概要
Cuscuta chinensis 多糖類 (CPS) を熱水を使用して抽出し、酵素加水分解された C. chinensis 多糖類 (ECPS) をマンナナーゼ酵素加水分解プロセスによって生成しました。 この研究の目的は、B16F10 メラノーマ細胞における ECPS と CPS の抗メラニン形成活性を調査することでした。 インビトロ抗酸化活性は、第二鉄還元力とDPPHフリーラジカル捕捉活性によって評価されました。 多糖類の分子量分布は、SEC-MALLS-RI を使用して決定されました。 CPS はマンノースを使用して酵素分解に成功し、CPS と ECPS の加重平均分子量は 434.6 kDa と 211.7 kDa でした。 生物学的活性アッセイの結果は、酵素的に加水分解された多糖類が元の多糖類よりも優れた抗メラニン活性および抗酸化効果を有することを示唆した. ECPS は、B16F10 メラノーマ細胞の細胞毒性効果なしに、チロシナーゼ、MITF、および TRP-1 の発現をダウンレギュレートすることにより、抗メラニン形成活性を示しました。 結論として、ECPS は美白製品になる可能性を秘めています。 関連する研究によると、シスタンシェ「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分はシスタノシドで、抗酸化、抗炎症、免疫機能促進など様々な効果があります。 間のメカニズムシスタンシェと美白カンカ配糖体の抗酸化作用にあります。メラニン人間の皮膚では、によって触媒されるチロシンの酸化によって生成されます。チロシナーゼ、および酸化反応には酸素の関与が必要であるため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な要因になります. シスタンケには、抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニン生成抑制.
キーワード:Cuscuta chinensis 多糖類; 抗メラニン活性; 酵素加水分解多糖; 抗酸化活性
序章
メラニンは、L-チロシン変換の最終生成物であり、髪と肌の色の主要な決定要因であり、紫外線による損傷からの保護に重要な役割を果たします (1)。 しかし、メラニンの蓄積は、異常な色素沈着に関与し、皮膚の色素沈着過剰、黒皮症、太陽メラノーシス、および卵白を引き起こす可能性があります (2). メラニンの生合成には一連の酵素反応と酸化反応が関与しており、チロシナーゼはその過程で重要な役割を果たしています (3)。 チロシナーゼ関連タンパク質 (TRP-1) は、メラニン生合成経路における DHICA オキシダーゼの形成を促進します (4)。 細胞内小眼球関連転写因子（MITF）は重要な転写因子です
メラニン生合成遺伝子の調節因子。 MITF は、メラノサイトの色素沈着、増殖、および分化の調節にも関与しています (5)。 α-MSH-メラノコルチン 1 受容体シグナル伝達は、TRP-1 を含むメラノゲン産生特異的酵素で発生します。 チロシナーゼは MITF によっても規制されています (5)。 多くの皮膚美白剤は、チロシナーゼの発現を調節するか、チロシナーゼ活性を阻害することにより、抗メラニン形成効果を発揮します。 さらに、細胞内抗酸化レベルとフリーラジカル生成もメラニン含有量に影響します (6)。 したがって、チロシナーゼ阻害剤および抗酸化化合物は、多くの場合、美白剤として選択されます。 中国語で TuSiZi と呼ばれる Cuscuta chinensis Lam. は、一般的に機能性食品として使用される伝統的な漢方薬であり、生殖器系の能力を高めることが知られています (7)。 近年、そばかすや白斑の治療に使用することが報告されています (8)。 他の報告では、皮膚の保護にプラスの効果を発揮し (9)、チロシナーゼ活性の阻害を誘導することが示されています (10)。
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多糖類は、C. chinensis Lam の水抽出物からの主成分です。 抗アポトーシス (11) および免疫活性 (12) があると考えられている種子。 以前の分析結果は、C. chinensis Lam. 多糖類は、フルクトース、マンノース、キシロース、およびアラビノースで構成されています。 マンノースは主な糖成分です (13)。 多くの研究者は、多糖類の粘度 (14)、分子量 (Mw) 分布 (15)、および単糖類の割合 (16) がその生物活性に大きな影響を与えることを実証しています。 さらに、最近の研究では、低分子量の分解された多糖類は、元の多糖類よりも高い抗酸化活性とチロシナーゼ阻害活性を示すことが示されています (17)。 したがって、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｌａｍ． 種子はその生物活性を改善するために必要です。 さまざまな分解プロセスの中で、酵素分解の主な利点は、基質特異性、高い選択性、および明確な構造を持つ加水分解物を生成する温和な条件です (18)。
これらの薬理学的研究に基づいて、C. chinensis 多糖類 (CPS) および酵素的に加水分解された C. chinensis 多糖類 (ECPS) は、色素沈着過剰の改善に有効な植物薬である可能性があると推測しました。 マンナーゼを使用して、種子から低 Mw ECPS を取得しました。 さらに、異なる Mw を持つ多糖類の抗メラニン形成および抗酸化活性を推定し、生物活性と多糖類の Mw との関係を調査しました。
材料と方法
試薬
酵素および抗酸化活性のための化学物質は、Sigma Co. (米国) から購入しました。 他のすべての試薬と化学薬品は、アラジン (中国) から購入しました。
CPS と ECPS の準備
Cuscuta chinensis Lam 種子の薬用材料は、Guang Dong Feng Chun Pharmaceutical CO., LTD (中国) から提供されました。 約 500 g の乾燥材料を粉末にし、1200 mL の 80% エタノールに室温で 24 時間浸漬して、脂質、オリゴ糖、および着色材料を除去しました。 前処理したサンプルに布を浸透させ、乾燥した残渣を 3000 mL の水で 90 度で 3 回抽出しました。 水性抽出物を遠心分離（２２℃で５分間、４０００ｇ）によって残留物から分離し、次いで真空下、７０℃で濃縮した。 凝縮物を60%エタノールで3度で24時間沈殿させた。 最後に、沈殿物を Sevag メソッドで除タンパクし、3500 Da 膜で透析し、凍結乾燥し、C. chinensis 多糖類 (CPS) を標識しました。
酵素的に加水分解された C. chinensis 多糖類 (ECPS) は、マンノースと基質の比率が 5:1 (v/w) のマンノース (酢酸ナトリウム緩衝液中 0.1 パーセント) を 60 度、pH で加水分解することによって得られました。 6時間で4.5。 その後、沸騰水中で１０分間触媒反応を停止させた。 反応液を１０｛｛１０｝｝ｇで１５分間（４度）遠心分離し、上清を回収し、３５００Ｄａ膜で３度で３日間透析し、低分子物質を除去し、凍結乾燥した。
炭水化物含有量は、グルコースを検量線の標準物質として、フェノール硫酸法によって試験した。
SEC-MALLS-RI測定
多角度レーザー光散乱検出器 (Wyatt、米国) および屈折率検出器 (Waters、米国) (SEC-MALLS-RI) と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー (Waters、米国) を使用して、多糖類。 SEC-MALLS-RI は、Phenomenex Polysep-GFC-Linear カラム (8 mm×3{{10}} 0 mm) を使用して実行されました。 サンプル (2 mg/mL) を 0.1 M 塩化ナトリウムからなる移動相で溶解しました。 注入量は 100 mL で、フェローは 0.7 mL/min に設定されました。
きのこチロシナーゼ阻害アッセイ
きのこのチロシナーゼ阻害（19）は、以前に報告されたように変更を加えて実行されました。 簡単に言えば、25 mL のコウジ酸 (ポジティブ コントロール) またはサンプル ソリューション (25 mL の 10 mM L-チロシン、25 mL の 0.5 mM L-DOPA、および 875 mL の 50 mMリン酸緩衝液（pH 6.5）溶液）を混合した。 次に、38 mL の 2100 U/mL マッシュルーム チロシナーゼを加え、ボルテックスしました。 37度で0.5-時間インキュベーションした後、吸光度をマイクロプレートリーダーで475 nm(Thermo Fisher、USA)で測定した。 チロシナーゼ活性の阻害パーセントは、次の式によって計算されました。 sample および A-sample は、サンプルの 475 nm での吸光度を表します。
細胞培養および生存率アッセイ
マウス B16F10 黒色腫細胞は、Biochemistry and Cell Biology (中国) から購入しました。 細胞は、10 パーセントのウシ胎児血清 (FBS)、100 mg/mL ストレプトマイシン、および 100 IU/mL ペニシリンを添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) で、37 度、5 パーセントの CO2 を含む加湿環境で維持されました。 細胞を培養プレートに播種し、さまざまな濃度のサンプルとα-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）を72時間補充して、細胞内チロシナーゼ活性を測定し、メラニン含有量を定量しました。
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド (MTT) アッセイを実行して、細胞の生存率をテストしました (20)。 簡単に言えば、96-ウェルプレートにマウスB16F10メラノーマ細胞を播種した。 2 mg/ml MTT 50 mL を、100 mL の異なるサンプル濃度で 24 時間処理した後、各ウェルに移しました。 4-時間のインキュベーション後、反応を終了させ、ジメチルスルホキシドを加えて不溶性生成物を溶解した。 マイクロプレートリーダーを用いて590 nmで吸光度を測定した。
メラニン含有量の測定
メラニン含有量の検出は、わずかに修正された方法で行われました（21）。 氷冷ＰＢＳで洗浄した後、メラノーマ細胞（ウェルあたり２×１０４細胞）を｛｛３｝｝ウェルプレートに播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。 次に、100 mL の NaOH (1 N) を各ウェルに加えて、メラノーマ細胞を 80 度で 30 分間溶解しました。 ライセートを15,000 gで15分間(4度)遠心分離した。 次に、吸光度をマイクロプレートリーダーで405 nmで測定しました。 すべての実験は三重に行った。
細胞内チロシナーゼ活性アッセイ
細胞内チロシナーゼ活性アッセイは、以前の文献に若干の変更を加えて実施した(22)。 簡単に言えば、黒色腫細胞を溶解緩衝液（1 mM PMSF、1% Triton X-100、20 mMリン酸ナトリウム）で凍結融解により溶解した。 ライセートを 15 000 g で 1 0 分間 (4 度 ) 遠心分離した後、上清のタンパク質含有量をビシンコニン酸 (BCA) アッセイで測定しました。 上清タンパク質 (10 mg) を 100 mL の反応混合物 (0.1% L-DOPA および 0.1 M リン酸緩衝液) に移しました。 37℃で60分間インキュベートした後、チロシナーゼ活性をマイクロプレートリーダーで450nmで測定した。 すべての実験は三重に行った。
鉄分がパワーを下げる
第二鉄還元力アッセイは、以前に公開された方法に若干の変更を加えて実施した(23)。 異なる濃度のサンプル (2 mL) または Vc (陽性対照) を 2 mL フェリシアン化カリウム (1%、W/V) および 2 mL リン酸緩衝液 (0.2 M、pH 6.8) と混合しました。 50 度で 30 分間インキュベートした後、2 mL のトリクロロ酢酸 (10%、W/V) を反応混合物に移し、4000 g で 15 分間 (22 度) 遠心分離しました。 上澄み (2 mL) を、2 mL の蒸留水と 0.4 mL の FeCl3 (0.1 パーセント、W/V) を含む混合物と混合しました。 37℃で10分間インキュベートした後、吸光度をマイクロプレートリーダーで700 nmで測定しました。
DPPHラジカル消去活性アッセイ
DPPH捕捉活性アッセイは、以前に報告されたように、いくつかの変更を加えて実行されました（24）。 簡単に説明すると、サンプル 2 mL を 0.1 mM DPPH 溶液 2 mL に加え、ボルテックスしました。 暗所で30分間インキュベーションした後、吸光度をマイクロプレートリーダーで517 nmで測定しました。
ウエスタンブロットによるタンパク質発現解析
異なる濃度の ECPS で 72 時間処理した後、細胞を PBS で洗浄し、RIPA バッファー (50 mM pH 8.0 Tris-HCl 中の 150 mM NaCl) で溶解しました。 、0.5 パーセントのデオキシコール酸ナトリウム、1.0 パーセントのノンダイエット P-40、および 0.1 パーセントのドデシル硫酸ナトリウム)。 10000gで25分間(4度)遠心分離した後、ライセートの上清を回収した。 タンパク質を１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、次にポリフッ化ビニリデン膜に移した。 ブロッキングは、Tween-20 と 2% 脱脂粉乳 (TBST) を含む Tris 緩衝生理食塩水で行い、4 度で 12 時間インキュベートしました。 使用した一次抗体は、抗アクチン (1:5000)、抗 TRP-1 (1:500)、抗チロシナーゼ (1:500)、および抗 MITF (1:1000) でした。 一次抗体を除去し、メンブレンを TBST で 2 回洗浄しました。 その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Santa Cruz、USA）を含む膜を室温で60分間インキュベートしました。 タンパク質バンドをTBSTで再度洗浄し、UVPイメージングシステム（UVP、米国）を使用してECLキット（Amersham Pharmacia Biotech、米国）で視覚化しました。
統計分析
すべての結果は平均値±標準偏差として報告され、実験は 3 回繰り返されました。 グループ間の比較は、ANOVA とそれに続く Dunnett 検定を使用して推定されました。 2 つのグループ間の単一の比較は、スチューデントの t 検定によって行われました。 すべての統計分析は、SPSS ソフトウェア (バージョン 16.0) を使用して行われました。 通常、Po0.05 は統計的に有意であると見なされていました。
結果
ECPSおよびCPSのMwおよび総多糖類
フェノール硫酸アッセイによって測定された ECPS および CPS の総多糖含有量は、それぞれ 89.17 パーセントおよび 90.26 パーセントでした。 一方、ECPS と CPS の Mw は、SEC-MALLS-RI によって測定されました。 ECPS の Mw は 211.7 kDa で、CPS (434.6 kDa) より低かった。 図 1A は、ECPS と CPS の相対強度 (RI) を示しています。 マンノースによる酵素加水分解後、ECPS のピーク保持時間は CPS よりも長かった。 図 1B に示すように、多糖類の微分重量分率は、サンプルのモル質量の関数として表されました。 多糖類のモル質量分布は、酵素加水分解によって大幅に変化しました。 低 Mw 領域の ECPS の微分重量分率が増加したことから、CPS が酵素的に低 Mw 多糖に分解されたことが示唆されました。
多糖類の抗酸化作用
ECPS および CPS の DPPH フリーラジカル除去能力は、図 2A に報告されています。 多糖類サンプルおよび Vc のフリーラジカル捕捉活性は、用量依存的な活性を示しました。 現在の研究では、CPS のフリーラジカル捕捉能力は ECPS よりも低かった。 ただし、どちらも陽性サンプルよりも低いフリーラジカル捕捉効果を示しました。 ECPS と CPS の IC50 値は、それぞれ 0.39 と 0.51 mg/mL でした。 図 2B に示すように、総抗酸化活性は、鉄還元力をテストすることによって評価できます。 濃度は 0.1 から 1 mg/mL まで変化しました。 多糖サンプルと Vc の両方が、用量依存的に抗酸化活性を示しました。 さらに、ECPS の吸光度値は、同じ濃度の CPS よりも常に高かった。
キノコのチロシナーゼ活性と細胞生存率に対する ECPS と CPS の効果
図 2C に示すように、多糖類のチロシナーゼ阻害活性 (0.1B1 mg/mL) は用量依存的な関係を示しました。 さらに、ECPS の阻害効果は、同じ濃度の CPS よりも常に高かった。 MTT アッセイは、B16F10 メラノーマ細胞における ECPS および CPS の細胞毒性効果を評価するために実施されました。 図 2D に示すように、ECPS と CPS の異なる濃度 (0B320 mg/mL) で B16F10 細胞の生存率に有意な変化はありませんでした。 これらの結果に基づいて、これらの濃度範囲を
さらなる研究。
細胞内チロシナーゼ活性とメラニン含有量に対するECPSとCPSの影響
B16F10黒色腫細胞モデルにおける細胞内チロシナーゼ活性およびメラニン形成に対するECPSおよびCPSの効果を比較するために、a-MSH刺激B16F1におけるメラニン含有量およびチロシナーゼ活性に対するECPSおよびCPSの阻害効力{{ 16}}細胞を調べた。 図 3 に示すように、B16F10 細胞のメラニン含有量とチロシナーゼ活性は、刺激を受けていない B16F10 細胞と比較して有意に増加しました (Po 0.01)。 40 mg/mL (ECPS) および 160 mg/mL (CPS) の濃度で、メラニン含有量の増加は用量依存的に緩和できました (Po0.01 および Po0.05)。 同様に、ECPS (40 mg/mL) および CPS (160 mg/mL) による処理は、B16F10 細胞のチロシナーゼ活性を抑制しました (Po 0.01 および Po 0.05)。 さらに、ECPS はメラニン形成に対して CPS よりも高いチロシナーゼ阻害活性を示しました。 ECPS (160 および 320 mg/mL) は、美白生理活性化合物として広く使用されている陽性対照 (コウジ酸) に匹敵する抗メラニン形成効果を発揮しました。
B16F10 細胞のチロシナーゼ、MITF、および TRP-1 タンパク質レベルに対する ECPS の影響
図 4 に示すように、ECPS は B16F10 細胞のチロシナーゼ、MITF、および TRP-1 タンパク質の発現レベルを用量依存的に大幅に減少させました (Po0.05 および Po0. 01)。 これらの結果は、ECPS が TRP-1 および MITF のタンパク質発現をダウンレギュレートすることにより、チロシナーゼの発現を阻害したことを示しています。
議論
C. chinensis 由来の天然多糖類は、チロシナーゼ阻害、フリーラジカル消去、および皮膚保護に対する優れた効果に起因して注目を集めています (25–27)。 しかし、多糖類の酵素修飾の抗メラニン形成活性に焦点を当てた研究はほとんどありません。 以前の研究では、酵素加水分解プロセスによって分解された多糖類が優れたフリーラジカル消去効果を示すことが実証されています (28)。 さらに、多糖類の生物学的活性は、それらの Mw 分布と密接に関連しています。 理論的には、低 Mw 多糖類は、細胞膜への浸透性が高いため、高 Mw 多糖類よりも活性が高くなります (29,30)。 ただし、B16F10 細胞に対する ECPS の抗メラニン形成効果はまだ研究されていませんでした。 低分子量多糖は、マンノースによる酵素加水分解によって調製されました。
酸化ストレスは、過剰なフリーラジカルを生成し、酸化損傷につながる可能性があります。 以前の研究では、皮膚疾患がフリーラジカルの蓄積と密接に関連していることが証明されています (31)。 さらに、過剰なフリーラジカルは、メラノーマ細胞のメラニン形成とメラノサイトの成長を抑制する上で重要な役割を果たします (32)。 チロシナーゼは、ブロンズを含む多機能酸化酵素であり、メラニン生合成の促進に不可欠です (33)。 しかし、皮膚の色素沈着やさまざまな皮膚疾患は、メラニンの蓄積と密接に関係しており、深刻な審美的問題を引き起こします (34)。
抗酸化作用と抗チロシナーゼ作用を持つ有効成分は、皮膚を保護し、メラニン形成を阻害します (35)。 私たちの結果は、酵素的に修飾された多糖類の低分子量が、in vitro で元の多糖類よりも優れた抗酸化および抗チロシナーゼ活性を示したことを示しています。 この改善は、より大きな表面積とより優れた水溶性に起因するものであり、これは、ホンダワラからの分解された多糖類が元の多糖類よりも優れた抗チロシナーゼ活性と抗酸化活性を有することを示した以前の研究 (17) と一致していました。
正常なメラノサイトは、皮膚の表皮と真皮の接合部にあり、メラニンを生成し、ケラチノ サイトに転送されます (36)。 現在の研究では、マウス B16F10 メラノーマ細胞が使用されました。これは、メラニン形成メカニズムを持ち、細胞内チロシナーゼを持つことが知られており、α-MSH 刺激とメラニン形成に関連するメラニンを生成できるためです (37)。 チロシナーゼ活性、メラニン含有量、および細胞生存率は、本研究で抗メラニン形成をスクリーニングするために使用される in vitro アッセイでした。 CPS と ECPS は、B16F10 細胞のチロシナーゼ活性とメラニン合成に対して用量依存的な阻害効果を示しました。 ECPS は、より強力な抗メラニン合成と抗チロシナーゼ効果を示しました。
チロシナーゼ関連タンパク質-1 (TRP-1) とチロシナーゼは、メラニン生合成とメラニン生成経路で重要な役割を果たします (38)。 MITF は、メラニン形成に関与するチロシナーゼ遺伝子の細胞転写因子です。 通常、TRP-1 とチロシナーゼの活性化は、MITF タンパク質の発現を高め、メラニン合成の増加を引き起こします (39)。 したがって、皮膚美白剤は、TYP-1またはチロシナーゼの活性化に関与するシグナル伝達経路を阻害する特性を有する可能性があります。 したがって、TRP-1、細胞のチロシナーゼ、および MITF タンパク質の発現に対する ECPS の効果を調査し、チロシナーゼ活性とメラニン形成の阻害の根底にあるメカニズムを研究しました。 ウェスタンブロットアッセイの結果は、ECPS が B16F10 細胞の TRP-1、チロシナーゼ、および MITF の発現を抑制することを示し、ECPS がチロシナーゼ、MITF、および TRP-1 の発現をダウンレギュレートすることによってメラニン形成を減少させることを示唆しました。 B16F10メラノーマ細胞で。 この結果は、Cuscuta japonica 種子からの水性抽出物が、p38 MAPK リン酸化を抑制し、cAMP レベルを阻害し、続いて TRP と MITF の発現を減少させることにより、α-MSH によって誘導されるメラニン合成とチロシナーゼ活性を有意に阻害したことを示す以前の研究からのものでした (40)。 .
要約すると、酵素的に修飾された多糖類は、元の多糖類よりも優れた抗酸化作用と抗メラニン生成作用を持っていました。 さらに、ECPS のこの抗メラニン形成効果は、マウス B16F10 細胞における TRP-1、チロシナーゼ、および MITF 発現の抑制によって媒介されました。 ECPSは、化粧品や医療製品の分野での使用に適用できます。謝辞
この作品は、中国国立自然科学基金 (グラント番号 81373640) によって支えられました。
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