ISG15-に依存するセンサーの活性化MDA5はSARS-CoV-2のパパイン様プロテアーゼによって拮抗され、宿主の自然免疫を回避する
Nov 08, 2023
RIG-I 様受容体、レチノイン酸誘導性遺伝子 I (RIG-I)、および黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA5) の活性化は、インターフェロン (IFN) 刺激遺伝子 (ISG) を上方制御することにより抗ウイルス状態を確立します。 その中には ISG15 も含まれますが、自然免疫におけるその機構的な役割は依然として謎に包まれています。 本研究では、ウイルス RNA センサー MDA5 によって媒介される抗ウイルス IFN 応答には、ISG15 結合が必須であることを報告します。 MDA5 のカスパーゼ活性化およびリクルートドメインの ISG 化はそのオリゴマー化を促進し、それによってコロナウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルスなどのさまざまなウイルスに対する自然免疫の活性化を引き起こします。 ISG15-に依存するMDA5の活性化は、新型コロナウイルス-19のパンデミックを引き起こした最近出現したコロナウイルスであるSARS-CoV-2のパパイン様プロテアーゼによって媒介される直接的な脱ISG化によって拮抗される。 私たちの研究は、MDA を介した抗ウイルス反応における ISG15 の重要な役割を実証しています5-。また、SARS-CoV の主要な免疫回避機構も特定しています-2。これは、新しい抗ウイルス薬やワクチンの開発の標的となる可能性があります。新型コロナウイルスと闘う-19。
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ウイルスによる宿主免疫恒常性の混乱は、危険または病原体関連分子パターン (PAMP) を感知する受容体に依存する自然免疫系によって監視されています1-3。 RIG-I 様受容体 (RLR) RIG-I および MDA5 は、細胞質内のウイルスまたは宿主由来の免疫刺激性 RNA を調査することによるウイルス検出に極めて重要です4。 RIG-I および MDA5 の C 末端ドメイン (CTD) およびヘリカーゼへの RNA の結合により、シグナル伝達が刺激された構造が形成され、いくつかの酵素の動員が可能になります 5。 これらの酵素は複数のドメインおよび部位で RLR を修飾し、翻訳後修飾 (PTM) は、シグナル伝達モジュールであるカスパーゼ活性化およびリクルートドメイン (CARD) について特によく研究されています。 プロテインホスファターゼ 1 (PP1) / は、RIG-I および MDA5 CARD を脱リン酸化します6。 RIG-I の場合、脱リン酸化は TRIM25 (25 を含む三部構成モチーフ) およびその他の E3 リガーゼ 7,8 による CARD の Lys63- 結合ポリユビキチン化を促進し、これにより RIG-I のオリゴマー型が安定化し、それによってミトコンドリア抗ウイルス薬が可能になります。 -シグナル伝達タンパク質（MAVS）結合。 RIG-I の場合と比較して、MDA5 活性化の個々のステップとそれに関与する重要な PTM はあまりよく理解されていません。 RLR の活性化は I 型および III 型 IFN の産生を誘導し、次に ISG を上方制御することによって抗ウイルスシグナル伝達を伝播します 9、10。 その中には、標的タンパク質のリジン残基に共有結合することができるユビキチン様タンパク質である ISG15 があり、これは ISGylation と呼ばれる PTM プロセスです 11。 ISG15 の結合は抗ウイルス作用があることが広く認識されていますが 12、ISG15 の広範な抗ウイルス制限活性を説明できる宿主タンパク質 ISG 化のメカニズムは現在不明です。 現在進行中の新型コロナウイルス-19パンデミックの原因物質である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SCoV2)は、他のいくつかのヒト病原体を含むコロナウイルス科に属しています。 コロナウイルスは、IFN を介した抗ウイルス反応を抑制する優れた能力を持っており、SCoV 感染患者における IFN 産生の低下は重篤な疾患と相関しています13。 コロナウイルス IFN アンタゴニストの中には、脱ユビキチン化および脱 ISG 化活性を持つパパイン様プロテアーゼ (PLpro) があります 14,15。 本研究では、MDA5 活性化における ISGylation の重要な役割を特定しました。 さらに、SCoV2 PLproがMDA5と相互作用し、能動的な脱ISG化を介してISG15-依存性のMDA5活性化に拮抗することを示し、SCoV2がすでにMDA5による免疫監視を逃れるように進化していることを明らかにした。
結果
MDA5 では、RIG-I ではなくシグナリングに ISG15 が必要です。
MDA5活性化を調節する可能性のあるMDA5カードのPTMを同定するために、グルタチオン-S-トランスフェラーゼと融合したアフィニティー精製したMDA5-2CARD（GST-MDA5-2CARD）、またはGST単独をタンデム質量分析（LC）と組み合わせた液体クロマトグラフィーに供しました。 -MS/MS)、特に、ISG15 と同時精製された GST-MDA5-2CARD は、未修飾の GST-MDA5-2CARD よりもゆっくりと (約 15 および 30 kDa) 移動する 2 つのバンドとして現れたことがわかりました (拡張データ)図1a)。 免疫ブロッティング（IB）により、GST-MDA5-2CARDがISG15によって修飾されていることが確認されました（拡張データ図1b）。 次に我々は、MDA5-誘導シグナル伝達に対するISG15の関連性を決定した。 野生型 (WT) マウス胎児線維芽細胞 (MEF) における FLAG-MDA5 の発現は、用量依存的に IFN-メッセンジャー RNA およびタンパク質、ならびに Ccl5 転写物を誘導しましたが、Isg15-/- MEF における FLAG-MDA5 の発現は、抗ウイルス遺伝子とタンパク質の発現 (図 1a および拡張データ 図 1c)。 同様に、ISG15ノックアウト（KO）HeLa（ヒト）細胞では、WT対照細胞と比較して抗ウイルス遺伝子の誘導が大幅に減少し（図1bおよび拡張データ図1d）、種特異的な効果は除外されます。 対照的に、FLAG-RIG-Iは、Isg15-/-およびWT MEFにおいて同等の量の分泌IFN-タンパク質、ならびにIfnb1およびCcl5転写物を誘導した（図1aおよび拡張データ図1c）。 IFNB1およびCCL5転写物、ならびにFLAG-RIG-IによるIFNタンパク質産生は、WT細胞と比較してISG15 KO HeLa細胞で同様またはわずかに増強されており（図1bおよび拡張データ図1d）、これはISG化が負であるという以前の報告と一致しています。 RIG-I シグナリングに影響を与える16、17
図1|ISGylation は MDA5 シグナル伝達に必要ですが、RIG-I シグナル伝達には必要です。 a、b、MEF（WTまたはIsg15-/-）（a）およびHeLa細胞（WTまたはISG15 KO）（b）のFLAGタグ付きMDA5またはRIG-Iの量を増加させて一時的にトランスフェクトした上清からのIFN-のELISA。 40時間。 全細胞溶解物 (WCL) を、抗 ISG15、抗 FLAG、および抗アクチン (ローディング コントロール) を使用した IB によってプローブしました。 c、EMCV RNA（0.1または0.4μg ml-1）、HMW-polyで疑似刺激またはトランスフェクトされたWTまたはIsg15-/- MEFの上清からのIFN-のELISA (I:C) (0.5 μg ml-1 ) または RABVLe (1 pmol ml-1 )、または SeV (10 赤血球凝集単位 (HAU) ml-1) に 24 分間感染h. d、cと同様に刺激されたWTおよびIsg15-/- MEFにおけるIfnb1、Ccl5、およびTnf mRNAのRT-qPCR分析。 e、示されたsiRNAを30時間トランスフェクトし、その後EMCV RNA（0.4μg ml-1）またはRABVLe（1pmol ml-1）で6時間模擬刺激またはトランスフェクトしたNHLFのWCLにおけるIRF3リン酸化。抗 pSer396-IRF3 および抗 IRF3 を備えた IB。 f、示されたsiRNAを30時間トランスフェクトし、その後模擬刺激またはEMCV RNA（0.4μg ml-1）またはRABVLe（1pmol ml-1）でトランスフェクトした、またはSeVに感染させたNHLFの上清からのIFN-のELISA (10 HAU ml-1) 16 時間。 g、示されたshRNAレンチウイルス粒子で40時間形質導入され、その後、mutEMCV（MOI=10）またはSeV（200 HAU ml-1）で8時間感染させたPBMCの上清からのIFN-αのELISA。 h、gと同様に形質導入および感染したPBMCにおけるIFNA2およびIL-6 mRNAのRT-qPCR分析。 データは、同様の結果が得られた少なくとも2つの独立した実験を表しています（a〜dおよびfではn=3生物学的複製の平均±sd、gおよびhではn=2生物学的複製の平均）。 *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
次に、それぞれのリガンドによる内因性 MDA5 および RIG-I の活性化に対する ISG15 遺伝子欠失の影響をテストしました。 脳心筋炎ウイルス (EMCV) RNA または高分子量 (HMW)-ポリ(I:C) のトランスフェクションによって誘導される IFN 産生および IFNB1、CCL5、および TNF 遺伝子発現 (どちらも主に MDA5 によって感知されます)、 Isg15-/- MEF、ISG15 KO HeLa、およびISG15 KO HAP-1細胞では、それぞれの対照細胞と比較して大幅に減弱しました（図1c、dおよび拡張データ図1e〜g）。 重要なことに、ISG15 KO細胞におけるEMCV RNAまたはHMW-ポリ(I:C)による抗ウイルス遺伝子誘導の除去は、MDA5遺伝子発現の無効によるものではなかった。 逆に、MDA5 mRNA発現は、WT細胞と比較してISG15 KO細胞で増強されました（拡張データ図1f、g）。 MDA5 アゴニストによる刺激とは対照的に、RIG-I 刺激である狂犬病ウイルス リーダー RNA (RABVLe) トランスフェクションまたはセンダイ ウイルス (SeV) 感染による Isg15-/- MEF および ISG15 KO HeLa 細胞の刺激は、IFN-産生とWT細胞に匹敵する抗ウイルス遺伝子発現（図1c、dおよび拡張データ図1e）。 ISG15 遺伝子欠失細胞に関連する可能性のある潜在的なクローン効果を除外するために、初代正常ヒト肺線維芽細胞 (NHLF) で一過性遺伝子サイレンシング実験を実施しました。 ISG15 サイレンシングは、MDA5 ノックダウンと同様に、EMCV RNA による刺激後、RLR シグナル活性化の特徴である IFN 調節因子 3 (IRF3) のリン酸化をほぼ完全に喪失させましたが、RABV による刺激では IFN 産生を抑制しませんでした。 EMCV RNAでトランスフェクトされたNHLFでは抗ウイルス転写物が発現しましたが、RABVLeまたはSeVで刺激された細胞では発現されませんでした（図1fおよび拡張データ図1h）。 初代ヒト末梢血単核球（PBMC）におけるスモールヘアピン（sh）RNAを介したISG15またはMDA5のサイレンシングも、MDA5拮抗作用が欠損した組換え変異体EMCV（mutEMCV）感染後の抗ウイルスタンパク質と転写物の発現を大幅に減少させた18,19。非ターゲティングコントロールshRNAを形質導入した感染PBMC（図1g、hおよび拡張データ図1i）。 対照的に、ISG15またはMDA5の枯渇は、SeV感染後のPBMCのサイトカイン応答に影響を与えませんでした（図1g、hおよび拡張データ図1i）。 これらの結果は、ISG15 が MDA5 による免疫シグナル伝達に必須であるが、RIG-I では必須ではないことを示しています。 MDA5 カードは Lys23 と Lys43 で ISGylate されます。
男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点
MDA5-2CARD ISGylation を特定した MS 分析を裏付けるために、まず内因性 MDA5 も ISG15 によって修飾されるかどうかをテストしました。 内因性MDA5は、HMW-ポリ(I:C)でトランスフェクトされた細胞、またはMDA5によって感知されるデングウイルス(DENV)またはジカウイルス(ZIKV)に感染した細胞において強力にISG化された(参考文献5)(図2a)。 注目すべきことに、内在性MDA5は非感染細胞でも非常に低レベルではあるがISG化されており（拡張データ図2a）、これは多くの宿主タンパク質も通常（非感染）条件下では低レベルでISG化されるという以前の知見と一致している20。 IFNARシグナル伝達を介したISGアップレギュレーションをブロックするために抗IFNAR2で処理した細胞では、ISG15またはMDA5のサイレンシングにより、mutEMCV感染後にIFNB1遺伝子発現が同等に減少しました（拡張データ図2b）。これは、ISG15-に依存していることを示していますMDA5 シグナル伝達は、IFNAR シグナル伝達が存在しない場合でも発生します。
ｔ ＭＤＡ５Δ２ＣＡＲＤ（ヘリカーゼおよびＣＴＤを含む）は、ＩＳＧ化２ＣＡＲＤの２つの顕著なバンドを示すＭＤＡ５ ＩＳＧ化の主要部位である（図２ｂ）。 WT ISG15、または結合に必要な2つのグリシンがアラニンで置換された結合不可能なISG15変異体（ISG15-AA）21のいずれかを使用してISG15 KO HeLa細胞を再構成すると、共有結合によるISG15結合が実証されました（図2c）。 。 GST-MDA5-2CARDの個々のリジン残基のアルギニンへの変異により、Lys23およびLys43の単一部位変異はISG化を顕著に減少させたのに対し（拡張データ図2c）、それらの複合変異（Lys23Arg/Lys43Arg）はISG化をほぼ廃止したことが明らかになった（図2d） ）。 全長FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Argも、ISGylationの顕著な減少を示しました（図2eおよび拡張データ図2d）。 FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg に見られる残留 ISGylation は、おそらく 2CARD および/または Δ2CARD の追加のマイナー部位によるものと考えられます。 注目すべきことに、Lys23Arg / Lys43Arg変異はMDA5-2CARD SUMO化5に影響を与えませんでした（拡張データ図2e）。 さらに、RIG-I–2CARDは強力にユビキチン化されましたが（これは共有結合的なLys63-結合ユビキチン化を表します7）、MDA5–2CARD WTもLys23Arg / Lys43Arg変異体も検出可能なレベルのユビキチン化を示しませんでした（拡張データ図2f）。 まとめると、これらの結果は、MDA5 CARD が 2 つの主要な部位、Lys23 と Lys43 で ISGylation を受けることを示しています。
MDA5 のアクティベーションには CARD ISGylation が必要です。
それらのシグナル伝達能力を比較すると、MDA5-2CARD Lys23Arg および Lys43Arg 単一部位変異体は、WT MDA5-2CARD と比較して IFN プロモーター活性化の部分的な低下を示しましたが、Lys23Arg/Lys43Arg 変異体ではシグナル伝達活性が大幅に低下しており、その強度はほぼ同等でした。シグナル伝達欠損変異体Ser88GluおよびSer88Asp6の変異体と同様（拡張データ図2g）。 対照的に、Lys43およびLys23に最も近いリジン残基であるLys68がアルギニンで置換された変異体（Lys68Arg）は、WT 2CARDと同等のISG15結合およびシグナル伝達能力を示しました（拡張データ図2c、g）。 WT MDA5-2CARDとは対照的に、MDA5-2CARD Lys23Arg/Lys43Argも、IRF3二量体化を誘導できませんでした（拡張データ図2h）。 FLAG-MDA5 Lys23Arg、Lys43Arg、または Lys23Arg/Lys43Arg も、FLAG-MDA5 WT と比較して、IFN プロモーター活性化能力の低下またはほぼ消失を示しました（図 2f）。 MDA5 Lys23Arg/Lys43Argは、大量に発現した場合でも重大なシグナル伝達欠陥を示しましたが、WT MDA5は用量依存的に抗ウイルス転写物を誘導しました（図2g）。 一致して、IFNARシグナル伝達の特徴であるSTAT1リン酸化、およびISGタンパク質発現はMDA5 WTによって高度に誘導されましたが、Lys23Arg / Lys43Argでは誘導されませんでした（図2h）。 MDA5-遺伝子編集ヒト星状細胞（SVGA）をMDA5 Lys23Arg / Lys43ArgまたはSer88Gluで補完すると、WT MDA5を発現する細胞と比較してIFNB1、CCL5、およびISG転写物が大幅に減少しました（図2iおよび拡張データ図2i）。 。 これらの結果は、Lys23 および Lys43 での ISG 化が MDA{64}} 媒介サイトカイン応答に不可欠であることを示しています。
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PP1 による脱リン酸化は MDA5 の ISG 化を制御します。
RIG-I と同様に、MDA5 は非感染細胞の CARD 内でリン酸化され、自己活性化が妨げられます。 PP1/による RIG-I と MDA5 の脱リン酸化は、RLR をシグナル伝達抑制状態から解放するために重要です 6,22-24。 RIG-I の脱リン酸化により、CARD の Lys{10}} 結合ユビキチン化が可能になり、RIG-I の多量体化とシグナル伝達が促進されます 5。 CARD の脱リン酸化 (Ser88 で) がどのように MDA5 活性化を引き起こすかの詳細は依然として解明されていないため、脱リン酸化が MDA5 の ISG 化を制御するかどうかをテストしました。 PP1のサイレンシング/MDA5-2CARD ISGylationの大幅な減少（拡張データ図3a）。 さらに、リン酸化模倣型の Ser88Glu および Ser88Asp 変異体では ISG 化が減少しましたが、ホスホヌル Ser88Ala 変異体は WT MDA5-2CARD よりも強い ISG 化を示しました（拡張データ図 3b）。 逆に、MDA5 WT および Lys23Arg/Lys43Arg は同等の Ser88 リン酸化を示しました (拡張データ図 3c)。 これらのデータを総合すると、MDA5 の Ser88 脱リン酸化が CARD ISG 化に先行することが示唆されます。 次に、PP1 / 拮抗作用を介して MDA5 Ser88 脱リン酸化に拮抗する麻疹ウイルス V タンパク質 (MeV-V) を利用しました 25。 以前に示されているように、MeV-V の発現は、用量依存的に GST-MDA5-2CARD または FLAG-MDA5 の Ser88 リン酸化（脱リン酸化の除去を示す）を増強しました 25。 MeV-Vによるリン酸化の強化は、ISGylationの低下と相関していました（拡張データ図3d、e）。 WT MeV-V とは対照的に、PP1- 結合と MDA5- 脱リン酸化拮抗作用を廃止した変異型 MeV-V (MeV-VΔtail)25 は、MDA5-2CARD ISGylation に対してほとんど効果を示さなかった（拡張データ）図3f)、ISGylationの阻害の強化は、主にMeV-VによるPP1阻害によるものであり、他の拮抗作用によるものではありません。 ニパウイルスおよびヘンドラウイルスの V タンパク質（NiV-V および HeV-V）も、MDA5 Ser88 リン酸化を強化し、それに応じて MDA5 ISGylation を弱めました（拡張データ図 3g、h）。これは、いくつかのパラミクソウイルス V タンパク質が操作によって MDA5 ISGylation を阻害することを示唆しています。ただし、個々の V タンパク質の正確なメカニズムはまだ解明されていません。 総合すると、これらのデータは、MDA5 CARD ISGylation が Ser88 での脱リン酸化に依存していることを示唆しています。
ISGylation は高次の MDA5 アセンブリを促進します。
RLR の活性化には、RNA 結合、RLR オリゴマー化、および MAVS5 と相互作用するためにサイトゾルからミトコンドリアへのそれらの移動が必要です。 ISGylationがMDA5活性に影響を与えるメカニズムを解明するために、我々はまずISGylationがRNA結合に影響を与えるかどうかを調べました。 WTまたはIsg15-/- MEFから精製された内在性MDA5は、インビトロでHMW-ポリ(I:C)と同等に良好に相互作用した(拡張データ図4a)。 MDA5 WTおよびLys23Arg/Lys43Argは、HMW-ポリ(I:C)に対して同等の結合を示し、ISG化がMDA5のRNA結合能力に影響を及ぼさないことを示した(拡張データ図4b)。 EMCV RNA刺激後のサイトゾルからミトコンドリアへのMDA5の転座をモニタリングしたところ、ISG15サイレンシングではMDA5転座が廃止されるが、so.Cトランスフェクションでは廃止されないことがわかりました（図3a）。 対照的に、RABVLe トランスフェクション後の RIG-I 転座は、ISG15- 枯渇と si の両方で効率的でした。 C でトランスフェクトされた細胞 (図 3b)。 これらのデータは、ISGylationがMDA5の転座またはその上流のステップを調節していることを示した。 MDA5 のサイトゾルからミトコンドリアへの転座には 14-3-3η26 との相互作用が必要であるため、WT と変異体 MDA5 の 14-3-3η 結合を比較しました。 MDA5 Lys23Arg/Lys43Argの14-3-3ηに結合する能力は、WT MDA5またはLys68Arg変異体の能力と同様でした（拡張データ図4c）。 ただし、EMCV RNA刺激はWT MEFではMDA5オリゴマー化を効果的に誘導しましたが、ISG15-欠損MEFではMDA5オリゴマーの形成が消失しました（図3c）。 293T細胞におけるISG15ノックダウンにより、FLAG-MDA5-2CARDのオリゴマー化も消失しました（図3d）。 逆に、ISGylation機構コンポーネントであるUbe1LとUbcH8の共発現は、siにおけるMDA5-2CARDのオリゴマー化を強く増強した。 C トランスフェクト細胞ではあるが、ISG15- 枯渇細胞ではそうではなく (図 3d)、ISG 化が MDA5 オリゴマー形成に必要であることを示しています。 この概念を裏付けるように、FLAG-MDA5 Lys23Arg / Lys43Argはほぼ廃止されたオリゴマー化を示しましたが、WT MDA5は効率的にオリゴマー化しました（図3e）。 また、Lys23 Arg/Lys43Arg 変異の影響を、MDA5 モノマー間の界面に局在し、RNA 結合媒介 MDA5 フィラメント形成を妨げるオリゴマー化破壊変異 (Ile841Arg/Glu842Arg および Asp848Ala/Phe849Ala) の影響と比較しました。または CARD (Gly74Ala/Trp75Ala) に作用して 2CARD のオリゴマー化を妨害します27。 WT MDA5とは異なり、Lys23Arg/Lys43Arg変異体は、MDA5 Gly74Ala/Trp75Alaと同様に、オリゴマー化不足を示し、これと一致して、IFNプロモーター活性化能力を消失させた（図3f、g）。 Ile841Arg/Glu842ArgまたはAsp848Ala/Phe849AlaバックグラウンドへのLys23Arg/Lys43Argの導入は、いずれも単独でMDA5オリゴマー化とシグナル伝達を減少させ、MDA5オリゴマー形成とIFN誘導も廃止した（図3f、g）。 LGP2 は二本鎖 RNA 上での MDA5 の核形成を促進し、それによって MDA5 のオリゴマー化を促進する 29,30 ため、MDA5 WT と Lys23Arg/Lys43Arg の LGP2 結合を比較しました。 MDA5 Lys23Arg / Lys43Argは、WT MDA5と同じくらい効率的にLGP2と相互作用し（拡張データ図4d）、CARD ISGylationがRNA結合媒介フィラメント化とは独立してMDA5のオリゴマー化を促進するという提案を強化します。 まとめると、これらの結果は、ISGylation が CARD オリゴマー化と高次 MDA5 集合を促進することを証明します。
図2|MDA5 の活性化には、Lys23 および Lys43 での ISGylation が必要です。 疑似処理、HMW-ポリ(I:C) (0.1 μg ml-1 ) で 40 時間トランスフェクト (左)、または DENV または ZIKV で感染 (MOI {{ 48 時間 (右)、抗 MDA5 (または IgG アイソタイプ コントロール) を用いた IP および抗 ISG15 を用いた IB によって測定。 b、V5-ISG15、HA-Ube1L、およびFLAG-UbcH8も発現する一過性にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるFLAGタグ付きMDA5-2CARDおよびMDA5Δ2CARDのISG化。トランスフェクション後40時間で抗V5を用いたFLAG PDおよびIBによって評価。 c、ベクター、WT ISG15またはISG15-AAで安定に再構成され、IFN-処理後にHA-Ube1LおよびFLAG-UbcH8で共トランスフェクトされたISG15 KO HeLa細胞における内因性MDA5 ISG化（1、000 U） ml−1）を24時間、抗MDA5を用いたIPおよび抗ISG15を用いたIBによって決定した。 d、V5-ISG15、HA-Ube1L、およびFLAG-UbcH8を24時間同時トランスフェクトしたHEK293T細胞におけるGST-MDA5-2CARD WTおよびLys23Arg/ Lys43ArgのISG化。抗V5を用いたGST PDおよびIBによって決定。 e、V5-ISG15、HA-Ube1L、およびFLAG-UbcH8を同時トランスフェクトしたHEK293T細胞におけるFLAG-MDA5 WTおよびLys23Arg/Lys43ArgのISG化。抗V5を用いたFLAG PDおよびIBによって決定。 f、ベクター、FLAG-MDA5 WT または変異体を 40 時間トランスフェクトした HEK293T 細胞における IFN-ルシフェラーゼ レポーター活性。 ルシフェラーゼ値は、ベクタートランスフェクト細胞の値を 1 に設定した場合の誘導倍数として表示されます。WCL は、抗 FLAG および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 g、ベクターまたは漸増量のFLAG-MDA5 WTまたはLys23Arg / Lys43Argのいずれかを一過的にトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるIFNB1およびCCL5 mRNAのRT-qPCR分析。 h、ベクター、FLAG-MDA5 WT、またはLys23Arg / Lys43Argを一時的にトランスフェクトしたHEK293T細胞のWCLにおけるSTAT1リン酸化およびISG（IFIT1および-2）タンパク質の存在量。IBによって決定されました。 I、空のベクターまたはFLAGタグ付きMDA5 WT、Lys23Arg/Lys43Arg、またはSer88Gluのいずれかを使用して一時的に再構成されたMDA5 KO SVGA内の示された抗ウイルス遺伝子のRT-qPCR分析。 データは、同様の結果をもたらした少なくとも 2 つの独立した実験を表しています (f、g、i における n= 3 の生物学的複製の平均 ± SD)。 *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
図3|CARD ISGylation は、高次 MDA5 アセンブリの形成を促進します。 a、b、非ターゲティングコントロールsiRNA（si.C）またはISG15-特異的siRNA（si.ISG15）で30時間トランスフェクトされたNHLFからのWCLのサイトゾル-ミトコンドリア分画、および次に、EMCV RNA (0.4 μg ml-1 ) (a) または RABVLe (1 pmol ml-1 ) (b) で 16 時間疑似処理またはトランスフェクトしました。 IB は、抗 MDA5 (a)、抗 RIG-I (b)、抗 ISG15、および抗アクチン (a および b) を使用して実行されました。 - チューブリンと MAVS は、それぞれサイトゾルとミトコンドリア画分の純度マーカーとして機能しました (a と b)。 c、EMCV RNA（0.5μg ml-1）で16時間トランスフェクトし、抗MDA5を用いたSDD-AGEおよびIBによって評価したWTおよびIsg15-/- MEFにおける内因性MDA5オリゴマー化。 WCL は SDS-PAGE によってさらに分析され、抗 MDA5 および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 d、HA-Ube1LおよびFLAG-UbcH8の有無にかかわらず、表示されたsiRNAをトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるFLAG-MDA5-2CARDのオリゴマー化。抗FLAGを使用したNativePAGEおよびIBによって決定されました。 WCL は SDS-PAGE によってさらに分析され、抗 FLAG、抗 HA、抗 ISG15、および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 e、一時的にトランスフェクトされたMDA5 KO HEK293細胞におけるFLAG-MDA5 WTおよびLys23Arg/Lys43Argのオリゴマー化。SDD-AGEおよび抗FLAGを用いたIBによって評価。 WCL は、抗 FLAG および抗アクチンを使用した SDS-PAGE および IB によってさらに分析されました。 f、一過性にトランスフェクトされたMDA5 KO HEK293細胞におけるFLAGタグ付きMDA5 WTおよび変異体のオリゴマー化。NativePAGEおよび抗MDA5を用いたIBによって評価。 WCL は SDS-PAGE によってさらに分析され、抗 MDA5 および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 g、空のベクター、またはFLAGタグ付きMDA5 WTまたは変異体のいずれかを24時間トランスフェクトしたMDA5 KO HEK293細胞におけるIFN-ルシフェラーゼレポーター活性。 ルシフェラーゼ活性は、ベクターでトランスフェクトされた細胞の値を 1 に設定した場合の誘導倍数として表されます。データは、同様の結果が得られた少なくとも 2 回の独立した実験を表しています (n= 3 個の生物学的複製の平均 ± 標準偏差 (g))。 ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
ISGylation 依存性の MDA5 シグナル伝達はウイルスの複製を制限します。
次に、MDA5 のウイルス複製を制限する能力に MDA5 の ISGylation が必要かどうかを評価しました。 FLAG-MDA5 WTは、EMCV複製を強力に（約2log）阻害しましたが、Lys23Arg / Lys43Argは阻害しませんでした（図4a）。 同様に、MDA5 KO HEK293細胞はWT MDA5で再構成されましたが、Lys23Arg/Lys43Arg変異体で補完された細胞はDENV複製を効果的に制限しませんでした（図4b）。 また、ZIKV感染に生理学的に関連する細胞型であるMDA5 KOアストロサイトSVGAをベクター、MDA5 WTまたはLys23Arg/Lys43Argのいずれかを用いて再構成し、40-時間の経過にわたってZIKV複製を評価した。 ZIKVの複製は、ベクター発現細胞と比較して、WT MDA5で再構成された細胞では〜100-倍減弱されました。 対照的に、MDA5 Lys23Arg/Lys43Argで補完された細胞は、MDA5 Ser88Gluを発現する細胞と同様に、ZIKVを制限しなかった（図4c）。 Lys23Arg/Lys43ArgではなくWT MDA5もSCoV2複製を制限したが、その程度は試験した他のウイルスで見られたものよりも小さかった(図4d)。
図4|MDA5 によるウイルス制限には ISGylation が必要です。 ベクター、FLAG-MDA5 WT または Lys23Arg/Lys43Arg のいずれかを 40 時間トランスフェクトし、その後 EMCV (MOI=0.001) を 24 分間感染させた HEK293T 細胞の上清中の EMCV 力価h、TCID50 アッセイによって決定。 b、ベクター、FLAG-MDA5 WTまたはLys23Arg/Lys43Argのいずれかを24時間トランスフェクトし、その後DENV（MOI=5）で48時間模擬処理または感染させたDENV感染MDA5 KO HEK293細胞の割合、抗フラビウイルス E (4G2) を使用した FACS によって評価されました。 SSC、側方散乱。 c、ベクターまたはFLAGタグ付きMDA5 WT、Lys23Arg/Lys43Arg、またはSer88Gluを30時間トランスフェクトし、その後示された時間ZIKV（MOI=0.1）を感染させたMDA5 KO SVGAの上清中のZIKV力価、プラークアッセイによって決定されます。 pfu、プラーク形成単位。 hpi、感染後数時間。 d、空のベクター、FLAG-MDA5 WTまたはLys23Arg/Lys43Argのいずれかを24時間トランスフェクトし、その後SCoV2（MOI=0.5）を24分間感染させたHEK293T-hACE2細胞の上清におけるSCoV2力価。 h、プラークアッセイによって決定。 e、MDA媒介IFN誘導におけるISG15の役割をIFNARシグナル伝達の減衰における役割から「切り離す」実験的アプローチの概略図。{46}} 上清。 f、NHLF「ドナー」細胞を、示されたsiRNAで40時間トランスフェクトし、その後、mutEMCV (MOI=0.1)で16時間感染させた。 細胞上清を UV 不活化し、Vero「レシピエント」細胞に移しました。 24 時間後、細胞を ZIKV (MOI=0.002-2) で 72 時間感染させ、抗フラビウイルス E (4G2) および TrueBlue ペルオキシダーゼ基質を用いた免疫染色によって ZIKV 陽性細胞を判定しました。 g、RIG-I KO HEK293「ドナー」細胞をsiでトランスフェクトした。 C または si.ISG15 をベクター、FLAG-MDA5 WT または Lys23Arg/Lys43Arg とともに 24 時間感染させた後、EMCV 感染 (MOI=0.001) を 16 時間行いました。 UV不活化した細胞上清をVero「レシピエント」細胞に24時間移し、続いてEMCV（MOI=0.001-0.1）を40時間感染させました。 EMCV 誘発細胞変性効果は、クーマシー ブルー染色によって視覚化されました。 データは、同様の結果が得られた少なくとも2つの独立した実験を表しています（a〜dのn=3生物学的複製の平均±標準偏差）。 *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
次に、ウイルス複製を阻害する MDA5 の能力に対する ISG15 サイレンシングの影響を調べました。 MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg は ISG15 サイレンシングに関係なく EMCV 複製を抑制できませんでしたが、WT MDA5 は si における EMCV 複製を効果的に制限しました。 Cトランスフェクト細胞、そして予想外にもISG15-枯渇細胞にも存在する(拡張データ図5a)。 これらの予期せぬ結果の根底にあるメカニズムを調査したところ、WT MDA5を発現するEMCV感染細胞は、ISG15をサイレンシングすると、WT MDA5およびsiをトランスフェクトした感染細胞と比較して、ISGタンパク質の発現レベルが著しく向上することが判明した。 C (拡張データ、図 5b)。 同様に、IFN誘導の無効にもかかわらず、EMCV RNAでトランスフェクトされた、またはmutEMCVに感染したISG15-欠損細胞では、ISG転写物およびタンパク質発現の上昇が観察されました（拡張データ図5c、d）。 対照的に、MDA5 ノックダウンは、予想どおり、IFN タンパク質発現と ISG タンパク質発現の両方を無効にしました (拡張データ図 5d)。 私たちは、IFNAR シグナル伝達を負に制御する脱ユビキチン化酵素である USP18 のタンパク質存在量 31 が、EMCV 感染後の ISG 枯渇細胞では、si でトランスフェクトされた感染細胞と比較して大幅に減少していることに気づきました。 C または MDA5- 特異的 siRNA (拡張データ図 5b、d)。これは、USP18 分解の防止における ISG15 の報告された役割と一致しています 32。 まとめると、これらのデータは、ISG15-遺伝子ターゲティング（つまり、サイレンシングまたはKO）の実験設定において、MDA5 ISG化の抗ウイルス効果が、IFNARシグナル伝達に対するISG15の阻害効果の除去による異常なISG上方制御によって隠蔽されていることを示唆している。
図5|SCoV2 PLpro は MDA5-2CARD に結合し、脱 ISGylates します。 SCoV2 PLpro: ISG15 複合体の結晶構造のリボン表示 (Protein Data Bank、アクセッション番号 6YVA)。 PLpro のサイト 1 相互作用 (Asn156 および Arg166/Glu167) またはサイト 2 相互作用 (Phe69) を媒介する重要な残基、およびその触媒活性部位 (Cys111) が示されています。 b、FLAG-ISG15、HA-Ube1L、およびFLAG-UbcH8とともに、ベクターまたはV5-タグ付きSCoV2 PLpro WTまたは変異体を20時間共トランスフェクトしたHEK293T細胞におけるGST-MDA5-2CARDのISG化、抗FLAGおよび抗GSTによるGST PDおよびIBによって決定されます。 WCL は、抗 V5、抗 HA、抗 FLAG、および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 c、一過性にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるV5-タグ付きSCoV2-PLproまたはFLAGタグ付きMeV-V（陽性対照）へのHAタグ付きMDA5またはRIG-Iの結合（抗V5を用いたHA PDおよびIBによって測定）または抗FLAGおよび抗HA。 WCL は、抗 V5 および抗 FLAG を使用した IB によってプローブされました。 d、ベクター、またはV5-タグ付きSCoV2 PLpro WTまたはCys111Alaで24時間同時トランスフェクトされたHEK293T細胞におけるFLAG-MDA5-2CARDのオリゴマー化。抗FLAGを使用したNativePAGEおよびIBによって評価されました。 WCL は SDS-PAGE によってさらに分析され、抗 FLAG、抗 V5、および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 e、FLAG-ISG15、HA-Ube1L、およびFLAG-UbcH8も発現し、ベクターまたは示されたV5-タグ付きコロナウイルスPLproで40時間同時トランスフェクトされたHEK293T細胞におけるGST-MDA5-2CARDのISG化タンパク質は、抗FLAG、抗V5、および抗GSTを使用したGST PDおよびIBによって決定されます。 データは、同様の結果をもたらした少なくとも 2 つの独立した実験を表しています。
次に、ウイルス感染細胞のMDA5シグナル伝達を同じ細胞の下流のIFNARシグナル伝達から実験的に切り離すウイルス防御アッセイを採用しました（図4e）。 mutEMCV に感染した「ドナー」細胞からの上清。 ISG15 または MDA5 をトランスフェクト、または枯渇させた C 細胞を紫外線 (UV) で不活化し、未感染の「レシピエント」細胞に移しました。 次に、「初回刺激」レシピエント細胞を ZIKV に感染させ、ドナー細胞による MDA5- 媒介 IFN 産生の抗ウイルス効果を直接モニタリングしました。 一方、siからの上清。 Cトランスフェクトされた「ドナー」細胞はZIKV複製を強力に阻害し、ISG15またはMDA5ノックダウン細胞からの上清はZIKV感染を最小限に制限しました（図4f）。 同様に、EMCV感染ドナー細胞からの培養上清をsiとともにWT MDA5でトランスフェクトした。 Cは、WT MDA5を発現しISG15を枯渇させた細胞よりも、ウイルス攻撃からレシピエント細胞をより強力に保護することにつながりました（図4g）。 総合すると、これらのデータは、ISGylation が MDA を介したさまざまな RNA ウイルスの制限にとって重要であることを示しています。5-
図6|SCoV2 PLpro は、その脱 ISGylase 活性を介して ISG15- 媒介 MDA5 シグナル伝達を阻害します。 a、示されたsiRNAで40時間トランスフェクトされ、その後モックRNAまたはSCoV2 RNA（0.4μg ml −1) 24 時間。 b, SCoV2 (MOI=0.5) を 24 時間感染させた A549-hACE2 細胞における内因性 MDA5 への SCoV2 Nsp3 の結合。抗 MDA5 (または IgG アイソタイプ コントロール) を用いた IP とそれに続く IB によって測定抗Nsp3および抗MDA5を含む。 WCL は、抗 Nsp3 および抗アクチンを使用した IB によってプローブされました。 c、PLpro阻害剤（GRL-0617; 50μM）またはビヒクルの存在下で模擬感染またはSCoV2（MOI=0.5）で40時間感染させたA549-hACE2細胞における内因性MDA5 ISG化コントロール（ジメチルスルホキシド）。抗 MDA5（または IgG アイソタイプ コントロール）を用いた IP、続いて抗 ISG15 および抗 MDA5 を用いた IB によって決定されます。 WCL における IFIT1、RSAD2、ISG15、およびアクチンのタンパク質量を IB によって調べました。 効率的なウイルス複製は、抗 Nsp3 および抗 Spike (S) を使用した IB によって検証されました。 d、ベクター、V5-SCoV2 PLpro WT または変異体で 24 時間一過的にトランスフェクトされ、その後 mutEMCV に感染された HeLa 細胞における IFNB1、CCL5、および IFIT1 転写物、および EMCV ゲノム RNA (gRNA) の RT-qPCR 分析(MOI=0.5)、12 時間。 e、V5-タグ付きSCoV2 PLpro WT、Cys111AlaまたはArg166Ser / Glu167ArgとともにベクターまたはFLAG-MDA5を24時間一時的にトランスフェクトし、その後感染させたRIG-I KO HEK293細胞の上清中のEMCV力価EMCV (MOI=0.001) で 16 時間、プラークアッセイで測定。 f、eの実験からのWCLにおける示されたISGのタンパク質存在量。示された抗体を用いたIBによって決定された。 データは、同様の結果をもたらした少なくとも 2 つの独立した実験を表しています (a、d、および e の n= 3 生物学的複製の平均 ± sd)。 *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro は、脱 ISGylation のために MDA5 をターゲットとしています。
SARS-CoV (SCoV)、MERS-CoV、最近出現した SCoV2 などのコロナウイルスは、ウイルスのポリタンパク質の切断を媒介する PLpro をコードしています 33。 さらに、PLpro には脱ユビキチン化および脱 ISG 化活性があります。 SCoV2 PLpro は、主にその脱 ISGylase 活性を介して抗ウイルス応答を調節することが最近示されました 15。 MDA5 はコロナウイルスを検出するための主要なセンサーであることが知られており 34,35、また MDA を介したウイルス制限には ISGylation が必要であることがデータで示されたため、SCoV2 PLpro が MDA5 ISGylation を酵素的に除去して自然免疫に拮抗するかどうかを調べました。{10} SCoV2 PLpro WT は、その触媒不活性変異体（PLpro Cys111Ala）15ではなく、GST-MDA5-2CARDおよびFLAG-MDA5のISG化を廃止しました（図5a、bおよび拡張データ図6a）。 PLpro Asn156Glu および Arg166Ser/Glu167Arg 変異体は、それぞれ「サイト 1」界面での ISG15 結合がわずかにかつ重度に損なわれています 14,36 が、ISGylation にわずかに、あるいはまったく影響を及ぼしませんでした。 対照的に、ISG15ではなくユビキチンへの結合を優先的に決定する「サイト2」インターフェースが破壊されているPLpro Phe69Alaは14,36、WT PLproと同じくらい強力にMDA5のISG化を減少させました（図5a、bおよび拡張データ図6a） ）。 しかし、SCoV2 PLproはRIG-I-2CARDのユビキチン化を抑制しませんでした（拡張データ図6b）。 MDA5に結合しコントロールとして機能するMeV-Vとは異なり、PLproはMDA5と特異的に相互作用するが、RIG-Iとは相互作用しないことが判明した37（図5c）。 低量のPLproはMDA5によるシグナル伝達を阻害しましたが、RIG-Iは阻害しませんでしたが、より多量のPLproは両方のRLRによる抗ウイルスシグナル伝達を抑制しました（拡張データ図6c）。 これにより、MDA5 が PLpro の直接のターゲットであることが強化されます。 おそらく、IRF3 の脱 ISG 化は、高用量の PLpro が RLR シグナル伝達に及ぼす阻害効果の原因であると考えられます 15,38。 MDA5-2CARDオリゴマー化に対するPLproの影響を調べると、PLpro WTはMDA5-2CARDオリゴマー化を効率的にブロックしましたが、Cys111Alaはブロックしませんでした（図5d）。これは、SCoV2 PLproがその酵素活性を介してISG化依存性のMDA5オリゴマー形成を阻害することを示しています。 関連するコロナウイルス、SCoV、MERS-CoV、およびマウス肝炎ウイルス（MHV）、ならびにコロナウイルスHCoV-NL63（NL63）のPLpro酵素もMDA5-2CARD ISGylationに結合し、効率的に減少しました（図5e）。 、PLproによるMDA5拮抗作用がコロナウイルス間で広く保存されている可能性があることを示唆しています。
カンサス植物の免疫システムを高める
SCoV2 PLpro は、ISG15- に依存する MDA5 シグナル伝達に拮抗します。
次に、SCoV2 によって誘発される抗ウイルス サイトカイン誘導に対する ISG 依存性 MDA5 シグナル伝達の関連性を調べました。{0} SCoV2 感染は、効果的なウイルス拮抗作用により I 型 IFN の誘導を最小限に抑えることが知られているため 39、我々は SCoV2- 感染細胞から全 RNA を単離し、それを細胞に再トランスフェクトして自然免疫シグナル伝達を刺激しました。 SCoV2 RNA は、IFN 転写物を強力に誘導しましたが、モック処理した細胞からの RNA は誘導しませんでした。 しかし、この誘導は、ISG15またはMDA5がサイレンシングされると著しく減少した（図6a）。 RIG-Iノックダウンは、SCoV2 RNAによって誘発される抗ウイルス遺伝子発現に悪影響を及ぼさず、SCoV2 RNA-PAMPが主にISG15-MDA5軸によって感知されることを示しています（図6a）。
我々は、PLproが存在するSCoV2非構造タンパク質3（Nsp3）が、真のSCoV2感染中に内在性MDA5と容易に相互作用することを発見した（図6b）。 ウイルスが ISG15 発現を誘発したにもかかわらず、内因性 MDA5 ISG 化は SCoV2- 感染細胞では検出されませんでした。 しかし、特定のPLpro阻害剤15で処理した感染細胞では、MDA5 ISG化と下流のISG誘導が強く増強され（図6c）、PLproが生SCoV2感染中のMDA5 ISG化とシグナル伝達を効果的に抑制するという提案を裏付けています。 次に、mutEMCV 感染時の内因性 MDA5 の活性化に対する WT および変異体 PLpro の影響を調べました。 MDA5 ISGylationに対するそれらの効果（図5bおよび拡張データ図6a）と一致して、SCoV2 PLpro WTおよびPhe69Alaは抗ウイルス転写物の誘導を妨げましたが、MDA5 Arg166Ser / Glu167Argは、Cys111Ala変異体と同様に、抗ウイルス遺伝子発現に影響を与えませんでした（図5bおよび拡張データ図6a）。 6d）。 これと一致して、mutEMCV複製はPLpro WTまたはPhe69Alaを発現する細胞では増強されましたが、PLpro Cys111AlaまたはArg166Ser/Glu167Argを発現する細胞では増強されませんでした（図6d）。 同様に、WT PLproはFLAG-MDA5によるEMCV制限をブロックしましたが、Arg166Ser / Glu167ArgまたはCys111Ala変異体はブロックしませんでした（図6e）。 ウイルス複製に対する効果は、誘導されたISGタンパク質と相関していました（図6f）。 総合すると、これにより、SCoV2 PLpro が MDA5 を積極的に脱 ISG 化する IFN アンタゴニストとして確立されます。
議論
ISG15 結合は、多数のウイルスに抗ウイルス活性を与えることが知られています。 ただし、本物の基板は少数しか確認されていません12。 一方、非結合型の ISG15 は、USP18- 媒介の IFNAR シグナル阻害を強化することでプロウイルス的に作用します 31,32,40。 本研究は、MDA を介した IFN 誘導における ISGylation の重要な役割を特定しています。{8} 私たちの研究では、ISG15の強力な抗ウイルス活性を明らかにするには、MDA5活性化におけるISG15の役割とIFNARシグナル伝達の減衰における役割を切り離すことが不可欠であるという実験計画の重要性も強調している。 感染した生物では、感染と病因の結果を決定するのはおそらく複数の ISGylation イベント (宿主とウイルスの両方のタンパク質に影響を与える) の合計であり、状況に依存する可能性があります 12。
カンクサの利点-免疫システムを強化する
私たちの発見は、MDA5 の ISG 化が RIG-I5 の Lys63- 結合ユビキチン化と同様に作用することを示しています。両方の PTM が (1) PP1- 誘導性脱リン酸化によって調節され、(2) CARD オリゴマー化と RLR の上昇を促進します。 -アセンブリを注文します。 ただし、ユビキチンは非感染細胞と感染細胞の両方に豊富にありますが、ISG15 の発現は IFN 刺激によって強く増加します。 それにもかかわらず、基礎レベルであっても、ISG15 は、我々の研究が示したように MDA5 を含む多くの宿主タンパク質 20 に結合しており、これは最初の MDA5 活性化には十分である可能性があります。 複数の PRR によって感知されるウイルス感染中、MDA5 の ISG 化は「プライミング」機構である可能性があり、即時生得センサー (RIG-I など) 41 による ISG15 の上方制御により、MDA5 が「キックスタート」モードに入るようにプライミングされます。 ISG15はRIG-I16、17を負に制御するため、ISGylationは「センサースイッチング」を引き起こす可能性があり、ISG15レベルが上昇するとRIG-I活性が低下する一方でMDA5活性化が促進されます。 われわれは、SCoV2 PLproがセンサーに結合した後、その酵素活性を介してMDA5のISG化に拮抗することを確認した。 この戦略はおそらくコロナウイルスの間で保存されており、さらなる調査が必要です。 クライオ電子顕微鏡分析により、コロナウイルスのNsp3は、小胞体由来の二重膜小胞にまたがり、新たに合成されたウイルスRNAを輸送する細孔複合体の一部であることが明らかになった42。 したがって、MDA5 は、PAMP の検出を容易にするために、ウイルス RNA の輸出部位に近接して位置している可能性があります。 しかし、Nsp3 の PLpro ドメイン (細胞質側にある) は、直接的な脱 ISG 化を通じて MDA5 シグナル伝達をブロックします。 MeV-V で示されているように、一部のウイルスは、MDA5 リン酸化の調節不全を通じて MDA5 の ISG 化を阻害する可能性もあります。 要約すると、私たちの研究は、MDA 媒介免疫の活性化および SCoV2 によるその阻害における ISGylation の顕著な役割を明らかにし、新型コロナウイルスに対する治療薬設計のための潜在的な分子標的を明らかにしました5-。
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