細胞標的化ナノ粒子の肺投与による粘膜免疫の誘導
Jul 05, 2023
抽象的な
我々は以前、抗原、塩化ベンザルコニウム（BK）およびc-ポリグルタミン酸（c-PGA）で構築されたナノ粒子が、皮下投与後に高いTh1およびTh2-タイプの免疫誘導を示すことを発見しました。 ただし、呼吸器感染症を予防するには、粘膜免疫を誘導する必要があります。 この研究では、モデル抗原としてオボアルブミン (OVA)、BK、および c-PGA を含むナノ粒子の肺投与が肺および血清における粘膜免疫の誘導に及ぼす影響を調査しました。
この複合体は、RAW264.7 および DC2.4 細胞に強く取り込まれました。 肺投与後、OVA/BK/c-PGA複合体の肺滞留は、OVA単独の場合よりも長かった。 OVA 特異的な血清免疫グロブリン (Ig)G は、複合体によって高度に誘導されました。 気管支肺胞洗浄液でも高い IgG および IgA レベルが誘導され、in vivo では毒性は観察されませんでした。 結論として、我々は、OVA/BK/c-PGA複合体の肺投与により、粘膜免疫を効果的かつ安全に誘導した。
近年、粘膜免疫が体の免疫系において重要な役割を果たしていることが、ますます多くの研究で示されています。 粘膜免疫とは、人体の粘膜に基づく免疫システムのことで、主に気道、消化管、生殖器などの粘膜への病原体の侵入を防御する機能です。
粘膜免疫自体は体の免疫力を高めるわけではありませんが、外来病原体の侵入に体がより効果的に対処するのに役立ちます。 粘膜免疫を継続的に刺激することで、私たちの体はより多くの抗体を産生し、免疫力が高まります。
では、どうすれば粘膜免疫を刺激できるのでしょうか？ 以下にいくつかの提案を示します。
1. ビタミン C を十分に摂取する。ビタミン C は免疫細胞の機能を高める天然の抗酸化物質で、感染症との闘いに役立ちます。 レモン、オレンジ、イチゴなどの果物や緑葉野菜にはビタミンCが豊富に含まれています。
2.乳酸菌の摂取量を増やす。 乳酸菌は腸内フローラのバランスを整え、有害な細菌の増殖を抑制します。 一般的な乳酸菌食品としては、ヨーグルト、ザワークラウト、キムチなどが挙げられます。
3. 呼吸の練習 深呼吸。 深呼吸は肺への酸素供給と換気を増加させ、肺から蓄積した病原体を除去するのに役立ちます。
つまり、粘膜免疫を刺激することが免疫力を向上させる重要な手段となります。 私たちは健康を守るために、食生活や生活習慣を通じて粘膜免疫力を高める努力をしましょう。 そういう意味でも免疫力を高める必要があります。 肉灰には、多糖類、2 つのキノコ、黄李など、免疫システムを刺激するさまざまな生物学的活性成分が含まれているため、カンクサは免疫力を大幅に向上させることができます。 さまざまな種類の細胞が免疫活性を高めます。
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1. はじめに
急性呼吸器感染症はほぼ確実に、発展途上国における 5 歳未満の子供の主な死因となっている (Williams et al., 2002)。 インフルエンザ、百日咳、肺炎球菌などのいくつかのワクチンが呼吸器感染症用に開発されている(White, 1988; Pittman, 1991; Chen et al., 2020)。 これらのワクチンのほとんどは筋肉内および皮下経路で投与され、血清免疫グロブリン (Ig)G を効果的に誘導することができます。 ただし、急性呼吸器感染症を予防するために粘膜免疫を刺激するには、他の経路の方がより有用です。 鼻腔内や肺などの粘膜投与は、粘膜 IgA を効果的に誘導し、呼吸器感染症を予防することが報告されています (Giri et al., 2005; Ainai et al., 2017)。
一方、鼻腔内および肺投与用のワクチンには、投与部位に炎症反応や潰瘍形成を引き起こすことが報告されているアジュバントを含めるべきではありません（Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007）。 アジュバントを使用せずにワクチンの有効性を改善するための別のアプローチは、ワクチンを粘膜抗原提示細胞（APC）に効果的に送達できるシステムを開発することです。
以前の研究で、我々は、抗原、塩化ベンザルコニウム (BK) および c-ポリグルタミン酸 (c-PGA) で構築された新しいワクチン送達ベクターを開発しました。 モデル抗原としてオボアルブミン (OVA)、BK および c-PGA を含む複合体 (OVA/BK/c-PGA 複合体) は、OVA を樹状細胞に効果的に送達し、マウスへの皮下投与後に OVA 特異的血清 IgG 誘導を改善しました (Kurosaki et al .、2012）。 本研究は、肺および血清における粘膜免疫の誘導に対するOVA/BK/c-PGA複合体の肺投与の効果を調査することを目的とした。
2。材料と方法
2.1. 化学薬品
OVA は Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。 BK はナカライテスク株式会社 (京都、日本) から入手しました。 c-PGA はヤクルト製薬工業株式会社 (日本、東京) から提供されました。 フルオレセインイソチオシアネート標識 OVA (FITC-OVA) および Alexa Fluor 647- 標識 OVA (Alexa647- OVA) は、Invitrogen (米国カリフォルニア州カールズ) から入手しました。 ウシ胎児血清 (FBS) は、Biological Industries Ltd. (Kibbutz Beit Haemek、イスラエル) から購入しました。 OPTI-MEM I は GIBCO BRL (米国ニューヨーク州グランドアイランド) から入手し、ペニシリン、ストレプトマイシン、および L-グルタミンを含むプレミックス抗生物質溶液は和光純薬工業株式会社 (日本、大阪) から入手しました。 ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) および RPMI1640 培地は、日水製薬株式会社 (東京、日本) から入手しました。
2.2. 複雑な準備
以前に、我々は 1:0.2:0.2 の重量比で OVA/BK/c-PGA 複合体を構築しました (Kurosaki et al., 2012)。 OVA/BK複合体を調製するには、5パーセントのグルコースに溶解した適量のBK溶液（pH 5.0）を、5パーセントのグルコースに溶解したOVA溶液（pH 7.0）と混合し、 ＯＶＡ／ＢＫ複合体をｃ−ＰＧＡでコーティングするために、５パーセントのグルコースに溶解したｃ−ＰＧＡ溶液（ｐＨ７．０）をＯＶＡ／ＢＫ複合体に添加し、さらに１５分間４℃で放置した。各複合体の粒径およびｆ電位は、Ｚｅｔａｓｉｓｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．、英国マルバーン）を使用して測定した。
2.3. 細胞
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7および樹状細胞株DC2.4を使用した。 RAW264.7細胞は、10パーセントのFBSおよび抗生物質を補充したDMEM中で増殖させた。 DC2.4細胞は、10パーセントFBS、抗生物質、1mM非必須アミノ酸、および1nM2-メルカプトエタノールを補充したRPMI1640培地中で増殖させた。 これらの細胞は、37℃の空気中に 5% CO2 を含む加湿雰囲気下で評価されました。
2.4. in vitro 細胞取り込み実験
RAW264.7細胞とDC2.4細胞を24-ウェルプレート（Corning、NY、USA）に2.0 104細胞/ウェルの密度で播種し、50細胞で培養した。 {21}} mL の培地。 24- 時間のプレインキュベーション後、培地を OPTI-MEM I 培地に交換し、細胞を 5 mg FITC-OVA および 5 mg FITC-OVA を含む複合体とともに 2 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、これらの細胞を PBS で洗浄し、蛍光顕微鏡 (BIOREVO BZ-9000; Keyence Co.、大阪、日本) で観察しました。 観察後、これらの細胞を３００μＬの溶解緩衝液（ｐＨ７．８、０．０５パーセントのトリトンＸ｛｛２３｝｝および２ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ緩衝液）中で溶解した。 溶解物を 96- ウェル プレートに置き、蛍光マイクロプレート リーダー (Infinite-200 Pro) を使用して、発光波長 530 nm、励起波長 480 nm で FITC-OVA の蛍光を測定しました。 M-Plex、Tecan Japan Co., Ltd.、神奈川県）。 溶解物のタンパク質含量は、BSAを標準として使用するブラッドフォードアッセイによって決定されました。 マイクロプレートリーダーを使用して570nmで吸光度を測定した。 FITC-OVAの取り込みは、タンパク質1mg当たりのmgとして示された。
2.5. 動物
動物の管理および実験手順は、施設内動物管理使用委員会の承認を得て、長崎大学の動物実験ガイドラインに従って実行されました。 雄の C57BL/6N マウス (5 週齢) を日本 SLC (静岡県) から購入しました。 輸送後、実験前にマウスを 1 日間新しい環境に順応させました。 肺投与（40 mL）は、イソフルランの吸入によって麻酔をかけたマウスに自発呼吸による光を当てた舌圧子を使用して実行されました（Horiguchi et al.、2015）。
2.6. 複合体の肺蓄積
OVA の蓄積を調べるために、マウスあたり 40 mg の Alexa647- OVA と 40 mg の Alexa647- OVA を含む複合体を 40 mL の量でマウスに肺経路で投与しました。 投与の６日後、マウスを屠殺し、肺を解剖した。 マウス肺における Alexa647-OVA の蛍光強度は、データ収集用の Living Image ソフトウェアと組み合わせた Xenogen IVIS Lumina System (Xenogen, Co, Almeda, CA, USA) を使用して観察されました。 観察後、これらの肺を溶解緩衝液でホモジナイズし、ホモジネートを15,{7}} rpm (クボタ-3500、クボタ株式会社、東京、日本)で5分間遠心分離し、それらの上清中のAlexa647の蛍光を測定した。励起波長と発光波長がそれぞれ640nmと670nmのマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
2.7. 免疫
マウスを、5パーセントのグルコース溶液、40 mgのOVA、8 mgのBKと8 mgのc-PGAの空の複合体（ビヒクル）、および40 mgのOVAを含むOVA/BK/c-PGA複合体で肺投与により4回免疫した。毎週。 最後の免疫化から 2 週間後、気管支肺胞洗浄液 (BALF) と血清を採取しました。 BALF と血清は酵素免疫測定法 (ELISA) アッセイに使用されました。
2.8. OVA 特異的抗体誘導の測定
OVA コーティングの場合、100 mL の OVA 溶液 (10 mg/mL、1 M 炭酸水素ナトリウム中) を ELISA プレート (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム) の各ウェルに添加しました。プレートを、0.05パーセントのTween-20（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水、200 mLのブロッキング試薬N 102（ニチユ株式会社、東京、日本）で3回洗浄しました。 )を添加して非特異的結合をブロックし、その後4℃で6時間インキュベートした。プレートをPBSTで2回洗浄した。 次に、1000- 倍希釈した血清と希釈していない BALF サンプルの 100 mL アリコートを各ウェルに加え、4℃で一晩インキュベートしました。PBST で 5 回洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) - 結合ヤギ抗酸化物質 100 mL を各ウェルに加えました。 - マウス IgG、IgA、IgM、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、および IgG3 (1:10、000) (Abcam、ケンブリッジ、英国) – 各ウェルに添加し、室温で 1 時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで５回洗浄した。 TMB One 溶液 (Promega、ウィスコンシン州、米国) を使用し、製造業者の指示に従って調製しました。 次いで、１Ｎ塩酸を添加することにより１５分で反応を停止させた。 マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を読み取った。
2.9. OVA/BK/c-PGA複合体の生体内毒性
OVA および OVA/BK/c-PGA 複合体をマウスに肺経路で投与しました。 BALF は、マウスから投与して 3 時間後と 24 時間後に得られました。 投与の24時間後に肺も解剖した。 BALF 中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) 活性は、QuantiChromTM 乳酸デヒドロゲナーゼ キット (BioAssay Systems, CA, USA) を製造業者の指示に従って使用して測定しました。 肺サンプルは 4% パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定されました。 切片作成とヘマトキシリン・エオシン (HE) 染色は GenoStaff (東京、日本) に委託しました。 肺の HE 染色切片を 20 倍の顕微鏡で観察しました。
2.10. 統計分析
2 つのグループ間の差異の統計的有意性は、Student の t 検定を実行することによって評価されました。 グループ間の多重比較は、Tukey の検定を実行することによって実行されました。 p 値 < 0.05 は、統計的有意性を示すとみなされました。
3. 結果
3.1. 錯体の物理化学的性質
アニオン性 OVA/BK/c-PGA 複合体を重量比 1:0.2:0.2 で構築しました。 ｃ－ＰＧＡでコーティングされた複合体は、約１０５．４ｎｍの粒径および約３５．５ｍＶのｆ電位を有していた。
3.2. 複合体の細胞取り込み
図 1 に示すように、RAW264.7 細胞と DC2.4 細胞を FITC-OVA および FITC-OVA/BK/c-PGA 複合体で処理し、FITC-OVA の細胞取り込みを視覚化しました。 c-PGA複合体はRAW264.7細胞とDC2.4細胞に多く取り込まれ、FITC-OVAの強い緑色蛍光が観察されました（それぞれ図1(A、B)）。 同時に、FITC-OVAで処理した両方の細胞で少量のFITC-OVAが観察されました。
FITC-OVA の細胞取り込みは、RAW264.7 細胞および DC2.4 細胞で定量化されました (図 1(C))。 FITC-OVA/BK/c-PGA 複合体は、両方の細胞において FITC-OVA よりも有意に高い取り込みを示しました (p < .01)。
3.3. 肺投与後のAlexa647-OVAの肺蓄積
Alexa647-OVA および Alexa647-OVA/BK/c-PGA 複合体を肺経路でマウスに投与し、抗原としての Alexa647-OVA の肺蓄積を測定しました。 投与後 6 日目に肺を解剖し、Xenogen IVIS Lumina System を使用して蛍光強度を視覚化しました。 ex vivo の蛍光画像を図 2(A) に示します。 肺投与の６日後、肺全体にわたって高い蛍光強度が観察されたが、脾臓、心臓、腎臓および肝臓では蛍光強度は見られなかった（データは示されていない）。 6 日目では、肺蓄積は Alexa647-OVA/BK/c-PGA 複合体のほうが Alexa647-OVA よりも高かった。図 2(B) に示すように、肺蓄積は Alexa の方が有意に高かった。 647-OVA/BK/c-PGA は Alexa よりも複雑です647- OVA (p < .05)。
3.4. 複合体の肺投与後の血清中の OVA 特異的抗体
5% グルコース溶液、BK/c-PGA 複合体 (媒体)、OVA、OVA/BK/c-PGA 複合体を肺経路でマウスに 4 回投与し、その後血清 OVA 特異的 IgG、IgA、IgM、 OVA および OVA/BK/c-PGA 複合体の肺投与により、マウスの IgG レベルが増加しましたが、5 パーセントのグルコースとビヒクルを投与されたマウスでは OVA 特異的 IgG は検出されませんでした。 さらに、IgGおよびIgA産生は、OVA/BK/c-PGA複合体の投与後は、OVAの投与後よりも有意に高かった(p<0.05または0.01)。 一方、OVA 特異的 IgM および IgE は、OVA または OVA/BK/c-PGA 複合体によって誘導されませんでした。
3.5. 複合体の肺投与後の BALF 中の OVA 特異的抗体
図 4 に示すように、BALF 中の OVA 特異的 IgG、IgA、IgM、および IgE も測定されました。IgG レベルは、コントロールおよびビヒクルの投与後のレベルと比較して、OVA によって有意に増加しました (p < .05 または.01）。 それにもかかわらず、OVA/BK/c-PGA 複合体は、BALF 中の IgG だけでなく IgA も有意に増加させました (p < 0.01)。 しかし、OVA 特異的 IgM および IgE は、OVA または OVA/BK/c-PGA 複合体によっては誘導されませんでした。
3.6. 複合体の肺投与後の血清中の IgG サブタイプ
血清中の IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 などの OVA 特異的 IgG サブタイプの誘導効果を図 5 に示すように測定しました。コントロールおよびビヒクルと比較して、OVA は IgG1 のみを有意に増加させました (p < 0.01)。 OVA/BK/c-PGA複合体によって誘導されたすべてのサブタイプの抗体レベルは、対照およびビヒクルによって誘導されたレベルよりも有意に高かった(p<0.05または0.01)。
3.7. 複合体の肺投与後の BALF における IgG サブタイプ
図 6 に示すように、BALF 内の IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 などの OVA 特異的 IgG サブタイプも測定されました。OVA は、コントロールおよびビヒクルによって誘導されたレベルと比較して、IgG1 レベルのみを有意に増加させました (p < .01)。 。 コントロール、ビヒクル、および OVA と比較して、OVA/BK/c-PGA 複合体は、すべてのサブタイプで有意に高い抗体レベルを誘導しました (p < 0.05 または 0.01)。
3.8. OVA/BK/c-PGA複合体の生体内毒性
マウスには、5パーセントのグルコース溶液、OVA、およびOVA/BK/c-PGA複合体を投与した。 BALF 内の LDH 活性は、投与の 3 時間後または 24 時間後に測定されました (図 7)。 OVA および OVA/BK/c-PGA 複合体の投与は、BALF 内の LDH レベルにほとんど影響を与えませんでした。
投与の 24 時間後、組織学的分析のためにこれらのマウスから肺を解剖しました。 HE染色した肺切片を図8に示す。OVAおよびOVA/BK/c-PGA複合体で処置したマウスでは組織学的異常は観察されなかった。
4。討議
肺は呼吸を制御しており、呼吸器感染症を引き起こすウイルスや細菌などの多くの病原体にさらされています。 これらの病原体は肺粘膜を介して感染するため、呼吸器感染症を防ぐために粘膜免疫を誘導する必要があります。 呼吸器感染症の予防には粘膜免疫が重要な役割を果たします。 しかし、ワクチンの皮内および筋肉内投与は粘膜免疫を強力に刺激することはできない（Ito et al., 2003; Amorij et al., 2007）。 分泌型 IgA を誘導する粘膜免疫系は粘膜表面で発達します。 樹状細胞やマクロファージなどのいくつかの APC が粘膜表面に存在することが報告されています (Kopf et al., 2015)。 さらに、気管支関連リンパ組織（BALT）は細気管支粘膜に見られ、気道粘膜免疫において中心的な役割を担うリンパ濾胞です（Bienenstock、1980）。 ワクチンの肺投与は、粘膜免疫系を効果的に刺激することが期待されます。 したがって、肺経路を介して投与されるワクチンとしての有用性を評価するために、OVA/BK/c-PGA複合体を構築しました。
図４は、ＯＶＡおよびＯＶＡ／ＢＫ／ｃ−ＰＧＡ複合体の肺投与後のＯＶＡ特異的抗体のＢＡＬＦ濃度を示す。 OVA の肺投与は IgG を増加させましたが、BALF の IgA にはほとんど影響しませんでした。 一方、OVA/BK/c-PGA複合体はBALFにおけるIgA分泌を有意に誘導した。 さらに、血清 IgG 誘導は、OVA の投与後よりも OVA/BK/c-PGA 複合体の投与後の方が有意に高かった (図 3)。 血清 IgG は、発生した感染症の悪化を防ぐために重要です (Huber et al., 2006; Schroeder & Cavacini, 2010)。 結果は、OVA/BK/c-PGA複合体が粘膜IgAの高度な誘導によって呼吸器感染症を予防し、血清IgGの高度な誘導によって呼吸器感染症の悪化を予防できることを示している。 さらに、ＯＶＡ／ＢＫ／ｃ−ＰＧＡ複合体によるＩｇＥ誘導は観察されず、この結果は、ＯＶＡ／ＢＫ／ｃ−ＰＧＡ複合体によるアレルギー反応の危険性が低いことを示した。
OVA/BK/c-PGA 複合体は、IgG1 と IgG2b だけでなく、IgG2a と IgG3 も誘導する可能性があります (図 5)。 IgG1 と IgG2b は体液性免疫応答を媒介する Th2- 型免疫グロブリンとして知られ、IgG2a と IgG3 は細胞性免疫応答を媒介する Th1- 型免疫グロブリンとして知られています (Firacative et al., 2018) 。 したがって、OVA/BK/c-PGA 複合体は体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導する可能性があります。 これらの結果は、このシステムが癌だけでなく感染症に対するワクチンにも役立つ可能性があることを示唆しています。 予防効果、誘導性BALT、Treg集団における抗原誘導性のTh1-およびTh2-型サイトカイン応答、およびIL-10誘導は、将来、感染症またはがん由来の実際の抗原を使用して評価されるべきである勉強します。
OVA/BK/c-PGA複合体による免疫応答の強力な誘導は、複合体の肺内での高い滞留と肺粘膜のAPCへのOVAの効果的な送達によるものに違いない。 我々の結果は、投与から6日後、Alexa647- OVA/BK/c-PGA複合体が肺に残り、Alexa647- OVAよりも有意に高い蛍光を示したことを示し、これを裏付けました（図2）。 複合体の形成により、OVA の拡散が防止され、肺粘膜におけるプロテアーゼによる OVA の分解が防止される可能性があります。 さらに、OVA/BK/c-PGA 複合体は、OVA を RAW264.7 マクロファージ細胞および DC2.4 樹状細胞に効果的に送達することができました (図 1)。 これらの結果は、OVA/BK/c-PGA複合体が肺胞APCに取り込まれ、肺投与後に高い免疫応答を誘導することを示した。 c-PGA でコーティングされたナノ粒子は、ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼ媒介エンドサイトーシス経路によって取り込まれたことが報告されています (Du et al., 2015)。 また、c-PGA でコーティングされたナノ粒子が c-PGA 特異的なエンドサイトーシス経路によって取り込まれることも確認しました (Kurosaki et al., 2009)。 OVA/BK/c-PGA 複合体は、同じメカニズムを通じて肺内の APC に取り込まれる可能性があります。 しかし、どの細胞が OVA の取り込みとその後の特異的免疫の誘導における抗原提示に関与しているのかはまだ明らかではありません。 詳細な免疫誘導メカニズムについては、今後さらなる研究が行われる必要があります。
ワクチンの有効性を高めるために多くのアジュバントが開発されています。 しかし、アジュバントは注射部位で炎症反応を引き起こすことが報告されている(Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007)。 したがって、肺へのアジュバントの投与は、肺炎などの重篤な副作用を引き起こす可能性があります。 OVA/BK/c-PGA複合体の肺投与後、BALF中のLDHレベルは増加せず(図7)、HE染色切片には組織学的異常は観察されなかった(図8)。 報告によると、c-PGA は免疫炎症反応を示さない生体適合性および生分解性ポリマーです (Prodhomme et al., 2003; Ye et al., 2006)。 BK は、抗菌添加剤として臨床的に広く使用されている安全な第 4 級アンモニウム化合物です (Marple et al., 2004)。 これらの報告は、OVA/BK/c-PGA 複合体の安全性も裏付けています。 一方、対照群においても、肺投与後24時間よりも3時間の方が高いLDHレベルが観察された。 これらの結果は、経肺投与によってわずかな刺激が引き起こされたことを示しています。 OVA/BK/c-PGA 複合体の臨床応用の前に、さらなる安全性研究が必要です。
本研究では、抗原タンパク質、BK、およびc-PGAで構築された新規ワクチン送達ベクターによる肺投与後の高度な粘膜免疫系誘導を実証しました。 このシステムは、さまざまな呼吸器感染症に対するワクチンに使用できます。
開示声明
著者からは利益相反の可能性は報告されていません。
資金調達
この研究は、助成金 [JP20K12649 および JP20K07156] のもと、日本学術振興会 (JSPS) 科研費によって支援されました。
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