Ishige Okamurae から分離されたイソフロログルシン A は、-MSH によって誘導されるメラニン形成を抑制します: in vitro および in vivo パート 1
Apr 03, 2023
概要：石毛岡村 (IO) から分離されたジフロレトヒドロキシカルマロール (DPHC) は、UV-B 放射に対して潜在的な美白効果を示しました。 しかし、IO の成分と、β-メラノサイト刺激ホルモン (-MSH) に対する分子メカニズムはまだ調査されていません。 したがって、この研究の目的は、イソフロログルシン A (IPA)、褐藻類 IO から分離されたフロロタンニン、およびその粗抽出物 (IOE) の、-MSH 誘発ゼブラフィッシュ モデルおよび B16F10 メラノーマ細胞における in vivo でのメラニン形成における阻害効果を調査することでした。試験管内で。 フロロタンニンの分子ドッキング研究は、それらの阻害効果を決定し、メラニン形成に関連する糖タンパク質であるチロシナーゼとの相互作用モードを解明するために実施されました。 さらに、形態学的変化とメラニン含有量は、IPA および IOE 処理後の MSH 誘発ゼブラフィッシュ モデルで減少しました。 さらに、ウェスタンブロット法により、IPA が -MSH 刺激 B16F10 細胞における細胞外関連タンパク質の発現をアップレギュレートすることが明らかになりました。 したがって、これらの結果は、IOE から分離された IPA が製薬および化粧品業界で使用される可能性があることを示唆しています。
関連する研究によると、シスタンシェ「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分はシスタノシドなど、さまざまな効果があります。酸化防止剤、抗炎症、免疫機能の促進。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。メラニン人間の皮膚では、チロシナーゼによって触媒されるチロシンの酸化によって生成されます。 酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルがメラニン生成に影響を与える重要な要因になります。 シスタンケには、抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制。
1.はじめに
海藻は、フロロタンニン、フコイダン、多糖類、タンパク質などの生理活性化合物を利用しているため、機能性食品、化粧品、製薬業界から大きな注目を集めています [1–7]。 以前の研究によると、Ishige Okamurae (IO) は、チロシナーゼ活性に対する阻害効果についてスクリーニングされました [8]。 そのフロロタンニンであるジフロレトヒドロキシカルマロール (DPHC) は、in vitro モデルで UV-B 照射によって誘導される抗メラニン形成活性について評価されましたが [8]、DPHC とメラニン形成関連タンパク質との間の相互作用を説明するためのさらなる研究は行われませんでした。 この研究では、新規ポリフェノール化合物であるイソフロログルシン A (IPA) [9] のチロシナーゼとの相互作用を分子ドッキング研究で評価し、DPHC と比較しました。
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分子ドッキングは、タンパク質の活性部位または既知の三次元構造の受容体内の低分子またはリガンドの潜在的な結合モードを予測するための効率的な計算方法であり、それらの相互作用パターンの研究または薬物設計のために使用されます [10–12]。 以前の研究では、分子ドッキング研究によって調査されたチロシナーゼ酵素の相互作用部位とエネルギー値が報告されています [13,14]。 機能的には、チロシナーゼは、シグナル伝達経路で比較的遅い反応速度を触媒する律速酵素であり、メラノサイト細胞によって特異的に合成されるメラノソームと呼ばれる特殊なオルガネラにおけるメラニン生合成において極めて重要な役割を果たします [15]。 したがって、インシリコ分子ドッキング シミュレーションを通じてモデル化されたチロシナーゼの酵素活性は、皮膚の色素沈着過剰障害を予防する阻害剤を調査するための標的となっています。 これに基づいて、実験および計算分野では、金属キレート能を有する多くのフェノール化合物または阻害剤が、チロシナーゼ阻害剤として広く研究されてきました[16]。
メラニンは主に皮膚の色を調節し、皮膚が紫外線にさらされると保護色素として機能します [17]。 紫外線にさらされると、皮膚のケラチノサイトとメラノサイトからメラノサイト刺激ホルモン (-MSH) が放出され、メラニン合成が誘導され、その後、太陽放射の損傷効果から皮膚が保護されます [18]。 しかし、紫外線に長時間さらされると、-MSH による著しいメラニン合成が誘発され、そばかす、黒点、表皮の黒い斑点などの皮膚損傷が生じ、DNA 光損傷や皮膚がんにつながる[19]。 これに続いて、メラノサイトへの-MSHの投与は、メラノーマにおけるメラニン形成のためのチロシナーゼ活性にかなりの変化を誘発することが広く研究されている[20]。
ゼブラフィッシュは、人間と同じように肌の色のバリエーションを示します。 それらは、人間の肌の色の遺伝的起源を理解するために使用される動物モデルであり、基本的なモデル生物の生物学を人間の遺伝学と結び付けます [21]。 さらに、ゼブラフィッシュ原腸胚の腹側および外側領域の色素と幼生期の透明性により、色素沈着プロセスの簡単な観察が可能になり、メラノサイトの発達の欠陥に起因する皮膚細胞障害を理解するための実行可能なモデルを開発する機会が提供されます [22– 24]。
メラニン合成は、チロシナーゼ、小眼球関連転写因子（MITF）、チロシナーゼ関連タンパク質-1（Trp-2）、およびチロシナーゼ関連タンパク質などのいくつかのメラニン形成関連タンパク質の活性を介して起こる. {6}} (Trp-1) [15]。 この研究では、皮膚の色素沈着および黒色腫の治療におけるそれらの潜在的な使用を評価するために、 in vivo での -MSH 誘発ゼブラフィッシュおよび in vitro での B16F10 黒色腫細胞に対するチロシナーゼ活性およびメラニン形成における IPA および IO 粗抽出物 (IOE) の阻害効果を調査することを目的としました。 .
2. 結果
2.1. 分子ドッキング研究
市販のチロシナーゼ酵素と IPA、DPHC、およびアルブチンとの結合をシミュレートするために、ドッキング法が実行されました [25]。 IPA、DPHC、またはアルブチンとマッシュルーム チロシナーゼとの結合モードを図 1A ～ C に示します。 チロシナーゼ-IPA 複合体 (図 1A)、チロシナーゼ-DPHC (図 1B)、およびチロシナーゼ-アルブチン (図 1C) の 3D 図に示されているように、IPA、DPHC、およびアルブチンは活性部位であるチロシナーゼ- ＩＰＡ複合体は、最大の結合表面積を示した。 さらに、2D ダイアグラムに示すように、チロシナーゼ-IPA 複合体は、チロシナーゼ-DPHC またはチロシナーゼ-アルブチンと比較して、チロシナーゼのさまざまなアミノ酸とより多くの相互作用を示しました。 7 つのベンゼン環 (1 番目、2 番目、3 番目、8 番目、9 番目、12 番目、および 16 番目) とそれらの酸素原子は、ヒスチジン 60、メチオニン 61、リジン 157、グルタミン酸 158、プロリン 160、プロリン 201、アルギニン 206、およびバリン 218 と π–π 相互作用を持っています。 . 特に、16 番目のベンゼン環は、活性部位の主要なアミノ酸であるヒスチジン 60 およびヒスチジン 204 と結合していました。 さらに、IPA の多くの酸素原子は、グルタミン酸 158、プロリン 160、アスパラギン酸 167、メチオニン 184、フェニルアラニン 197、アスパラギン 199、グルタミン 202、アスパラギン 205、およびアルギニン 209 と水素結合を介して相互作用しました。 さらに、ドッキング解析結果に基づき、DS 3.0 の CDOCKER 相互作用エネルギー プログラム (図 1D) を使用した総結合エネルギーと CDOCKER 相互作用エネルギーは次のように計算されました。 152.154 kcal/mol、ジフロレトヒドロキシカルマロール (DPHC): -65.5221 kcal/mol、アルブチン: -33.6835 kcal/mol、チロシナーゼとの結合エネルギー: イソフロログルシン A (IPA): -546.504 kcal/mol、ジフロレトヒドロキシカルマロール (DPHC): -407.706 kcal /molおよびアルブチン: -79.0913 kcal/mol.
2.2. ゼブラフィッシュ幼生のメラニン合成に対するメラニン生成阻害剤の影響
この研究の目的は、IPA と IOE がインビボでゼブラフィッシュ幼生のメラニン形成を阻害できるかどうかを判断することでした。 私たちの以前の研究では、IPA と IOE はゼブラフィッシュの幼生に毒性を示さなかった [26]。 ゼブラフィッシュの幼虫をゼブラフィッシュ (0.05、0.15、および 0.5 nM) および IOE (3、10、および 30 μg/mL) で処理しました。 ) メラニン含有量を決定します。 阻害活性を推定するために、ゼブラフィッシュ抽出物の総メラニン含有量を測定しました。 ゼブラフィッシュのメラニンに対する表現型の影響は、室温で顕微鏡下で体の色素沈着を分析することによって観察されました。 表面メラニンは、さまざまな濃度のターゲット阻害剤によって大幅に減少しました (図 2)。 3 nM -MSH による処理は、未処理のグループと比較して、ゼブラフィッシュのメラニン含有量を大幅に増加させました。 最高濃度の IPA (0.5 nM) と IOE (30 µg/mL) は、総メラニン含有量をそれぞれ約 28.56% と 30.36% 減少させ、アルブチン (200 µM) 投与群と同様の効果を示しました (図 2A、 B）。
2.3. B16F10細胞におけるメラニン合成に対するIPAおよびIOEの影響
B16F10 細胞に対する IPA および IOE の細胞毒性効果は、MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 7}}臭化ジフェニルテトラゾリウム）アッセイ。 最初に、-MSH 刺激なしで異なる濃度で処理した B16F10 細胞に対する IPA と IOE の細胞毒性効果を調べました。 IPA (0.15、0.5、1.5、および 5 nM) は B16F10 細胞に対して有意な細胞毒性を示さなかったのに対し、IOE (1、3、10、および 30 μg/mL) は細胞毒性を示さなかった (図 3A、B)。 毒性のない IPA と IOE の濃度をさらなる研究に使用しました。
インビボでの IPA または IOE 処理によるメラニン阻害の効果が、B16F10 細胞で -MSH 刺激なしで可逆的であるかどうかを調べました。 メラニン含有量は、IPA (5 nM) または IOE (30 μg/mL) で処理すると、対照群と比較して大幅に減少しました (図 3C、D)。 これらの結果は、IPA と IOE が B16F10 細胞で -MSH 刺激なしでメラニン合成を阻害し、したがってその抗メラニン形成効果に寄与することを示唆しています。
2.4. -MSH刺激B16F10細胞におけるチロシナーゼ活性およびメラニン合成に対するIPAおよびIOEの影響
したがって、IPA (0.5、1.5、および 5 nM) および IOE (3、10、および 30 μg/mL) の用量を B16F10 黒色腫細胞とインキュベートして、細胞のチロシナーゼ活性および -MSH における生物活性を測定しました。 -仲介されたメラニン形成。
-MSH とアルブチンの濃度は、B16F10 細胞における細胞毒性とメラニン産生の結果に基づいて決定されました (図 S2A–D)。 生存率に関するデータを分析することにより、1 nM の -MSH と 100 μM のアルブチンをさらなる実験に使用しました。
細胞のチロシナーゼ活性に関しては、IPA の 1.5 nM の阻害効果は陽性対照で示されたものよりも比較的低かったが、濃度はほぼ 10 倍異なり、アルブチンの濃度は 100 μM で高かった (図 4A)。 IOE はチロシナーゼ活性を低下させ、-MSH 処理群と比較して異なる濃度の効果の間にわずかな変動がありました (図 4B)。 -MSH を介したメラニン形成に関しては、1.5 および 5 nM IPA 処理群でメラニン含有量の大幅な減少が観察されました (図 4C)。 さらに、30 μg/mL IOE は、ブランク グループに似た点まで色素沈着を抑制しました (図 4D)。 これらの結果は、IPA および IOE がチロシナーゼ活性をダウンレギュレートし、この阻害効果が B16F10 細胞の細胞メラニン合成の減少につながる可能性があることを示唆しています。
2.5。 -MSH刺激B16F10細胞の分子機構に対するIPAおよびIOEの影響
それらのメラニン形成抑制効果のメカニズムを解明するために、メラニン合成に関与するシグナル伝達分子の発現レベルに対する IPA および IOE の影響を決定しました (図 5)。 ERK (細胞外シグナル調節キナーゼ)、JNK (Jun N 末端キナーゼ)、および p38 は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) 細胞内シグナル伝達カスケードに属します [27,28]。 図 5A、B に示すように、ERK リン酸化は IPA 処理で増強されましたが、IPA (1.5 および 5 nM) または IOE (30 μg/mL) での処理後、JNK のリン酸化はわずかに減少しました。 さらに、図 5C に示すように、p-p38 レベルは、-MSH 刺激群で大幅に増加し、コントロールと比較して約 80% 増加しました。 さらに、IPA、IOE、またはアルブチンで処理した後、p38のリン酸化はわずかに抑制されました。 これらの知見は、IPA および IOE のメラニン生成抑制効果が JNK および p38 MAPK シグナル伝達経路に関連している可能性があることを示唆しています。
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