ガチョウ腎炎アストロウイルスに感染したゴスリングの腎臓と脾臓における免疫関連遺伝子発現

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概要ガチョウ腎炎アストロウイルス（GNAstV）は、2018年に最初に分離され、ガチョウ産業に多大な経済的損失をもたらしました。 ただし、ホストについてはほとんど知られていません免疫応答GNAstV感染に。 この研究では、40日齢のゴスリングをランダムに2つのグループに分けました：感染群と陰性対照群。 感染群の各ゴスリングに0.5mLのGNAstV-JSHAを筋肉内投与したのに対し、陰性対照群のゴスリングには同量のPBSを接種しました。 の組織病理学的変化とウイルスの位置脾臓と肝臓免疫関連遺伝子の発現を調べ、感染後7日目と14日目にqPCRで測定しました。 我々の結果は、GNAstV感染によって誘発された脾臓リンパ球および腎上皮細胞の変性および壊死を示し、これらの細胞はウイルスに対して陽性であった。 さらに、GNAstV感染は、パターン認識受容体（RIG-I、MDA -5、およびTLR3）と主要なアダプター分子の活性化を誘導しました

（MyD88、MAVS、およびIRF7）脾臓と腎臓で、脾臓でのインターフェロンの遺伝子発現と、脾臓と腎臓での抗ウイルスタンパク質（MX1、OASL、およびIFITM3）をアップレギュレートしました。 さらに、脾臓ではインターロイキン（IL）-1とIL -8の高発現レベルが見られ、脾臓と腎臓ではiNOSが見られました。 これらの結果は、GNAstV感染が宿主の自然免疫応答を活性化したことを示しています。 さらに、GNAstV感染は、CD8t、MHCI、およびMHCIIの発現レベルを増加させ、適応免疫応答が活性化されたことを示しています。 さらに、TGF-は脾臓と腎臓で高度に発現しており、これは感染を引き起こすGNAstVの免疫回避戦略である可能性があります。 興味深いことに、IL-1とIL-6の両方のmRNAレベルが腎臓で減少し、腎臓の病変を減らすのに役立つ可能性があります。 これは、GNAstV感染に応答した免疫関連遺伝子発現の変化を報告する最初の研究であり、我々の結果はウイルスの病因への洞察を提供します。

キーワード：ガチョウ腎炎アストロウイルス、免疫応答、脾臓、腎臓、ゴスリング

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前書き

2017年以降、中国東部の4-から16-日齢のガチョウで、いくつかのガチョウの群れが痛風の深刻な発生を経験し、ガチョウ産業に大きな経済的損失をもたらしました。 感染したゴスリングは、体重の減少、腎臓の腫れと青白さを示し、尿管に白い尿酸があり、内臓と関節腔の表面に尿酸の性質がありました。 2018年に、感染したゴスリングから新しいガチョウアストロウイルスが分離され、動物の繁殖実験により、それがゴスリング痛風病の主な原因物質であることが証明されました。 このウイルスは、既知のママアストロウイルスおよびアストロウイルスとは遺伝的に異なっていました。 ゲノムの最も可変的な領域である全長ORF2タンパク質（キャプシドタンパク質）のアミノ酸配列に従って、明確な分岐群を形成しました。 したがって、ウイルスがゴスリングに与えるダメージにもっと注意を払う必要があります。 本研究では、新しいガチョウアストロウイルスはガチョウ腎炎アストロウイルス（GNAstV）と呼ばれています。

GNAstVは新たに出現したウイルスであるため、ほとんどの研究は、その分離、遺伝子分析、および診断方法の確立に焦点を合わせています（Yuan et al。、2018; Wan et al。、2019; Yin et al。、2020）。 ただし、GNAstV感染に対する宿主の免疫応答についてはほとんど知られていません。 ガチョウ腎炎アストロウイルスは、主にゴスリングの腎臓、肝臓、脾臓に損傷を与え、他の臓器と比較して腎臓と脾臓でより高いウイルス量が検出されています（Jin et al、2018; Xu et al、2019）。 脾臓病変と高いウイルス量は、ウイルスが免疫応答に損傷を与える可能性があることを示しています。 自然免疫系は、ウイルスの侵入に対する防御の第一線として機能することにより、ウイルス感染時に重要な役割を果たします（Chow J et al。、2015）。 パターン認識受容体（PRR）は、ウイルスの核酸を認識し、I -1、TNF-x、IFNなどのサイトカイン、およびOASL、IFITM3、MX1などの抗ウイルスタンパク質の産生を含む先天性応答を誘発します。 膜結合型トール様受容体3（TLR3）と、主にRIG-1とMDA-5を含むサイトゾルRIG-I様受容体は、ウイルスRNAを認識する最も重要なPRRです。 自然免疫応答は、適応免疫応答を誘発するシグナル伝達を誘導します。適応免疫応答は、感染の次の段階でウイルス感染を制御します。 適応免疫には、抗体媒介性/ B細胞応答I応答と細胞性応答が含まれ、CD3プラス、CD4プラス、CD8プラス、およびMHCクラスIおよびII分子の関与が必要です。 現在、GNAstVが宿主の自然免疫および獲得免疫応答に影響を与えるメカニズムは不明です。 中国は世界で最も高いガチョウの個体数の故郷です。 したがって、GNAstV感染に対するガチョウの免疫応答を調査することは、GNAstVの病原性と免疫のメカニズムを解明し、その広がりを制御するために重要です。 この研究では、2-日齢のゴスリングがGNAstVに感染しました。 次に、組織病理学的変化およびウイルスの位置、ならびに脾臓および腎臓における免疫関連遺伝子発現を調べた。

材料および方法

倫理声明

すべての動物実験は、科学技術省（北京、中国）の実験動物ガイドラインに従って実施され、南京農業大学の動物実験委員会によって承認されました。

ウイルス

GNAstV-JSHA分離株（GenBankアクセッション番号MK125058）は、痛風のある病気のゴスリング（中国江蘇省）から分離され、私たちの研究室に保管されました。 GAstV-JSHAの力価は1×104でした。リード・ミュンヒの方法に従ってガチョウの腎臓上皮細胞を滴定することにより決定された組織培養感染量（TCID50）/mLのパーセント。

動物実験

脾臓と腎臓のサンプルは、Xuの研究（Xuet al。、2 0 19）に記載されている以前の動物実験から収集されました。 簡単に説明すると、2- GNAstVに感染していない1日齢の40匹のゴスリングを、感染群と陰性対照群の2つのグループにランダムに分けました。 感染群の各ゴスリングは筋肉内接種によって0.5mLのGNAstV-JSHAでチャレンジされましたが、陰性対照群のゴスリングには同量のPBSが接種されました。

すべてのゴスリングは、臨床症状について毎日監視されました。 感染後7日（dpi）に、各グループの10匹のゴスリングを安楽死させ、肉眼的変化を調べた後、腎臓と脾臓を採取しました。 これらの問題の一部は組織病理学的検査のために10％ホルムアルデヒドで修正され、残りはさらなる実験のために-80度で保管されました。 14 dpiで、生き残ったゴスリングを安楽死させ、組織を収集して上記のように保存しました。

組織病理学的検査

固定されたサンプルは一連のアルコールで脱水され、キシレンで清澄化され、パラフィンに包埋されました。 次に、サンプルを4μmの切片に連続的にスライスし、通常の方法でヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。 染色された切片を光学顕微鏡で調べた。

InSituハイブリダイゼーションによるウイルス位置検出

インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法は、いくつかの修正を加えて、市販のISHキット（ボスター、中国）の指示に従って実施された。 ISHを実行する前に、サンプルの感度と特異性をテストし、一連の前処理によって最適化しました。 簡単に説明すると、脱パラフィンした組織切片をHCl（0 .2 M、15分）とプロテイナーゼK（4 0 ug / mL、20分、37度）で前処理しました。 プロテアーゼKは、4％パラホルムアルデヒドで5分間固定することにより阻害されました。 次に、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後のステップを実施した。 プローブを0の濃度でハイブリダイゼーションバッファーに加えました。5-2ug/ mL; プローブを含むバッファーを98度で10分間変性させ、すぐに氷上で冷却しました。 ハイブリダイゼーションミックスの約20μLを組織切片にピペットで移し、ジエチルピロカルボナート処理したカバースリップで覆い、42度で16〜20時間インキュベートしました。 ウイルスRNAとハイブリダイズしたプローブは、3、3-N-ジアミノベンジジン四塩酸塩に結合した抗DIG抗体を使用して検出されました。 スライドをメチルグリーンで対比染色し、中性ガムで密封した。 感度を向上させるために、プロテイナーゼKを使用して組織の透過性を高め、プローブの組織への侵入を促進しました。

定量的リアルタイムPCRによる免疫遺伝子分析

Trizol（Invitrogen、CA）を使用してトータルRNAを抽出し、HiScript Q RT SuperMixキット（Vazyme、China）を使用してRNAの逆転写を行いました。 サーモサイクラー（AB73 0 0; Life Technologies）を定量PCRに使用しました。 表1に示すように、免疫関連遺伝子の指定にはPrimer 5.0ソフトウェアを使用しました。ハウスキーピング遺伝子としてのGAPDHの定量化により、リボ核酸の発現を正規化しました。 相対転写レベルは、2-AACTを使用した方法で分析されました

統計分析

対照群と実験群の違いはスチューデントのt検定によって分析されました。 結果は平均±標準偏差として表されます。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistical="" significance="" compared="" with="" the="" control="" group,="" and="">< 0.01="" was="" considered="" to="" indicate="" a="" high="" degree="" of="" significance="" compared="" with="" the="" control="">

結果

臨床的変化

接種されていない対照では、死亡または明らかな臨床的兆候は観察されなかった。 しかし、実験中に感染した20頭のゴスリングのうち5頭が死亡し、GNAstVに感染したゴスリングでは体重の減少が観察されました。 剖検では、陰性対照群の臓器は正常に見えたが、臓器（肝臓、心臓、腎臓）、胆汁嚢、および関節腔の表面の尿酸の性質が死んだゴスリングで検出された。 さらに、感染したすべてのゴスリングで、尿管に白い尿酸を伴う腫れた腎臓と薄い腎臓が観察されました。 病理学的変化は、私たちの以前の研究（Xu et al..2019）で示されました。 これらの結果は、ゴスリングにおけるGNAstV感染の動物モデルの確立に成功したことを示しています。

腎臓と脾臓の組織病理学的変化

組織病理学的検査では、陰性対照のゴスリングからの腎臓と脾臓は組織学的に正常に見えた（図1Aおよび1B）。 しかし、腎上皮細胞の変性と壊死および炎症性感染したゴスリングの腎臓で細胞浸潤が観察されました（図1C）。 さらに、脾臓の壊死リンパ球脾臓にも炎症性細胞浸潤が見られました（図1D）。

腎臓と脾臓におけるウイルスの位置

腎臓および脾臓におけるガチョウ腎炎アストロウイルスの位置を、ISHを使用して調べた。 図2に示すように、尿細管上皮細胞の細胞質にいくつかの茶色の粒子が検出されましたが、腎臓の糸球体には茶色の粒子は観察されませんでした。 脾臓の脾臓リンパ球およびマクロファージ細胞では、茶色の粒子はほとんど検出されませんでした。 これらの結果は、GNAstVが尿細管上皮細胞および脾臓リンパ球に感染する可能性があることを示しています。

GNAstVに感染したゴスリングの脾臓および腎臓におけるPRRおよびアダプター分子の発現PRR（RIG -1、MDA -5、およびTLR3）および主要なアダプター分子（MAVS、MyD88、および図3に示すように、脾臓と腎臓のIRF7）をqPCRで測定しました。 脾臓の3PRRのmRNAレベルは、感染群で7および14 dpiで、陰性対照群と比較して有意に増加しました（P<0.05). the="" rig-1="" and="" tlr3="" mrna="" levels="" in="" the="" kidneys="" were="" also="" increased="" in="" the="" infected="" group="" at="" 7="" and="" 14="" dpi="" compared="" with="" that="" in="" the="" negative="" control="">< 0.01).="" the="" mda-5="" mrna="" level="" was="" higher="" in="" the="" infected="" group="" at="" 14="" dpi,="" but="" no="" difference="" in="" mda-5="" mrna="" expression="" was="" observed="" between="" the="" infected="" and="" negative="" control="" groups="" at="" 7="" dpi(p="">0 .05）。 したがって、7および14 dpiでの感染群のアダプター分子の発現は、対照群のそれよりも有意に高かった（P<0.05). these="" results="" indicate="" that="" gnastv="" infection="" activates="" the="" host's="" innate="" immune="">

GNAstVに感染したゴスリングの脾臓および腎臓におけるサイトカイン発現

サイトカイン、IL -1、I -6、IL -8、Ⅱ-10、TGF-B、およびiNOSの発現は、図4に示すようにqPCRによって決定されました。脾臓では、7および14の感染群におけるIL-1BおよびTGF-BのmRNAレベルdpiは明らかにネガティブコントロールグループよりも高かった（P<0.01). furthermore,="" the="" i-8="" and="" inos="" mrna="" levels="" in="" the="" infection="" group="" at="" 14="" dpi="" were="" higher="">< 0.05).="" but="" no="" differences="" in="" the="" levels="" were="" observed="" between="" the="" infection="" and="" negative="" control="" groups="" at="" 7="" dpi(p=""> 0.05). Moreover, no difference in I-6 mRNA expression at 7 and 14 dpi was observed between the infection and control groups(P>0 .05）。 腎臓では、7および14dpiでのI-1および7dpiでのI-6のmRNAレベルは、陰性対照群よりも感染群で低かった（P< 0.05),="" whereas="" the="" tgf-b="" and="" inos="" mrna="" levels="" at="" 7="" and="" 14="" dpi="" and="" the="" i-8="" mrna="" level="" at="" 14="" dpi="" were="" higher="" in="" the="" infection="" group="" than="" those="" in="" the="" negative="" control="" group=""><0.05). no="" difference="" in="" i-10="" expression="" was="" detected="" between="" the="" infection="" and="" control="" groups(p="">0.05).

GNAstVに感染したゴスリングの脾臓および腎臓における抗ウイルスタンパク質の発現

IFN-dのmRNAレベル。 図5に示すように、脾臓での抗ウイルスタンパク質（OASL、IFITM3、およびMIX1）の発現と、腎臓および脾臓での発現を測定しました。IFN-2。 7および14dpiでのOASL、IFITM3、およびMX1は、感染群の方が陰性対照群よりも有意に高かった（P< 0.05).="" in="" the="" kidney,="" the="" mrna="" levels="" of="" oasl,="" ifitm3,="" and="" mx1="" at="" 14="" dpi="" were="" obviously="" higher="" in="" the="" infected="" group="" than="" in="" the="" negative="" control="" group=""><0.05); however,="" no="" significant="" differences="" in="" levels="" were="" observed="" between="" the="" infection="" and="" negative="" control="" group="" at="" 7="" dpi(p="">0.05).

GNAstVに感染したゴスリングの脾臓におけるCD4t、CD8 plus、およびMHCクラスおよびI分子の発現

脾臓における抗原提示に関連する遺伝子（CD4'、CD8'、MHCクラスIおよびII分子）の発現は、図6に示すようにqPCRによって決定されました。7および14でのMHCIの発現レベルdpiは、感染群の方が陰性対照群よりも有意に高かった（P <0 .05）。=""><0.05); however,="" no="" difference="" in="" levels="" was="" observed="" between="" the="" 2="" groups="" at="" 7="" dpi(p="">0 .05）。 CD8と7および14dpiでのmRNAレベルは、感染群の方が陰性対照群よりも有意に高かった（P< 0.05).="" but="" no="" changes="" in="" cd4+mrna="" levels="" at="" 7="" and="" 14="" dpi="" were="" found="" between="" the="" 2="" groups="" (p="">0.05).

討論

ガチョウ腎炎アストロウイルスは、新たに分離されたウイルスであり、内臓痛風やゴスリングの死を引き起こし、ガチョウの糞に大きな損傷を与える可能性があります。現在のところ、その治療のためのワクチンや治療薬はありません。 したがって、ウイルスに対する宿主の免疫応答を調査して、その病因を理解し、ワクチンや治療法を開発する必要があります。 この研究では、GNAst V-JSHAの筋肉内接種により、ゴスリングの動物モデルを確立することに成功しました。 脾臓リンパ球およびマクロファージにおけるウイルスの位置および脾臓リンパ球の壊死は、GNAstVが脾臓に感染し、宿主の免疫系に損傷を引き起こす可能性があることを示しています。 しかし、これまで、GNAstVに感染したゴスリングの免疫応答に関する報告はありませんでした。 さらに、腎上皮細胞で高いウイルス力価が観察された。 そしてこれは腎臓の損傷と尿酸排泄障害の一因となる可能性があります。

自然免疫系は、侵入する病原体に対する防御の第一線です。 私たちの研究では、GNAstV感染がTLR3の増加を引き起こしました。 RIG -1、および脾臓と腎臓でのMIDA -5 mRNAの発現は、ウイルスの侵入の抑制に寄与する可能性のある自然免疫系が活性化されたことを示しています。主要なアダプター分子（MyD88およびIRF7）のアップレギュレーション）これらの結果をさらに確認しました。 IFNは、PRRの活性化後に生成されます。PRRは、直接抗ウイルス活性を持ついくつかのIFN刺激遺伝子の誘導を介して、ウイルス抑制に重要な役割を果たします。 私たちの研究では、脾臓でのIFN-zの発現と、脾臓および腎臓での抗ウイルスタンパク質（OASL、MX1、およびIFITM3）の発現が、GNAstrV感染後に増加しました。 抗ウイルスタンパク質の産生の増加は、ウイルスの侵入を抑制するのに役立つ可能性があります。 これに従って、我々の結果は、TLR3.RIG-1であることを示しました。 MDA-5とIRF7はGNAstV感染中に活性化されました。 以前の研究では、システムのタイプがinvitroおよびinvivoでのヒトアストロウイルスの複製を制限し、アストロウイルスによって誘発されるバリア透過性に対する保護を提供することも示されました（Marvin et al..2015）。 ただし、TLR3とOASLの両方の発現が7dpiと比較して14dpiで減少したため、TLR3とOASLの結果は、脾臓の他のPRRおよび抗ウイルスタンパク質の結果とは異なりました。 これは、負のフィードバック規制またはウイルス量の減少に関連している可能性があります。 したがって、14dpiでのlL-1 Bは、過剰な炎症性サイトカイン産生に対する身体調節メカニズムの結果である可能性があります。 興味深いことに、腎臓のI-1のmRNAレベルは感染群で減少しました。 この炎症性サイトカインのレベルが低いと、腎臓の損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。 以前の研究では、ヒトアストロウイルスおよび七面鳥アストロウイルス2型（TASt V -2）感染は炎症とは関連がなく、腸絨毛にほとんど病変を引き起こさなかったことが報告されており（Koci et al..2003; Sebire et al.2004）、これは、上皮細胞におけるアストロウイルス感染の特徴である可能性があること。 I -6は、効率的な免疫応答を介して抗ウイルス効果を誘発する炎症性サイトカインでもありますが、血管の損傷につながるプロセスにも関与しています。炎症血管壁の、そして血栓症。 私たちの研究では、GNAstV感染後の脾臓にIL-6の有意な変化は見られませんでした。 これは、個々のゴスリング間の大きな違いに関連している可能性があります。 ただし、-1 Bの観察と同様に、腎臓ではI-6の発現が減少しました。 これはまた、腎臓の損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。 I -8は、局所的な炎症性浸潤に関与する好中球の動員を担当するメディエーターです。 この研究では、I -8が脾臓と腎臓でアップレギュレーションされたため、炎症の一因となった可能性があります。 IL -10は、炎症性サイトカインの産生を阻害する可能性のある抗炎症性サイトカインです。 この研究では、GNAstVにより脾臓のIL-10レベルが明らかに低下しました。 これは、脾臓の重度の炎症の兆候であり、脾臓の損傷の原因の1つである可能性があります。 日本脳炎ウイルスやジカウイルスなどの他のウイルス感染による感染も、I -10発現の低下をもたらすことが示されていますが（Swarup et al.2007; Abreu 2019）、正確なメカニズム根底にあるGNAstrVinfectionは、さらに研究する必要があります。 TGF-は免疫抑制性サイトカインです。 したがって、脾臓と腎臓のTGF-Bレベルの増加は、GNAstV感染が免疫抑制を誘発する可能性があることを示しています。 さらに、T AStV -2感染により、シチメンチョウのTGF-の血清レベルが上昇したことが報告されました（Koci et al.2003）。 TGF産生の増加は、免疫応答を抑制し、ウイルス複製を増強することが示されています（Letterio and Roberts、1998）。 したがって、TGF産生の増加は、宿主の免疫応答を阻害することによってGNAstVの複製に寄与する可能性があります。iNOSは自然免疫応答の重要な要素であり、ウイルス感染の制御に重要な役割を果たします。 私たちの研究では、調査結果はGNAstV感染を示しました

明らかにアップレギュレーションされたINOS発現。 高いiNOS産生により、宿主はウイルス感染に抵抗できる可能性があります。 私たちの結果は、TAStV -2感染がiNOS産生を誘発し、アストロウイルスの複製を制限することを示した以前の研究の結果と一致していました（Qureshi et al。、200l; Koci et al。、2004; Meyerhoff et al。、2012 ）。

適応免疫システムは、ウイルス感染を制御する上で重要な役割を果たします。 私たちの研究では、GNAstVinfectionはMHC Ia、MHC Iix、およびCD8 plusのmRNAレベルを増加させました。これは、体液性および細胞性免疫応答が活性化されたことを示しています。 以前に、ヒトアストロウイルス感染が抗体産生を引き起こし、それがウイルスを中和する可能性があることが報告されました（Kurtzand Lee、1978）。 しかし、この研究ではCD4とmRNAの発現に有意な変化は見られませんでした。 CD4 "T細胞がB細胞の成熟と抗体特異性に不可欠であることを考えると、GNAst Vは強い体液性免疫応答を誘導できなかった可能性があります。これは、7dpiでMHCⅡa発現の明らかな増加が観察されなかった理由を説明している可能性があります。 、14dpiでのCD8およびMHCIaのmRNAレベルは7dpiと比較して減少しました。これは前述のようにウイルス負荷の減少に関連している可能性があります。この研究では、市販のキットがないため、GNAstV抗体は検出されませんでした。 、GNAstVinfectionにおける抗体の役割をさらに調査する必要があります。

結論として、私たちのデータは、GNAstVに感染したゴスリングの脾臓と腎臓の免疫応答パターンを明らかにしました。 GNAst V感染では、自然免疫および獲得免疫に関連する遺伝子が活性化されました。 しかし、サイトカインと抗ウイルスタンパク質の産生は、ゴスリングを病気から保護しませんでした。 これは、GNAst Vinfectionに応答した免疫関連遺伝子発現の変化を報告する最初の研究であり、宿主のGNAstV相互作用の分子メカニズムの解明にさらに役立つ可能性があります。