マウスB16F10黒色腫におけるアルファメラノサイト刺激ホルモン誘発メラニン形成に対するGastrodia Elata Blume抽出物の阻害効果
May 17, 2023
背景/目的:伝統的な漢方薬であるガストロディア エラタ ブルーメ (GEB) は、東洋医学において幅広い神経疾患 (麻痺や脳卒中など) や皮膚の問題 (アトピー性皮膚炎や湿疹など) の治療に使用されてきました。 この研究は、GEB 抽出物がマウス B16F10 黒色腫におけるメラニン形成活性を阻害するかどうかを調査するために設計されました。
関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 主成分はシスタノシドで、抗酸化作用、抗炎症作用、免疫機能促進作用などさまざまな作用があります。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。 人間の皮膚のメラニンはチロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルがメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らし、メラニンの生成を抑制します。
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序章
人間の肌の色は、遺伝や多くの要因、主にメラニンの量と種類の影響を受けます。 メラニンは、日光、ストレス、およびメラニン刺激因子（例、α-メラノサイト刺激ホルモン（-MSH））への皮膚の曝露に応答して、メラノサイトのメラノソームで生成され、表皮の基底層のメラノサイトからケラチノサイトに移動します。 、一酸化窒素、エンドセリン-1] [1,2]。 たとえば、-MSH は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質 (Trp)1、および Trp2 などのメラノサイト特異的酵素の強力な誘導因子である小眼球症関連転写因子 (MITF) 誘導を通じてメラニン生成を促進します [1]。 メラニン生成は主に、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼによって調節されており、ミコフェノール酸によるチロシンの3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）への水酸化と、ジフェノラーゼによるL-DOPAのドーパキノンへの酸化を触媒します。これは、ユーメラニンとフェオメラニンの両方の生合成に共通のステップです。 その後のステップには、ユーメラニン (褐色/黒色色素) を生成するための 2 つの追加のメラノサイト特異的酵素、Trp1 および Trp2 (ドーパクロム トートメラーゼとしても知られています) と、フェオメラニン (赤/黄色) を生成するシステイン/グルタチオン関連の非酵素的ステップが含まれます。顔料)、それぞれ。 ハイドロキノン [3,4]、コウジ酸 [5]、アスコルビン酸 [6]、アルブチン [7] などのチロシナーゼ阻害剤は、色素沈着過剰症の治療に使用されてきましたが、最近、ヒトにおけるいくつかの副作用が報告されています [1, 2]。 したがって、副作用なく色素脱失を誘発できる、より安全で効果的な天然源からのメラニン生成阻害剤を見つけることに多くの注目が集まっています。
クロロフィルを欠く蘭植物であるガストロディア・エラタ・ブルーメ（GEB）は、発芽と成長/成熟にそれぞれ共生菌類であるミセナ・オスムンディコラとナラタケを必要とする[8、9]。 GEBは、神経変性疾患（麻痺、めまい、脳卒中、てんかん、認知症など）を治療するための東洋医学の治療法として使用されています[9、10]。 GEB からはさまざまな生理活性化合物が単離されており、最も重要なものはガストロジン、4-ヒドロキシベンジルアルコール、4-ヒドロキシベンズアルデヒド、バニリン、バニリルアルコール、バニリン酸などのフェノール化合物です [{{6 }}]。 最近、GEB の生理活性化合物にはチロシナーゼ活性を阻害する効力があることが報告されています [13-16]。 さらに、最近の研究では、GEB 中にエルゴチオネイン (Ergo) [8,11] とジオスゲニン [17] が同定されました。 エルゴは主にキノコに含まれています[18,19]が、ジオスゲニンはワイルドヤムに含まれています[20]。 両方とも、その強力な抗酸化活性により、2010 年にアンチエイジング クリームに含まれる植物成分トップ 10 にリストされており [21]、GEB が薬用食品だけでなく機能性化粧品としても使用できる可能性があることを示唆しています。
凍結乾燥および蒸気乾燥した GEB の組成 [22]、その化学成分 [11、12、23]、抗酸化作用 [12]、抗血小板作用、抗血栓作用 [24] についての報告はあるが、 B16F10黒色腫におけるメラニン合成およびその関連酵素に対するGEB抽出物の阻害効果については知られています。 GEB はその生理活性化合物と抗酸化特性により、神経障害や皮膚の問題の伝統的な治療法として使用されてきたため、マウス B16F10 黒色腫のメラニン含有量とチロシナーゼ活性、転写因子と調節酵素の分子レベルを分析しました。
材料および方法
Gastrodia elata Blume (GEB) 抽出物の調製
細胞培養
細胞生存率アッセイ
B16F10 細胞を 24- ウェルプレートに 4 × 104 細胞/ウェルの密度で播種しました。 100%コンフルエントな細胞を、200 nM -MSH (Sigma-Aldrich Co.、セントルイス、ミズーリ州、米国) の有無にかかわらず処理した後、0-25 mg/mL の GEB 抽出物で 24 時間前処理しました。 培地を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT; Amresco, Solon, OH, USA)と置き換えた。 ) 色素溶液 [リン酸緩衝食塩水 (PBS) 中 5 mg/mL]、37 度で 3 時間。 上清をデカントし、ホルマザン塩を500μLのイソプロパノールに溶解した。 吸光度は、分光光度計 (Gen5.2; Biotek、Winooski、VT、USA) を使用して 570 nm で測定しました。
メラニン含有量分析
B16F10細胞を、200 nM -MSHの有無にかかわらず24時間処理した後、0-5 mg/mLのGEB抽出物または400 ug/mLのアルブチン（陽性対照；Sigma-Aldrich）で72時間処理しました。 細胞を1X PBSで2回洗浄し、続いて放射免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解緩衝液(Thermo Scientific、米国イリノイ州ロックフォード)で溶解し、14000 rpmで10分間、25度で遠心分離した。 ペレット (約 105 個の細胞) を、10% ジメチルスルホキシドを含む 1N NaOH 1 mL に 80 度で 2 時間かけて可溶化しました。 上清の吸光度を470 nmで測定した。 サンプル中のメラニン濃度は、合成メラニン (Sigma-Aldrich) 標準曲線から得られました。 各サンプルは、Pierce® BCA 法 (Thermo Scientific) を使用して総細胞タンパク質含量に対して正規化されました。
チロシナーゼ活性の測定
B16F10細胞を、200nM -MSHの存在下または非存在下で24時間処理した後、0-5 mg/mLのGEB抽出物または400μg/mLのアルブチン(陽性対照)で72時間処理した。 細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、続いてＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解し、１５μｍ｛｛１０｝｝ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。 上清(100μL)を96-ウェルプレートに置き、100μLの5mM L-DOPAと混合し、37度で2時間インキュベートした。 吸光度は420nmで測定した。 各サンプルは、Pierce® BCA 法 (Thermo Scientific) を使用して総細胞タンパク質含量に対して正規化されました。
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムPCR）の解析
B16F10細胞を、200nM -MSHの存在下または非存在下で24時間処理した後、0-5 mg/mLのGEB抽出物または400μg/mLのアルブチン(陽性対照)で72時間処理した。 細胞の全 RNA を、Trizol 試薬 (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) および RNA 抽出キット (RNase Mini キット、Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して単離しました。 全RNA（2μg）を、逆転写マスタープレミックス（ELPIS、大田、韓国）を使用して逆転写した。 リアルタイム PCR (LightCycle 96; Roche、インディアナ州インディアナポリス、米国) は次のプライマーを使用して実行されました: マウス MITF 前方 5'-GGCCAAGGCAGAGCAACTT-3'、後方 5'-GCCCATGGTGGCAAGCT-3' チロシナーゼ前方 5'-ATAGGTGCATTGGCTTCTGG-3'、後方 5'-CCAACGATCCCATTTTTCTT-3'; Trp1 順方向 5'-GAGTGACATCCTGTGGCTCA-3'、逆方向 5'-CGATACCCTGGGAACACTTT-3'; Trp2 順方向 5'-GCATCTGTGGAAGGGTTGTT-3'、逆方向 5'-ACTCCTTCCTGAATGGGACC-3'; グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は順方向5'-TCAATGAAGGGGTCGTTGAT-3'、逆方向5'-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3'。 発現レベルは GAPDH の発現レベルに対して正規化されました。
ウェスタンブロット分析
統計分析
結果
B16F10 細胞の細胞生存率に対する Gastrodia elata Blume (GEB) の影響
GEB 抽出物の潜在的な毒性を調べるために、まず、200 nM -MSH の存在下または非存在下で 24 時間処理した後、B16F10 細胞をさまざまな濃度 (0-25 mg/mL) の GEB 抽出物とインキュベートすることで GEB 細胞毒性を評価しました。 h. -MSH刺激に関係なく、低GEB濃度（0.5-5 mg/mL）では細胞生存率は阻害されませんでしたが、高濃度（10-25 mg/mL）では毒性が顕著に誘発されました（図1）。 10 mg/mL および 25 mg/mL の GEB での細胞生存率は、それぞれ未処理対照の 85.9 パーセントと 68.7 パーセントでした。 -MSH刺激後のGEB 10および25 mg/mLでの細胞生存率は、それぞれ未処理対照の89.9パーセントおよび65.3パーセントでした。 したがって、0-5 mg/mL の濃度をさらなる実験で使用しました。
B16F10細胞におけるメラニン合成およびチロシナーゼ活性に対するGastrodia elata Blume（GEB）の影響
GEB 抽出物のメラニン形成活性を評価するために、-MSH 未処理 B16F10 細胞と -MSH 処理 B16F10 細胞の両方のメラニン含有量を測定しました。 細胞を-MSHの存在下または非存在下で24時間前処理し、続いてGEB抽出物で0-5 mg/mLまたは400μg/mLのアルブチンの用量で72時間処理した。 GEB治療は、-MSH治療群およびすべての-MSH未治療群において、高用量（2-5 mg/mL）で用量依存的に細胞メラニン含量を有意に減少させた。 -MSH単独では、対照と比較してメラニン含有量が180パーセント増加し、GEB治療は、-MSH未治療群と比較して、用量依存的に-MSH誘発色素沈着過剰状態におけるメラニン合成を顕著に阻害した（図2）。
チロシナーゼはメラニン合成の律速酵素であるため、B16F10 細胞における細胞チロシナーゼ活性に対する GEB 抽出物の阻害効果を測定しました。 -MSH は、B16F10 細胞においてチロシナーゼ活性を 171.2 パーセント誘導しました。 -MSH処理に関係なく、GEB抽出物はチロシナーゼ活性を有意に阻害した。 アルブチンはチロシナーゼ経路を介したメラニン合成の阻害剤としてよく知られています[7]。これは、-MSH未治療群と-MSH治療群の両方で未治療対照と比較して35-40パーセントだけ有意に阻害されました（図3）。 。 2 mg/mL および 5 mg/mL の GEB 抽出物のメラニン含有量とチロシナーゼ活性は、400 ug/mL アルブチンのメラニン含有量とチロシナーゼ活性と同様であり、GEB が陽性対照レベルまで用量依存的な抗メラニン生成活性を示し、このメラニン生成阻害が示唆されるGEB 抽出物による影響は、細胞チロシナーゼ活性の低下に関連しています (図 3)。
B16F10細胞におけるMITF、チロシナーゼ、Trp1、およびTrp2のmRNAレベルおよびタンパク質発現に対するGastrodia elata Blume（GEB）の影響
GEB 抽出物によるメラニン合成の阻害がメラニン生成関連遺伝子の発現と関連しているかどうかを判断するために、リアルタイム PCR を実行して MITF、チロシナーゼ、Trp1、および Trp2 の mRNA レベルを調べました。 これらすべての遺伝子の mRNA レベルは、-MSH 未処理グループと -MSH 処理グループの両方で GEB 抽出物によって用量依存的に減少する傾向がありましたが、-MSH 未処理細胞では無視できるほどでした。 MITF、チロシナーゼ、Trp1、および Trp2 の分子レベルは、低 GEB 濃度 (0.5-1 mg/mL) では阻害され、高濃度 (2-5 mg) では顕著ではありましたが、有意には阻害されませんでした。 /mL) -MSH未処理細胞中。 -MSHはこれらの遺伝子のmRNAレベルを顕著に誘導しましたが、GEB抽出物はそれを減少させました。 -MSH処理細胞においてさえ、GEB抽出物の用量が低いとMITF、チロシナーゼ、Trp1、およびTrp2のmRNAレベルが低下する傾向があったのに対し、GEB抽出物の用量が高いと、これらすべての遺伝子のmRNAレベルが有意に阻害された。 高用量での GEB 抽出物の阻害レベルは、化粧品の美白成分としてよく知られているアルブチンと同様でした (図 4)。
さらに、この転写因子とメラニン生成酵素のタンパク質発現をウエスタンブロット解析により評価しました。 -MSH処理は、これらすべての遺伝子のタンパク質発現およびmRNAレベルを有意に誘導し、用量依存的に回復した。 GEB抽出物の用量が低いと、-MSHによって誘導されるMITF、チロシナーゼ、Trp1、およびTrp2のタンパク質発現が減少する傾向がありましたが、用量が高いと、-MSH処理B16F10細胞におけるこれらすべてのマーカーが用量依存的に有意に阻害されました。 高用量での GEB 抽出物の阻害レベルはアルブチンと同等の効果がありました (図 5)。
議論
この研究では、GEB 抽出物がマウス B16F10 黒色腫細胞におけるメラニン生成と、MITF、チロシナーゼ、Trp1、Trp2 などの関連酵素の活性および分子発現に対して阻害活性を有することを発見しました。 0.5-5 mg/mL の用量の GEB 抽出物は、用量依存的にメラニン生成関連マーカーを阻害しました。 GEB 抽出物の用量が低い (0.{9}} mg/mL) と、メラニン形成、チロシナーゼ活性、mRNA レベル、および MITF、チロシナーゼ、Trp1、および Trp2 のタンパク質発現が低下する傾向があったのに対し、用量が高いと ({{12} ｝ ｍｇ／ｍＬ）のＧＥＢ抽出物は、−ＭＳＨ未処理Ｂ１６Ｆ１０および−ＭＳＨ処理Ｂ１６Ｆ１０の両方において、用量依存的にこれらすべてのマーカー細胞を有意に阻害した。 高濃度での GEB 抽出物のこれらの阻害効果は、400 ug/mL アルブチンの阻害効果と同様でした。
メラニンはメラノソーム内の L-チロシンから形成され、皮膚、髪、目の特徴的な色を決定します [1]。 メラニンは紫外線 (UV) 光やストレスから保護する役割を果たしますが、メラニン色素の過剰生成と蓄積は色素沈着過剰を引き起こし、哺乳類ではそばかす、シミ、肝斑などのいくつかの皮膚問題を引き起こします[25]。 したがって、メラニン生成の阻害は、皮膚の脱色および美白の医薬品および美容上の治療において懸念事項となっている。 -MSH がメラノコルチン -1 受容体 (MC1R) に結合すると、環状アデノシン一リン酸 (cAMP) が増加し、その後 MITF が活性化されます。 MIFT は、構造的に 40-45 パーセントの類似性を共有するチロシナーゼ、Trp1、Trp2 などのメラニン生成酵素の発現を効果的に上方制御します [1,2]。 何よりも、チロシナーゼ阻害は、この酵素が色素沈着の律速段階を触媒するため、皮膚の色素沈着低下を達成するための最も一般的なアプローチです。 Trp1 と Trp2 は両方とも、結果として生じるメラニンの生合成に関与しています [1、2]。
リーら。 [26]は、チロシナーゼおよびDOPA自動酸化の阻害活性を測定することによって化粧品用途のための100の植物抽出物をスクリーニングし、Gastrodia elata、Chaenomeles speciosa、Dryopteris crassirrhizoma、Glycyrrhizaglabra、Morusalba、Myristicafragrans、Dheum palmatum、およびSophoraなどの多くの植物抽出物が含まれていると報告しました。 japonica はキノコチロシナーゼ活性の阻害を示しました。 チェンら。 [2] また、78 の薬草植物をスクリーニングし、GEB の根茎がチロシナーゼ活性を阻害する可能性があることを発見しました。 GEB は神経変性疾患の治療に東洋医学として使用されてきましたが、これらのスクリーニング研究からチロシナーゼ阻害剤として使用される可能性が高いと考えられます。
最近の研究 [9] では、さまざまなクロマトグラフィー技術を使用して 64 個の GEB 成分が報告されています。 それらの中で最も重要なフェノール化合物は、ガストロジン [4-(-d-グルコピラノシルオキシ) ベンジル アルコール]、4- ヒドロキシ ベンジル アルコール (4-HBA)、4- ヒドロキシ-ベンズアルデヒド、バニリン（4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド）、バニリルアルコール（4-（ヒドロキシメチル）-2-メトキシフェニル）、バニリン酸（4-ヒドロキシ{{14 }}メトキシ安息香酸) [8-12]。 最近、新しい天然化合物が GEB で発見されました。 ビス (4- ヒドロキシフェニル) スルフィド [2]、エルゴ [8]、ジオスゲニン [17]。 ハイドロキノンとGEBの主要なフェノール化合物の構造は非常に似ています[27]。 ヒドロキノンのヒドロキシル基 (-OH) は、4-HBA [27] ではヒドロキシメチル基 (-CH2OH) に、4- ヒドロキシベンズアルデヒドではカルボニル基 (-CHO) に置換されます。 メトキシ基 (-OCH3) がヒドロキノンに付加されてバニリルアルコールを形成し、4- ヒドロキシベンズアルデヒドに付加されてバニリンが形成されます。 バニリン酸はバニリンの酸化型です。
最近の研究では、これらの化合物のほとんどが、B16 [14,28] および HM3KO 黒色腫細胞 [13]、正常なヒト包皮線維芽細胞 [29]、および in vivo ゼブラフィッシュ モデル [2,29] において、キノコチロシナーゼおよびメラニン形成に対して阻害活性を発揮することが報告されています。 例えば、ブタノール抽出 GEB から単離されたフェノール画分 [14] は、チロシナーゼ、Trp1、および Trp2 の活性、ならびにこれらの酵素の mRNA およびタンパク質の発現を低下させることにより、メラニン生成に対して阻害効果を発揮しました。 ガストロジン [15] と 4- HBA [16] は、B16 黒色腫細胞のチロシナーゼ活性を阻害することでメラニン生成を抑制しました。 ガストロジンと 4-HBA のヒドロキシル基は主にチロシナーゼの活性部位のヒスチジン残基と相互作用し、これがチロシナーゼ活性の阻害につながりました [30]。 4-HBA のフェノール性 OH からの酸素は、求核攻撃によってチロシナーゼの触媒活性に影響を与えます [31]。 バニリン酸とバニリルアルコールのヒドロキシ基とメトキシ基は、チロシナーゼのジフェネノラーゼ活性の阻害剤として作用し[32]、特にバニリルアルコール中のCH2OHの-COOH（バニリン酸）への変換は、チロシナーゼ阻害の顕著な増加につながる[32]。 ]。 Origanum vulgare から単離されたバニリン酸は、-MSH で刺激された B16F10 細胞において、細胞のチロシナーゼ活性、DOPA オキシダーゼ、およびメラニン含有量を減少させ、さらに MC1R、MITF、Trp1、および Trp2 の発現を下方制御しました。 バニリンはチロシナーゼ活性の阻害を発現しなかった[29]。 最近、GEB から単離された天然産物であるビス(4-ヒドロキシベンジル)スルフィドは、ビス({{計算分子モデリングによる、チロシナーゼの活性部位に銅イオンを有する 33}}}ヒドロキシベンジル) 硫化物 [2]。 これらの結果は、GEB のさまざまなフェノール化合物が、チロシナーゼの活性部位の銅イオンおよび/またはヒスチジン残基と相互作用することによってチロシナーゼ阻害剤として作用する可能性があることを示唆しています。
エルゴとジオスゲニンは、2010 年のアンチエイジング クリームのトップ 10 の植物成分の 1 つとして選ばれました [21]。 Ergo は天然の水溶性チオール アミノ酸 [18,19] で、最近 GEB で発見されました [8]。 生理学的 pH では、エルゴはチオール (-SH) 形ではなく主にチオン (= S) 形で存在します [19]。 分解が遅く、ジスルフィド形成に対する耐性があり、自動酸化されないため、グルタチオンよりも安定しています [18,19]。 エルゴ中の硫黄置換イミダゾール環の存在は、キノコチロシナーゼ活性を用量依存的に阻害した[33]。 別の化合物であるワイルドヤム (Dioscorea villosa) 抽出物由来のジオスゲニンには色素脱失効果があるため、肝斑、黒色皮膚炎、黒子に使用できます [34]。 黒色腫細胞に対して行われた研究では、色素脱失効果が細胞のホスファチジルイノシトール- 4、5-二リン酸3-キナーゼ経路の活性化に関連していることが示されており、ジオスゲニンが効果的な阻害剤である可能性があることが示唆されています。色素沈着過剰症[34]。 さらに、抗コラゲナーゼ活性を誘導することにより、抗炎症作用と老化防止作用もあります[35]。
メラニン生成の調節には少なくとも 3 つのシグナル経路が関与している可能性があります。 cAMP依存性、Wnt、および細胞外シグナル調節キナーゼシグナル伝達経路[1]。 これらのシグナル経路はすべて、MITF の発現および/または活性を介してメラニン生成関連酵素、つまりチロシナーゼ、Trp1、および Trp2 を制御します [1]。 GEBによるメラニン生成の抑制におけるこれらのシグナル経路の潜在的な関与については、今後も調査される予定である。
利益相反
参考文献
詳細については: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
