アイメリアアセルブリナスポロゾイトによるマディンダービーウシ腎臓（MDBK）細胞のinvitro感染：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用した寄生虫細胞の侵入と複製の定量分析

edmund.chen@wecistanche.com

概要

家禽コクシジウム症は家畜産業にかなりの経済的損失を引き起こします。 アイメリアの寄生虫がこの病気の原因です。 世界規模で、E。アセルブリナとE.テネラは最も一般的なアイメリア属の1つです。 ブロイラーに感染する。 E.テネラは一般的にinvivoおよびinvitro研究で感染モデルとして使用されます。 一方、E。acervulinaはinvitro条件下ではほとんど研究されていません。 E.テネラ感染の確立され広く使用されているinvitroモデルはMadinDarbyウシです肝臓細胞株（MDBK）; ただし、E。acervulinaの宿主細胞としてのMDBK細胞の適合性についてはほとんど知られていません。 MDBK単層に5×104と2×105の2つの異なる用量のE.acervulinaスポロゾイトを感染させ、感染後24時間と96時間（hpi）で培養物を評価しました。 比較のために、E.tenellaスポロゾイトを使用して同一の感染アッセイを実行しました。 寄生虫の繁殖を評価するために、E。acervulinaSCARマーカーとE.tenellaITS-1遺伝子のDNAコピー数をリアルタイム定量PCRを使用して定量化しました。 E. acervulinaのコピー数は、E。tenellaと比較して24 hpiで有意に増加することがわかりました（p<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">

キーワード：コクシジウム症; アイメリアアセルブリナ; アイメリアテネラ; 家禽; MDBKセル; 肝臓

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序章

コクシジウム症は、家禽産業において経済的に重要な病気です（Blake et al.2020）。 この病気は、アイメリア属のアピコンプレックス門寄生虫によって引き起こされます。 感染は、胞子形成したオーシストの経口摂取によって起こります。 宿主に入ると、オーシストはスポロゾイトを放出し、腸上皮細胞に侵入します。 宿主細胞内では、スポロゾイトは無性および性的増殖サイクルを経ます。 これによりオーシストが生成され、その結果、糞便に放出されます。 感染した動物は体重減少、下痢、産卵率の低下を示す可能性があり、場合によってはこの病気は致命的となる可能性があります（López-Osorioetal2020）。 アイメリアの7種（E. acervulina、E。brunetti、E。maxima、E。mitis、E。necatrix、E。praecox、およびE. tenella）は、世界中で鳥コクシジウム症の原因となっています。 オーシストの形態、病理学、および病気の重症度は、これらの種の間で一般的な差別化要因です。 7つのアイメリアすべての中で、E。acervulina、E。tenella、およびE. maximaは、ブロイラー農場で最も普及しています（Jordan et al 2018; Moraes et al 2015;Györkeetal2013）。 これらの3種のうち、E。tenellaは高病原性と見なされ、E。acervulinaとE. maximaは中程度の病原性を示します（López-Osorioetal.2020）。 病原性の変動にもかかわらず、中程度の病原性アイメリア属。 E. acervulinaなどは、重複感染時に病気の重症度を高める可能性があります（Hiob et al.2017）。 動物モデルは、感染研究において貴重な要素です。 ただし、コクシジウム寄生虫のin vitro研究は、細胞レベルでの疾患のベースラインの理解に貢献する可能性があります（Marugán-Hernándezetal.2020、Bussite et al.2018、Thabet et al.2017）。 さらに、それらは将来の治療のためのベースラインデータを提供する有用なツールになり得ます（Thabetetal。2017;Khalafallaet al.2011）。 鳥類以外の細胞株で増殖する能力があるため（Marugán-Hernándezetal。2020; Thabet et al。2017）、E.tenellaはinvitro研究のモデル生物として広く使用されています（Marugán-Hernándezetal.2020）。 ; Thabet et al。2019、2017; Khalafalla et al。2011）およびリアルタイム定量PCR（RT-qPCR）などの分子アプローチの使用を含む、invitroおよびinvivo研究にかなりの努力が向けられてきました。 （Marugán-Hernándezetal.2020; Thabet et al.2019、2017; Hiob et al.2017; Raj et al.2013）。 E. acervulinaを含む他のアイメリア種については、より少ない努力が報告されています（Naciri-Bontemps 1976; Itagakietal。1974;Stroutetal。1965;Hiobet al 2017）。 この研究の目的は、リアルタイム定量PCRを使用して、MDBK細胞単層におけるE.acervulinaスポロゾイトのinvitro浸潤と複製を評価することでした。

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材料および方法

E.アセルブリナとE.テネラオーシストの通過オーシストE.acervulinaとE.tenellaは、Eckert et al。の修正された方法に従って、健康な11-日齢のヒヨコで別々に継代されました。 （1995）。 胞子形成したオーシストを収集し、さらに使用するまで4パーセントの重クロム酸カリウム溶液に4度で保存しました。オーシストの精製と興奮両方のアイメリア種のオーシストは、4パーセントの重クロム酸カリウム溶液から除去されました。 その後、スポロゾイトを励起し、Rentería-Solísらによって記述された修正された方法に従って精製した。 （2020）。細胞培養マディン-ダービーウシ肝臓（MDBK）単層（DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）を感染モデルとして使用しました。 MDBK細胞を24-ウェルプレートに10％ウシ胎児血清（FBS）、100 IUペニシリン、100 ug / mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で播種しました（2×105細胞/ウェル）。 2.5 ug / mLアンフォテリシンを使用し、空気中5％CO2の雰囲気で37度で、80％コンフルエンシーに達するまで培養しました。EimeriaスポロゾイトによるMDBK細胞の感染コンフルエントなMDBK単層にE.acervulinaスポロゾイトを接種しました。 さまざまな感染多重度（MOI）率（寄生虫：細胞）に基づいて感染線量を選択するために、予備調査が実施されました：{{0}}。25、0。5、1。{ {9}}、1.5、および5。0（Taha et al。未公開データ）。 感染のために2つの別々の用量が選択されました：5×1 0 4（MOI：0.25）または2×105スポロゾイト/ウェル（MOI：0.5）。 次に、感染にさらされた培養物を、2パーセントFBS、100 IUペニシリン、100 ug / mLストレプトマイシン、および2.5 ug/mLアンホテリシンを含むDMEM培地で41度で培養しました。 2つの異なるインキュベーション時間が実装されました：感染後24時間（hpi）と96hpi。 同一の感染量とインキュベーション時間のセットが、E.tenellaスポロゾイトに対して実施されました。 すべての実験には、感染していないMDBK単層（NC非感染細胞）からなる1つのネガティブコントロールが含まれていました。 すべてのアッセイは3回行った。 24 hpi後、細胞を滅菌PBS（pH 7.2）で3回洗浄し、新しい培地を96 hpiグループに追加し、24hpi培養を終了しました。 単層は、各インキュベーション期間の終わりにトリプシン処理されました（それぞれ24hpiまたは96hpi）。

DNA抽出とリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT‑qPCR）DNeasy Blood＆Tissueキット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を製造元のプロトコルに従って使用して、トリプシン処理した細胞からDNAを抽出しました。 RT-qPCRを実行して、増幅領域（SCAR）マーカーAc-R01-1731を特徴とするE.acervulina配列のコピーを定量化し、リボソームDNA（ITS -1）遺伝子のE.tenella内部転写スペーサー1を寄生虫複製の相関関係。 ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイは、ブレイクらによって記載された方法に従って実施された。 （2008）およびKawaharaetal。 （2008）、それぞれ、いくつかの変更が加えられています。 簡単に説明すると、20 µlの反応液には、10 µlのSYBRGreen®マスターミックス（Thermo Scientific、Dreieich、Germany）、500 nMのフォワードおよびリバースプライマー（表1）、2 µlのDNAテンプレート、および7 µlのヌクレアーゼフリー水が含まれていました。 ヌクレアーゼフリー水からなる非テンプレートコントロール（NTC）を各アッセイに追加しました。 RT qPCR反応は3回増幅され、Bio-Rad CFX ConnectリアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad、フェルトキルヘン、ドイツ）で実施されました。 RT-qPCR条件は、95度で5分間、続いて95度で30秒間の40サイクルでした。 アニーリングは、E。acervulinaとE. tenellaについて、それぞれ59.8度と58度で20秒間実行され、その後、72度で20秒間の1回の伸長サイクルが続きました。 解離曲線を作成するために、60〜95度の温度範囲を含む融解曲線プログラムが適用されました。 最後に、E。acervulinaおよびE. tenellaの標準曲線は、ゲノムDNAの段階希釈およびクローン化されたITS -1遺伝子フラグメントの段階希釈（Thabet et al。2015による）によってそれぞれ生成されました。

統計分析

D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05。 すべての統計分析は、GraphPad Prism 9ソフトウェア（米国カリフォルニア州サンディエゴ）で行われました。

結果と考察

E.acervulinaSCARマーカーおよびE.tenellaITS -1遺伝子の遺伝子コピーは、すべての反応でRT-qPCRによって正常に増幅および検出されました。 24 hpiの潜伏期間の後、5×104のスポロゾイトの投与後に検出されたコピーの数はE. acervulina（1.88×105±5.56×104）よりも有意に多かった（p =0。0002）。 E.テネラの場合（3.60×104±5.37×103）（図1）。 同様に、24 hpi後にE.tenella（1.27×105±9.32×103）よりもE. acervulina（4.82×105±8.50×104）の方が有意に多い（p =0。0002）コピー数が得られました。 2×105スポロゾイトの適用（図1）。 対照的に、5×104のスポロゾイトによる感染後の96 hpiでは、E。acervulinaに感染した培養物のコピー数はEと比較して有意に（p=0。0044）低かった（6.96×103±3.87×103）。 .tenella（1.24×105±1.01×105）。 同様に、単層で96 hpiのより長い期間インキュベートされた2×105スポロゾイトの高用量は、有意に（p =0。0044）より少ない量のE. acervulinaコピー（3.35×104±1.53×104）をもたらしました。 E.テネラとの比較（4.98×105±1.28×105）（図1）。

E. acervulinaがMDBK単層に侵入し、その後24および96hpiで増殖する能力をテストしました。 E. acervulina培養を評価する初期の試みは、さまざまな結果で実施されました。 Stroutetal。 （1965）異なる一次（ニワトリ胚）に感染肝臓および線維芽細胞）および永久細胞株（マウス線維芽細胞、HeLa細胞）。 Stroutetal。 （1965）すべての細胞株において24hpiで認識可能な細胞感染を報告しました。 興味深いことに、彼らは、遺伝子数の減少の観察と一致する、テストされた細胞モデル（Strout et al。1965）のいずれにおいても24hpiを超える期間にわたって寄生虫の成長を観察しませんでした。

96hpiをコピーします。 Naciri-Bontemps（1976）は、ニワトリにおけるE.acervulinaの成長を報告しました肝臓93 hpiまでの細胞で、メロゾイトの接種後にオーシストの形成が観察されました。 しかし、私たちの知る限り、これらの発見は後の出版物では確認されませんでした。E。acervulinaスポロゾイトに感染したMDBK単層について発表された記事は1つだけです（Talebi2001）。 要するに、著者は、過免疫ニワトリまたはウサギ抗血清で以前に処理されたMDBK細胞をE.acervulinaスポロゾイトに24hpi曝露しました。 培養物を染色し、細胞内スポロゾイトを顕微鏡で数えた。 残念ながら、この研究は抗血清による寄生虫抑制のパーセンテージのみを示しており（Talebi 2001）、したがって、このモデルにおける感染の有効性に関する結論を簡単に引き出すことはできません。 私たちの知る限り、E。acervulinaの感染モデルとしてMDBK細胞を使用する試みはこれ以上報告されていません。 Stroutらの発見によると。 （1965）、我々は24 hpiでピークの寄生虫繁殖を観察し、後で96hpiでの低いコピー数によって表される明確な減少を観察しました。 Stroutetal。 （1965）およびNaciri-Bontemps（1976）は、顕微鏡分析のみに由来する定性的データを報告しました。 ただし、RT-qPCRは、寄生虫の繁殖を評価するためのより正確で感度の高い手段です。 実際、RT-qPCRは現在、定量的評価に一般的に使用されており、コクシジウムの繁殖を評価するために成功裏に確立されています（例：Marugán-Hernándezetal.2020、RenteríaSolísetal.2020、Thabet et al.2019、Bussiere et al .2018、Hiob et al.2017、Thabet et al.2017、Raj et al.2013、Khalafalla et al.2011）

ただし、電子顕微鏡は、MDBK細胞におけるE.acervulinaの細胞内発達の分析のための貴重なデータを提供する可能性があります。 したがって、E。acervulinaのさらなるinvitro調査のために検討する必要があります。 理論的には、鳥類の細胞株は、天然の宿主に由来し、哺乳類由来の細胞培養よりも寄生虫と宿主の間の相互作用についてより代表的な洞察を可能にする可能性があるため、ニワトリアイメリアのinvitro感染モデルとして好ましいでしょう。 しかし、家禽コクシジウム症の研究に適したニワトリ細胞培養のほとんどは一次系統です（Bussiere et al.2018、Strout et al.1965; Naciri-Bontemps1976）。 一次細胞には、恒久的な培養と比較していくつかの制限があります。 1つは、実験室での実験を開始するための新鮮な動物組織の一般的な必要性であり、これは汚染のリスクに関連している可能性があります（Verma et al.2020）。 さらに、一次細胞を得るためには、動物を犠牲にする必要があり、これは倫理的な考慮事項と矛盾します。 最後に、一次細胞株の標準化は困難に関連している可能性があります。

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したがって、不死化細胞株の使用は、鳥コクシジウムのinvitro培養に取り組んでいるほとんどの研究グループで一般的に行われています。 一般に、哺乳動物由来の永久培養は、商業的供給源から容易に入手可能であり、抗体、マーカー、公開されたプロトコル、ゲノム配列などのツールが確立されているために選択されますが、これはあまり一般的に使用されないニワトリ細胞株には必ずしも当てはまりません。 。 MDBK細胞は、さまざまな用途のinvitroモデルとして使用されるウシ由来の永久系統です。 MDBK細胞は、E.tenellaのinvitro研究のために十分に確立されています（Marugán-Hernándezetal.2020、Rentería-Solíset al.2020、Thabet et al.2019、Bussiere et al.2018、Thabet et al.2017、Khalafalla et al. al.2011）。 マルガンヘルナンデス他 （2020）例えば、MDBK細胞におけるE.tenellaの細胞内発達の包括的な記述を実施しました。 この研究では、著者らは、RT-qPCRおよび逆転写酵素リアルタイムPCRの細胞分裂と、E。テネラのトランスジェニック株の段階的発達を追跡しました。

私たちの目標は、PCR技術によってMDBK細胞におけるE.acervulinaの増殖を定量化することでした。 私たちの現在の知識の限りでは、そのようなデータはこれまで公開されていません。 私たちの実験では、形態素解析は考慮されていません。 しかし、遺伝子コピー数の増加が実際にはメロゴニー中の増殖に関連していることが繰り返し示されています（Marugán-Hernándezetal。2020、Thabetetal。2017およびRajetal.2013）。 無性生殖のこの段階を超えて発達することは、私たちの実験で与えられた条件下ではかなりありそうにありません。 E. tenellaと比較して、E。acervulinaのスポロゾイトが細胞に侵入し、最初の24hpiでより高い速度で増殖することがわかりました。 ただし、遺伝子コピーの数は96 hpi大幅に減少し、E。アセルブリナの寄生虫増殖のダイナミクスがE.テネラのものとは明らかに異なることを示しています。 したがって、さまざまなアイメリア種がin vitro培養で異なる振る舞いをする可能性があり、唯一の確立されたモデル生物としてE.tenellaから得られた一般的な結論は注意して引き出す必要があります。 より多くの時点の追加は、invitro増殖のダイナミクスをより詳細に評価するのに役立つ可能性があります。 この期間中に何が起こるか、そして将来の治療法の実際の適用がこれらの結果から導き出せるかどうかを解明するために、追加の技術を適用することができます。

それにもかかわらず、我々はこの細胞株で寄生虫の侵入の成功を示しました。 したがって、MDBK細胞は、E。acervulinaスポロゾイト細胞浸潤の感染モデルとしてさらに使用できます。 また、RT-qPCRおよびその他の高感度ツールの使用をお勧めします。 さらに重要なことに、この細胞株はE.tenella感染もサポートしています。 これは、両方のアイメリア種間の比較研究に変換することができます。 さらに詳細な定量的および定性的分析を実行して、E。acervulinaおよび他のニワトリアイメリア種の発生段階のinvitroマトリックスとしてのMDBK培養の適合性を評価する必要があります。 援助; また、M。Fritsche、B。Schneidewind、およびR. Schumacher（ライプツィヒ大学寄生虫学研究所）の動物飼育係としての優れた支援に感謝します。 R. Zhang（南西ミンズ大学動物獣医学部）の研究室での貴重な支援にも感謝します。 著者はまた、動物の許可証の作成に関する貴重な仕事をしてくれたR.Schmäschke（ライプツィヒ大学寄生虫学研究所）に感謝します。