）。 マウスを殺し、腎臓をインサイチュでPBS中の4％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、両方の腎臓を採取した（右腎臓を各動物の対照として使用した）。 各リフロー期間で少なくとも3匹の別々の動物を調べた。 各腎臓の半分を液体窒素で急速凍結し、さらに処理するまで70度で保存しました。 サンプルをホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片化しました（4m）。 パラフィン切片をヘマトキシリン-エオジンで染色し、組織学的に調べた。 クランプされた腎臓は、他の人（12–14）と私たち（11）によって以前に発表されたように、虚血再灌流傷害に起因する特徴的な形態学的変化を示しました。 各腎臓の残りの半分はOCT化合物（Tissue-Tek）に埋め込まれ、免疫組織化学のために凍結切片（4 m）が得られました。 ARF実験による両側虚血の場合、両方の腎臓を30分間クランプし、上記のようにさまざまなリフロー期間で検査しました。 この8匹の動物のグループは、臨床ARFを表すように設計されており、損傷後24時間で血清クレアチニンの有意な上昇を示しました。 両側の軽度の無症候性虚血実験では、両方の腎臓を5、10、または20分間だけクランプし、上記のようにさまざまな再灌流期間で検査しました。 この軽度の損傷は、無症候性腎虚血をシミュレートするように設計されており、このグループのマウスは、損傷後24時間で測定された血清クレアチニンの上昇をまったく示しませんでした。
腎虚血のラットモデル-再灌流傷害
確立された齧歯動物モデルを使用しました腎臓虚血再灌流傷害（10）。 簡単に説明すると、体重200〜250 gのオスのSprague-Dawleyラット（Taconic Farms）をケタミン（150 g / g）とキシラジン（3 g / g）で麻酔し、微小血管クランプを使用して両側腎動脈閉塞を30分間行いました。マウスプロトコル。 再灌流の3、6、9、12、および24時間で時限採尿を行い、殺傷時（24時間）にクレアチニン測定のために血液を採取しました。
シスプラチン誘発腎障害のマウスモデル
シスプラチン投与の構造的および機能的結果が以前に文書化されている確立されたマウスモデルを使用しました（16–18）。 簡単に説明すると、マウスにシスプラチン（20 mg / kg体重）を1回腹腔内注射しました。 これにより、シスプラチン注射後3日以内に尿細管細胞の壊死とアポトーシスおよび血中尿素窒素の上昇が起こります（16–18）。 動物は代謝ケージに収容され、尿の収集は毎日得られた。
RNAの分離
マウスの全腎臓組織（または培養ヒト近位尿細管細胞;以下を参照）を組織テロ（Biospec Products、ウィスコンシン州ラシーン）で破壊しました。 コントロールおよび虚血性腎臓からのトータルRNAは、RNeasy Mini Kit（Qiagen、Valencia、CA）を使用して分離し、分光光度法で定量しました。
マイクロアレイ手順
マイクロアレイのハードウェアと手順の詳細な説明は以前に公開されています（11）。 簡単に説明すると、各実験で、1 00gの精製全マウス腎臓RNAをCy3-dUTP（Amersham、コントロールにはPiscataway、NJ）、虚血性サンプルにはCy5-dUTP。 Microcon YM -50フィルター（Millipore、ウィスコンシン州マディソン）を使用してcDNAサンプルを精製し、8979個のユニークな配列検証済みマウスプローブを含むマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせました（11）。 リフロー期間ごとに3匹の別々の動物を調べ、各動物に対して少なくとも2回の独立したマイクロアレイ実験を行った。 マイクロアレイスキャナー（GenePix 4000B; Axon Instruments、Foster City、CA）を使用してアレイスライドをスキャンし、Cy3およびCy5蛍光の個別のTIFF画像を取得しました。 Cy3およびCy5のシグナル強度は、GenePix Pro 3.0データ抽出ソフトウェア（Axon Instruments）を使用して個々の遺伝子について決定されました。 品質管理とデータ分析は前述のように完了しました（11）。
腎臓のためのシスタンチェ植物
半定量的逆転写-PCR
対照および実験用マウス腎臓からの等量（1プラス-g）のトータルRNAを、ランダムヘキサマーの存在下でSuperscript II逆転写酵素（Life Technologies）を使用して、製造元の指示に従って逆転写しました。 PCRは、キット（Roche、Indianapolis、IN）と次のプライマーを使用して行いました：マウスNGALセンス5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC -3'、マウスNGALアンチセンス5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG -3'、ヒトNGALセンス5'-TCAGCCGTCGATACACTGGTC-3'、およびヒトNGALアンチセンス5'-CCTCGTCCGAGTGGTGAGCAC-3'。 マウスとヒトのプライマーペア-アクチンとグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は、Clontech（La Jolla、CA）から入手しました。 cDNAを欠く模擬反応はネガティブコントロールとして機能しました。 PCR産物は、アガロースゲル電気泳動とそれに続くエチジウムブロマイドでの染色によって分析され、デンシトメトリーによって定量化されました。 虚血性腎臓と対照腎臓におけるNGALmRNA発現の倍数変化は、-アクチンまたはGAPDH増幅の正規化後に発現しました。
顕微鏡検査
NGAL検出のために、凍結切片をPBS中の{{0}}。2パーセントTriton X -100で10分間透過処理し、ヤギ血清で1時間ブロックし、NGALに対する一次抗体とインキュベートしました（ 1：500希釈）1時間。 次に、スライドを暗所で30分間、Cy5（Amersham、Arlington Heights、IL）と結合した二次抗体に曝露し、ローダミンフィルターを備えた蛍光顕微鏡（Zeiss Axiophot）で可視化しました。 NGALとRab11の共局在化のために、連続切片を最初にNGAL抗体またはRab11に対するモノクローナル抗体（1：500希釈、Transduction Laboratories）とインキュベートし、次にCy5（NGALの場合）またはCy3（Rab11の場合）と結合した二次抗体とインキュベートしました。 ）およびローダミンまたはフルオレセインフィルターでそれぞれ視覚化。 NGALと増殖細胞核抗原（PCNA）の共局在化のために、切片をNGAL抗体およびPCNAに対するモノクローナル抗体（1：500希釈、Upstate）と共培養し、免疫ペルオキシダーゼ染色（ImmunoCruz Staining System、サンタクルーズバイオテクノロジー）。 TUNELアッセイには、ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit（Clontech）を使用しました。 パラフィン切片をキシレンおよび下降グレードのエタノールで脱パラフィンし、4％ホルムアルデヒド/ PBSで4度で30分間固定し、プロテイナーゼKで室温で15分間透過処理し、0.2％Triton X -100/PBSで15分間透過処理しました。 4度で分、37度で60分間ヌクレオチドとTdT酵素の混合物とインキュベートしました。 反応を2SSCで停止し、切片をPBSで洗浄し、Crystal /マウント（Biomed、カリフォルニア州フォスターシティー）でマウントした。 TUNEL陽性アポトーシス核は、蛍光顕微鏡による視覚化によって検出されました。
尿コレクション
マウスまたはラットを代謝ケージ（Nalgene、ニューヨーク州ロチェスター）に入れ、両側性の前後に1時間ごとに尿を採取しました。腎臓動脈閉塞。 尿サンプルを5000gで遠心分離して破片を除去し、上清をウエスタンブロッティングで分析しました。 尿中クレアチニンは、定量的比色分析キット（Sigma）によって測定され、尿中NGAL測定用のサンプルが正規化されました。 尿中のN-アセチル-D-グルコサミニダーゼ（NAG）を測定するための比色分析キットはRocheから入手しました。
細胞培養
人間腎臓近位尿細管上皮細胞（RPTEC）は、Clonetics（San Diego、CA）から入手しました。 細胞は腎臓補足された上皮細胞基礎培地腎臓上皮細胞増殖培地（REGM）複合体（{{0}}。5 l / mlヒドロコルチゾン、10 pg / ml hEGF、0。5 - g / mlエピネフリン、6.5 pg / mlトリヨードチロニン、10プラス-製造業者が推奨するように、g / mlトランスフェリン、5 - g / mlインスリン、1 - g / mlゲンタマイシン硫酸塩、および2パーセントFBS）。
培養細胞の軽度のATP枯渇
酸化的リン酸化の阻害剤を用いたATP枯渇により、前述のin vitro虚血のプロトコルを変更しました（19,20）。 コンフルエンス後2日目に、RPTEC細胞を1 mのアンチマイシンA（Sigma）とともに、最大6時間までさまざまな時間インキュベートしました。 これにより、MDCK（19）や786- O（20）細胞など、他の種類の培養腎上皮細胞では、軽度の部分的な可逆的ATP枯渇が生じ、細胞生存率が失われないことを以前に示しました。 ルシフェラーゼベースのアッセイキット（Sigma）を使用してATPレベルをモニターし、コントロール値のパーセンテージとして表した。 ATP枯渇のさまざまな時点で細胞を回収し、逆転写PCR（RT-PCR）によるNGAL mRNA発現と、ウエスタン分析によるNGALタンパク質発現について分析しました。 培地へのNGALの分泌もモニターされた。
その他の材料と方法
特に指定がない限り、すべての化学物質はSigmaから購入しました。 ウエスタンブロッティングでは、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で測定し、各レーンに等量の総タンパク質をロードしました。 - -チューブリン（Sigma）に対するモノクローナル抗体を1:10で使用し、000希釈してタンパク質の負荷が等しいことを確認し、NGALに対するポリクローナル抗体を1：500で使用しました（21）。 2-ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体を1：500（Sigma）で使用しました。 転移したタンパク質の免疫検出は、増強された化学発光（Amersham）を使用して達成された。
結果
初期腎虚血再灌流傷害の動物モデルの特徴
短期間の腎虚血の構造的および機能的結果が記録されているマウスモデルを使用しました（11–15）。 虚血性損傷の特徴的な組織病理学的特徴は、片側（45分）および両側（30分）の両方の虚血後の24-h再灌流サンプルで容易に明らかになった。 これらには、刷子縁膜の喪失、管状拡張、平坦化された管状上皮、管腔破片、および間質性浸潤が含まれていました（図1）。 TUNELアッセイを使用して、アポトーシス細胞の存在を記録しました。 アポトーシスは主に、内腔内の剥離した細胞と付着した細胞の両方で、ヘンレ係蹄の遠位尿細管細胞と上肢に局在していた。 時折近位尿細管細胞もアポトーシスを起こしましたが、糸球体は本質的にアポトーシスを欠いていました。 対照腎臓またはTdTが省略された虚血性サンプルではTUNEL陽性細胞は検出されませんでした（図示せず）。 上記の組織学的およびアポトーシスの変化は、軽度の虚血（5、10、または20分の両側虚血;示されていない）にさらされた腎臓には見られなかった。 血清クレアチニンレベルは、観察された組織病理学的変化を反映していた。 したがって、片側性腎虚血または軽度の無症候性両側性虚血を有するマウスは、対照動物と区別できない血清クレアチニンレベルを示したが、30分間の両側性虚血を有するマウスは、血清クレアチニンの有意な上昇を示した（図1）。
図1.虚血性のマウスモデルの特性評価腎臓けが。 左のパネルは、対照マウスまたは虚血再灌流（IRI）の24時間後の腎臓切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色（上）およびTUNEL染色（下）の結果を示しています。 （右）示されているように、45分間の片側虚血後（U45）、または様々な期間の両側虚血後の対照マウス（Con）における血清クレアチニン測定の結果。 *P0。05対コントロール。 バー内の数字は動物の数を示しています。
NGAL mRNAは、虚血後の初期の腎臓で著しく誘導されます
片側性のマウスのマイクロアレイ分析による腎臓虚血、NGALは一貫して誘発されることがわかった（3.2プラス- 0。5-倍、11.1プラス- 1。2-倍、および4.3プラス{{1 {{30} }}}。6-同じ動物の対照腎臓と比較した場合の虚血性マウス腎臓の再灌流の3、12、および24時間での倍数（平均プラス-各時点での3匹の動物のSD）。 この発見は、プラスアクチンとGAPDHの両方を使用した正規化プロトコルを使用した半定量的RT-PCRによって確認されました。 以前に記載されたように（11）、調べた再灌流期間のいずれにおいても、プラス-アクチンまたはGAPDHのいずれかのmRNA発現に有意な変化は認められなかった。 ただし、マウス固有のプライマーを使用して、NGAL mRNA発現の有意なアップレギュレーションを検出しました（4.1プラス-0。5-倍、9プラス-0。6-倍、および4.2プラス0。4-再灌流のそれぞれ3、12、および24時間で倍増します。ここで、値は平均プラス-3匹の別々の動物からのSDを表します）。 これらの結果は図2に示され、トランスクリプトーム解析によって検出された変化と全体的に一致しています。
図2.虚血後のマウス腎臓好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）mRNAの誘導。 （上）コントロール（C）マウスの腎臓から抽出されたRNAを使用した、または示されているさまざまな再灌流期間（時間）後の、マウスアクチンおよびNGAL用のプライマーを使用した代表的な逆転写PCR（RT-PCR）。 レーンMには、100-bpDNAラダーが含まれています。 （下）コントロール（CON）からのさまざまな時点でのNGALmRNA発現の倍増。 マイクロアレイ（実線）とRT-PCR（点線）で得られた値は、各時点での3回の実験から得られた平均SDです。
NGALタンパク質は、初期の虚血性マウス腎臓の近位尿細管で著しく過剰発現しています
次に、腎臓でのNGALタンパク質の虚血後の発現がmRNAの発現と平行しているかどうかを判断することが重要でした。 ウエスタン分析によると、NGALは対照マウスの腎臓で25-kD免疫反応性ペプチドとして検出されました。 NGALとしてのこのバンドの同一性は、組換えマウスリポカリンとの一次抗体のプレインキュベーションがこの免疫反応性を完全にブロックした別の一連の実験で確立されました（図示せず）。 片側虚血実験では、図3に示すように、損傷から3時間以内に5匹の別々の動物からの虚血性腎臓でデンシトメトリーによってNGAL発現が3〜4倍誘導されました。この応答は、8匹の別々の動物からの両側虚血実験で劇的に増強されました。 。 これらのマウスのNGALは、3時間の再灌流後に3倍に誘導され、24- hサンプルでは12-倍でピークに達し、72- hの回復期間までに正常レベルに低下しました（図3）。 。
図3.片側または両側の虚血後のマウス腎臓NGALタンパク質の誘導。 （上）コントロール（Con）マウスから、または示されているように再灌流期間（時間）後に得られた、NGALに対するポリクローナル抗体またはチューブリンに対するモノクローナル抗体（等しいタンパク質負荷を示すため）でプローブされた全腎臓サンプルの代表的なウエスタンブロット。 分子量マーカーは左側にあります。 （下）コントロール（CON）からのさまざまな時点でのNGALタンパク質発現の倍増。 デンシトメトリーによって得られた値は、片側性虚血の場合は5匹、両側性虚血の場合は8匹の動物の平均SDです。
次に、免疫組織化学的手法を使用して、NGALタンパク質が対照マウスの腎臓ではほとんど検出されないが、図4に示すように、虚血から3時間以内に近位尿細管で主にアップレギュレーションされることを示しました。これらのセクションの近位尿細管の識別は、ブラシの存在に基づいていました。境界膜、細胞サイズに対する核の比率、および細胞形態。 誘導されたNGALは、近位尿細管細胞内の点状の細胞質分布に現れ、分泌タンパク質を連想させます。 この発現パターンは、虚血再灌流傷害の片側モデルと両側モデルの両方で同一であり、研究されたすべての動物で一貫して明らかでした。 糸球体にはNGALの発現がなく、NGALを発現する好中球は見られませんでした。 NGALは培養ウィルムス腫瘍腎臓細胞で少なくとも部分的にエンドソームと共局在することが示されているため（21）、NGALとRab11（後期リサイクルエンドソームのマーカー）の分布を連続切片で調べました。 マージされた画像は、NGALとRab11の有意な共局在を示しました（図4）。 虚血後の強化されたNGAL発現の機能的重要性を調査するために、NGAL発現、TUNEL陽性核、またはPCNA陽性核について連続腎臓切片を調べました。 NGALを過剰発現する尿細管細胞はTUNEL陽性ではありませんでしたが（図示せず）、48- hのリフロー期間で増殖および再生細胞でNGALとPCNAの有意な共局在が明らかでした（図4）。
図4.虚血後のマウス腎臓NGALタンパク質の誘導。 （上）NGALに対するポリクローナル抗体でプローブした、対照マウスから、または示されているようにリフローのさまざまな期間（時間）後に得られたマウス腎臓の凍結切片の代表的な免疫組織化学の結果。 G、糸球体。 HPというラベルの付いたパネルはハイパワー100プラス倍率で、他のパネルは20にあります。（下）左の2つのパネルは、NGAL（赤）またはRab11（緑）を表す3時間の再灌流後の尿細管を示しています。 3番目のパネルはマージされた画像を示しており、黄色で共局在していることを示しています。 右端のパネルは、48時間のリフロー後の尿細管における増殖細胞核抗原とNGALの共局在を示しています。
NGALタンパク質は、マウスにARFが誘導された直後に尿中で容易に検出されます
次に、NGALタンパク質の虚血後の発現が尿中で検出できるかどうかを判断することは非常に興味深いことであり、それにより、虚血の初期の非侵襲的バイオマーカーとしてのその有用性が示唆された。腎臓けが。 尿中クレアチニン濃度を使用してサンプルの負荷を均等化すると、虚血前にNGALが尿中に存在しなくなりました。 対照的に、NGALは、以下に示すように、検査したすべての動物（片側性虚血で5匹、両側性虚血で8匹）において、損傷から2時間以内（虚血後の最初の尿量）に25-kDバンドとして現れました。図5.NGALとしてのこのバンドの同一性は、一次抗体と組換えマウスリポカリンとのプレインキュベーションがこの免疫反応性を完全にブロックした別の一連の実験で確立されました（図示せず）。 注目すべきことに、NGALは、ウエスタン分析によってわずか1 lの未処理尿で容易に検出され、検査された全期間（24時間の再灌流）持続しました。 次に、尿中NGAL排泄を、2-マイクログロブリンやNAGなどの以前に確立された傷害マーカーの排泄と比較しました。 尿中NGALは虚血から2時間以内に明らかでしたが、2-ミクログロブリンは同じ尿サンプルで片側性虚血の12時間後と両側性虚血の8時間後にのみ検出されました（図5）。 同様に、尿中NAG排泄は、非虚血性対照動物と比較した場合、片側性虚血の12時間後および両側性虚血の8時間後にのみ有意に増加しました（図5）。
図5.虚血性急性マウスの尿中のNGALタンパク質の早期発見腎臓失敗（ARF）。 （上）未処理の尿サンプルの代表的なウエスタンブロット（レーンあたり1〜2プラス-l、クレアチニン含有量で正規化）は、片側または両側の後、示されているように（時間）再灌流期間で得られました腎臓動脈クランプ。 分子量マーカーは左側に示されています。 ブロットはNGAL（上）または{{0}}ミクログロブリン（ベータ2- M;中央）でプローブされました。 （下）片側性虚血の場合は5匹、両側性虚血の場合は8匹の、示されているさまざまな再灌流期間での尿中N-アセチル--D-グルコサミニダーゼ（NAG）の測定。 値は平均SDです。 * P 0.05対各時点での対照、ANOVA。
NGALタンパク質は、マウスの軽度の腎虚血後でも尿中で容易に検出されます
明白なARFがない場合の尿中NGAL検出の感度を決定するために、マウスの別々のセットが5、10、または20分の両側にのみさらされるプロトコルを使用しました。腎臓動脈閉塞。 これらの研究は、軽度の無症候性腎虚血後の尿中NGAL排泄を評価するために設計されました。 リフローの24時間後に測定された血清クレアチニンは、これらすべてのマウスで正常範囲内でした（図1）。 印象的なNGALは、これらの動物の未処理の尿1 lで簡単に検出されましたが（図6）、ARFが明らかな動物と比較して外観は多少遅れていました。 したがって、30分の両側虚血は2時間以内に尿中NGAL排泄をもたらしたが（図5）、20分または10分の両側虚血を伴うマウスは4時間後に尿中NGALを示し、5分間の虚血を伴うマウスは6時間後にのみNGALを排泄した（図6）。 したがって、尿中のNGALの出現は、腎虚血の用量および期間と相関します。
NGALタンパク質はラットでARFを誘発した直後に尿中で容易に検出されます
図6.無症候性腎虚血のマウスの尿中のNGALタンパク質の検出。 両側腎動脈クランプの5、10、または20分後、示されているように（時間）再灌流期間で得られた未処理の尿サンプル（レーンあたり1〜2 l、クレアチニン含有量で正規化）の代表的なウエスタンブロット。 分子量マーカーは左側に示されています。 これらの動物は、リフローの24時間で正常な血清クレアチニンを示した。
腎動脈閉塞に対する反応の種差に関して議論が存在するため（22）、次に、別の動物モデル、すなわち腎虚血再灌流傷害の確立されたラットモデルにおけるNGALの挙動を調べました。 尿中クレアチニン濃度を使用してサンプルの負荷を均等化すると、虚血前にNGALが尿中に存在しなくなりました。 著しく対照的に、NGALは、図7に示すように、損傷から3時間以内に25- kD免疫反応性ペプチドとして現れました（虚血後の最初の尿量）。虚血性損傷は、24時間の再灌流後にのみ上昇した（示されていない）。 この場合も、NGALは1リットルの未処理尿で検出可能であり、検査した全期間（24時間の再灌流）持続しました。
図7.虚血性ARFのラットの尿中のNGALタンパク質の早期発見。 ラットでの両側腎動脈クランプの30分後、示されているように（時間）再灌流期間で得られた未処理の尿サンプル（レーンあたり1〜2 l、クレアチニン含有量で正規化）の代表的なウエスタンブロット。 分子量マーカーは左側に示されています。 これらの動物は、リフローの24時間で血清クレアチニンの有意な増加を示しました。
NGAL mRNAは、初期の軽度虚血後の培養ヒト近位尿細管細胞で誘導されます
虚血性近位尿細管細胞からのNGALの起源を確認するために、培養ヒト近位尿細管細胞（RPTEC）でのATP枯渇によるinvitro虚血の前述のプロトコルを変更しました。 インキュベーションはアンチマイシンの1-mであり、1時間以内にコントロールの約83プラス3パーセントまで軽度の部分的ATP枯渇をもたらし、6時間までにコントロールの約75プラス- 3パーセントまで徐々に減少しました（平均-4回の実験からのSD）。 この軽度のATP枯渇の形態学的結果は識別できませんでした。 NGAL mRNAは、休止細胞で検出可能でした。 ただし、図8に示すように、部分的なATP枯渇後、NGALmRNAの迅速かつ持続時間依存性の誘導がRT-PCRによって明らかになりました。
NGALタンパク質はinvitroでの初期虚血後の培地で簡単に検出されます
次に、軽度のATP枯渇後のRPTEC細胞および培地でのNGALタンパク質の発現を調べました。 NGALタンパク質はコントロールRPTEC細胞で検出可能であり、図8に示すように、ATP枯渇後にその発現が持続時間依存的に増加しました。コントロール細胞の培地ではNGAL免疫反応性タンパク質は検出されませんでしたが、NGALは1以内で容易に検出されました。軽度のATP枯渇のh（図8）。 ATP枯渇の期間に関連して、NGALタンパク質の存在量のさらなる増加が認められました。 これらの結果は、インビボでの腎虚血後の尿中のNGALの迅速な出現と同様に、誘導されたNGALタンパク質が培地に急速に分泌されることを示唆している。
図8.invitroでの虚血後のNGALmRNAの誘導。 （上）示されているように（時間）部分的なATP枯渇のさまざまな期間の後に腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC）細胞から抽出されたRNAを使用したヒトNGAL用のプライマーを用いた代表的なRT-PCR。 レーンMには100-bpのDNAラダーが含まれています。 （中央）グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ発現に対して正規化された、コントロール（0）からのさまざまな時点でのNGALmRNA発現の倍増。 示されている値は、各時点での3回の実験からの平均SDです。 （下）NGALに対するポリクローナル抗体でプローブされた等量の細胞ペレット（Pel）または培地（Sup）から得られた、示されているように部分的なATP枯渇のさまざまな期間（時間）後のRPTECサンプルによる代表的なウエスタンブロット。 分子量マーカーは左側にあります。 この図は、3つの別々の実験を表しています。
NGALタンパク質は、シスプラチン誘発腎毒性の誘発後早期に尿中で容易に検出されます
次に、他の形態の尿細管細胞損傷後にNGALが尿中に検出される可能性があるかどうかを判断したいと思いました。 シスプラチン腎毒性の確立されたマウスモデルでは、NGALはシスプラチン投与の1日以内に尿中に容易に検出されました（図9）。 対照的に、尿中の2-ミクログロブリンは2日後にほとんど検出できず、シスプラチン後4〜5日目まで確実に検出できませんでした。 同様に、尿中NAG排泄の増加は、シスプラチン投与後4日目と5日目まで明らかではありませんでした（図9）。
図9.シスプラチン誘発性損傷のあるマウスの尿中のNGALタンパク質の早期発見。 （A）シスプラチン投与後の日数で得られた未処理の尿サンプル（レーンあたり1〜2 l、クレアチニン含有量で正規化）の代表的なウエスタンブロット。2-ミクログロブリンまたはNGALに対する抗体でプローブ。 分子量マーカーは左側に示されています。 （B）シスプラチン投与後のさまざまな日における尿中NAG測定（n4）。 値は平均プラス-SDです。 *P0。05対0日目。
討論
トランスクリプトーム全体の調査戦略を使用して、腎虚血後早期に誘導される腎遺伝子を特定しました。そのタンパク質産物は、ARFの新規バイオマーカーとして機能する可能性があります。 10-倍にアップレギュレートされている7つの遺伝子を特定し、そのうちの1つ（Cyr61）が腎虚血後に誘導されることが最近報告されました（8）。 予期せぬことに、他の6つの転写産物の誘導はARF分野にとって目新しいものでした。 この研究では、これらの以前は認識されていなかった遺伝子の1つ、つまりNGALをさらに特徴づけることを選択しました。
NGALは、- 20構造的に関連する分泌タンパク質のリポカリンスーパーファミリーに属しており、バレル状のカリックス内でさまざまなリガンドを輸送すると考えられています（23）。 ヒトNGALは、当初、ヒト好中球のゼラチナーゼに共有結合した25- kDタンパク質として同定され、好中球の二次顆粒タンパク質の1つを表しています（24,25）。 分子クローニング研究により、ヒトNGALは、増殖が誘導されたマウス腎臓の初代培養で最初に同定されたマウス24p3遺伝子に類似していることが明らかになりました（26）。 NGALは、腎臓、気管、肺、胃、結腸などの他のヒト組織では非常に低レベルで発現しています（27）。 NGALの発現は刺激された上皮で著しく誘導されます。 例えば、それは炎症または新生物の領域の結腸上皮細胞でアップレギュレーションされますが、介在する非関与領域または転移性病変内には存在しません（28）。 NGAL濃度は、急性細菌感染症の患者の血清（29）、喘息または慢性閉塞性肺疾患の患者の喀痰（30）、および気腫性肺からの気管支液（31）で上昇します。 これらすべての場合において、NGAL誘導は、炎症細胞と上皮内層との間の相互作用の結果であると仮定されており、NGAL発現のアップレギュレーションは好中球と上皮の両方で明らかです（28-32）。
成熟した腎臓におけるNGALのアップレギュレーションはこれまで記載されていませんでした。 私たちの研究から収集されたいくつかの証拠は、検出されたNGAL誘導が、虚血性損傷に対する腎臓近位尿細管細胞の新しい内因性応答を表し、単に活性化された好中球に由来するものではないことを示唆しています。 まず、反応は非常に速く、損傷から2時間以内にNGALが尿中に現れ（腎動脈閉塞後の最初の尿排出量）、この虚血性ARFモデルにおける腎好中球の蓄積は通常4時間で最初に認められます。負傷後（33–35）。 第二に、NGAL誘導と好中球蓄積の時間的パターンは異なる。 NGAL mRNAおよびタンパク質の発現はリフローの12時間で最大に認められましたが、好中球の蓄積は24時間（33〜35）でピークに達し、その時点でNGALの発現は大幅に低下しました。 第三に、NGALを発現する好中球は、調べた腎臓サンプルの蛍光抗体法では検出できませんでした（図4）。 4番目で最も説得力のあるNGALmRNAおよびタンパク質の誘導は、in vitro虚血後の培養ヒト近位尿細管細胞で発生し、好中球が完全に存在しないシステムでは、ATP枯渇から1時間以内にNGALが培地に分泌されることが報告されています。 しかし、私たちのin vivo研究では、観察されたNGALのアップレギュレーションに対する活性化好中球の浸潤による寄与を完全に排除することはできません。 確かに、尿細管細胞におけるNGALのアップレギュレーションは、虚血性損傷後早期に微小循環に閉じ込められた好中球からのサイトカインの局所放出によって誘発される可能性があります。
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刺激された上皮によるNGALの誘導についての適切な説明は不足しており、NGALが傷害に対して保護的であるか、近接しているか、あるいは無実の傍観者でさえあるかどうかは不明である。 最近の証拠は、少なくとも細胞型のサブセットでは、NGALがアポトーシス促進性分子を表す可能性があることを示唆しています（36–38）。 マウスpro-Bリンパ球細胞株では、サイトカインの除去により、NGALが著しく誘導され、アポトーシスが開始されました（36,37）。 NGALは生殖組織のアポトーシスにも関連しています。 退縮した乳腺と子宮の上皮細胞は、最大アポトーシスの期間と一時的に一致する高レベルのNGALを発現します（38）。 NGALはアポトーシスを誘導することにより細胞集団のサブセットを調節している可能性があります。 刺激された上皮は、NGALをアップレギュレーションして、浸潤性好中球のアポトーシスを誘導し、それによって、常在細胞が炎症反応の破壊を生き残ることを可能にする可能性があります。 あるいは、上皮細胞は、このメカニズムを利用して、自身の死を調節することができます。 しかし、我々の研究では、初期の腎虚血再灌流傷害後のNGALの誘導は、主にTUNEL陽性核を示さなかった近位尿細管細胞で起こることに注目するのは興味深いことです。
他の最近の研究は、NGALが上皮表現型を増強することを明らかにしました。 NGALは、貫通する尿管芽によって発現され、間葉系細胞の腎臓上皮への変換を刺激することによって腎形成を引き起こします（21）。 別のリポカリンであるグリコデリンは、ヒト乳がん細胞で発現した場合に上皮表現型を誘導することが示されています（40）。 これらの所見は特に成熟腎臓に関連しており、虚血性損傷に対する十分に立証された反応の1つは、近位尿細管を裏打ちする脱分化した上皮細胞の顕著な出現です（41）。 虚血性損傷後の腎臓の再生と修復の重要な側面には、上皮表現型の再獲得が含まれます。これは、正常な発達のいくつかの側面を再現するプロセスです（42）。 これは、NGALが損傷した尿細管によって発現されて再上皮化を誘発する可能性があることを示唆している。 この概念の支持は、腎形成中のトランスフェリンに相補的な鉄輸送タンパク質としてのNGALの最近の同定に由来しています（21）。 細胞への鉄の送達が細胞の成長と発達に重要であることはよく知られており、これは個体発生中と同じように虚血後の腎再生におそらく重要です。 NGALは鉄に結合して輸送するように見えるため（21）、NGALは損傷した近位尿細管上皮細胞から放出される鉄の吸収源として機能する可能性もあります。 NGALは近位尿細管によってエンドサイトーシスを受ける可能性があるため（K.MoriおよびJ.Barasch、未発表の観察）、タンパク質は鉄を生細胞に再利用する可能性があります。 これは、成長と発達を刺激するだけでなく、反応性分子である鉄を組織損傷部位から除去し、それによって鉄を介した細胞毒性を制限する可能性があります。 PCNA陽性の再生および増殖尿細管細胞におけるNGALの共局在を示す我々の結果は、この仮説をさらに支持する。
私たちの発見の主な意味は、NGALが虚血性の新しい尿中バイオマーカーである可能性に関係しています。腎臓けがこれは、説明されている他のバイオマーカーと比べて遜色ありません。 おそらく最もよく研究されている例は、腎再生に関与する推定接着分子である腎障害分子-1（KIM -1）です（43,44）。 虚血再灌流傷害のラットモデルでは、KIM -1は、最初の発作から24〜48時間後にアップレギュレーションされることがわかり、信頼できるが、尿細管細胞損傷のやや遅いマーカーになりました。 最近の洗練された研究は、KIM -1が虚血性急性尿細管壊死の患者の腎生検と尿で検出できることを示しています（45）。 ただし、この検出は、確立された虚血性腎障害のある患者で文書化されており、これまでのところ、初期の無症候性損傷の検出のための尿中KIM-1測定の有用性は検証されていません。 別の最近の例では、Cyr61は、虚血性腎障害の3〜6時間後に尿中で検出可能なシステインリッチタンパク質の分泌であることがわかりました（8）。 ただし、この検出にはヘパリン-セファロースビーズを使用したバイオアフィニティー精製ステップが必要であり、そのような精製後でも、いくつかの交差反応性ペプチドが明らかになりました。 対照的に、我々の研究は、NGALがウエスタンブロットで比較的きれいな免疫反応性ペプチドとして容易かつ迅速に検出され、マウスとラットの両方で腎虚血後の最初の未処理の尿排出量がわずか1リットルであることを示しています。 さらに、尿中NGALは、正常な血清クレアチニンレベルにもかかわらず、非常に軽度の「無症候性」腎虚血後でも明らかでした。 さらに、尿中NGALの検出は、2-ミクログロブリンやNAGなどの従来のマーカーが尿中に現れるよりもはるかに先行していました。
最後に、NGALは、シスプラチン投与後の早い段階で、他の形態学的および生化学的指標が腎臓けが欠席しました。 したがって、NGALのアップレギュレーションと尿中排泄は、さまざまな傷害に対する尿細管細胞の迅速な応答を表す可能性があり、尿中のNGALの検出は、尿細管細胞損傷の早期診断に広く適用可能な非侵襲的臨床ツールを表す可能性があります。
要約すると、我々のデータは、NGALが腎虚血の新規で高感度の非侵襲性尿バイオマーカーであることを示しています。 軽度および初期の虚血性患者の尿中のNGALの発現を調べることは、将来の翻訳作業において重要になるでしょう。腎臓けが。 このような早期発見により、臨床医がARFにタイムリーな介入努力を開始できるようになることが期待されます。この状態は、新しい治療法が切実に必要とされている悲惨な予後に関連しています。 さらに、微妙な無症候性虚血患者における尿中NGALのこのような迅速かつ簡単な検出が期待されています。腎臓けが（例えば、生体関連の腎臓移植、血管手術、心臓血管イベント）または無症候性腎毒性損傷（例えば、造影剤およびアミノグリコシドの使用）は、顕性ARFへの進行を防ぐことを目的とした操作を開始するように臨床医に警告します。
謝辞
この作品は、国立衛生研究所/国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所からPD（DK53289、DK52612）およびJB（DK55388およびDK58872）への助成金によってサポートされていました。
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