カルノフスキーの固定剤は、アンチセンス オリゴヌクレオチド Ⅰで処理された腎臓における組織処理に由来する空胞として現れるアーチファクトを防止します

抽象的な： アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO) 療法は、次のような新しい治療法として特定されています。難病。 でASOで治療された腎臓、近位尿細管では好塩基性顆粒に加えて空胞がよく観察されます。 いくつかの報告では、これらの液胞は、ASOの抽出組織処理中。 この研究では、カルノフスキー固定液または 4% パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液 (PFA) で固定した後の腎臓の形態を 10% 中性緩衝ホルムアルデヒド溶液 (NBF) のそれと比較しました。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（LNA-ASO）を含むロックド核酸含有アンチセンスオリゴヌクレオチド（LNA-ASO）を 50 mg/kg で 1 週間または 2 週間 4 回静脈内投与した雌の Sprague-Dawley ラットを検査しました。 NBFで固定した腎臓では、顕微鏡的には近位尿細管内の空胞と好塩基性顆粒が観察されました。 好塩基性顆粒は、ASO の蓄積を示します。 さらに、液胞の一部にはかすかな好塩基性顆粒も含まれており、液胞が ASO の蓄積に関連していることが示唆されました。 中程度の空胞化が近位尿細管で観察されましたが、空胞化した上皮の大部分は免疫組織化学的染色で腎損傷分子-1について陰性でした。 カルノフスキー固定を行ったサンプルでは、​​近位尿細管の空胞は観察されなかったが、好塩基性顆粒が観察された。 PFA 固定を行ったサンプルでは、​​NBF 固定を行ったサンプルと同様に、近位尿細管に空胞と好塩基性顆粒が観察されました。 全体として、我々の発見は、従来のNBF固定を使用した場合、組織処理中のアーチファクトによる空胞形成の過大評価の可能性を実証しました。 カルノフスキー固定剤は、人工液胞と真の腎毒性を区別するための有用な代替手段と考えられています。 (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

キーワード:アンチセンスオリゴヌクレオチド、アーティファクト、カルノフスキーの定着剤、空胞化、好塩基性顆粒、腎臓

シスタンケ サプリメント 腎機能サポート サプリメント PhGs75% Ech 30% Act 12%

最近、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）療法が難治性疾患の新たな治療法として確立されました 1, 2。ASO は、リボ核酸に結合して遺伝子発現を抑制する短い合成の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドです 3。

毒性学的には、ASO 誘発毒性は、ASO 配列に関連するハイブリダイゼーション依存性毒性と、化学修飾に関連するハイブリダイゼーション非依存性毒性に分類されます。 ハイブリダイゼーション非依存性の毒性は、1) ASO 蓄積、2) 炎症促進効果、および 3) アプタマー結合効果の 3 つの主なメカニズムによって誘発されます4。 ASO の蓄積は主に肝臓と腎臓で観察され、過剰な蓄積はこれらの臓器の機能障害を引き起こします5。 炎症促進効果は、げっ歯類やサルではToll様受容体への結合を介した自然免疫系の刺激、またはサルではASOによるH因子の阻害を介した副補体経路の活性化によって誘導されます6。 アプタマー結合効果は、血小板の活性化と凝集/血小板減少症を誘導し、血小板特異的受容体に結合します7。 さらに、肝細胞の細胞内タンパク質へのアプタマーの結合は、肝毒性の原因の 1 つであると考えられています 8-10。 これらの毒性を検出するために、研究者はいくつかの非臨床アッセイを開発しました。 その中でも、病理組織学的検査は、ASO の蓄積を検出するための最も感度の高い検査の 1 つです。

病理組織学的には、ASO の蓄積は通常、肝臓のクッパー細胞の細胞質または腎臓の近位尿細管に好塩基性顆粒として観察されます。 好塩基性顆粒の顕著な蓄積は、腎臓の空胞化または近位尿細管上皮の変性/壊死として一般に観察される変性変化の発生率または重症度の増加と相関しています4。 好塩基性顆粒だけでは毒性学的に重要とはみなされません11。 したがって、好塩基性顆粒の蓄積と変性変化を区別することは、ASO 関連の毒性を評価するために重要です。

ASO で治療したカニクイザルの腎臓の近位尿細管でよく観察される液胞には好塩基性物質が含まれており、細胞内で好塩基性顆粒と同じ一般的な分布を示します 11、12。 いくつかの報告では、固定プロセスが細胞内に影響を与える可能性があることが示唆されています。ファゴリソソームコンパートメント内での ASO 蓄積の出現 5、11。さらに、Henry et al. Engelhardt は、近位尿細管の空胞は、パラホルムアルデヒド/グルタラルデヒド灌流固定腎臓には空胞が存在しないため、処理中の ASO の抽出に起因する二次的な現象である可能性が高いと説明しました 5, 11。 mipomersen を伴う結合は、固定プロセス中に現れると推測されています 13。

したがって、ASO 処理による空胞化は場合によってはアーチファクトである可能性がありますが、この仮説は明確に証明されておらず、毒性評価に適切な固定方法を特定した報告もありません。 したがって、この研究では、カルノフスキー固定液または 4% パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液 (PFA) で固定した後の腎臓の形態を 10% 中性緩衝ホルムアルデヒド溶液 (NBF) のそれと比較しました。 さらに、我々は、アーティファクト由来の空胞化を防ぐための代替固定剤としてのカルノフスキー固定剤の有用性を実証しました。

生後 4 週間のメスの Sprague-Dawley ラットを Charles River Laboratories Japan Inc. (神奈川県、日本) から購入し、実験室条件に順応させました。 動物は制御された条件（12-時間の明暗サイクル、温度23±2度、相対湿度50±25％）下で維持され、標準的な市販食餌（オートクレーブ処理したCR-LPF;オリエンタル酵母株式会社、東京、日本）と水道水。 20 匹の動物を次の 4 つのグループ (それぞれ 5 匹ずつ) に割り当てました: 1- 週間生理食塩水処置グループ (対照- 1W)、2- 週間生理食塩水処置グループ (対照{ {14}}W）、1-週のロックド核酸含有アンチセンスオリゴヌクレオチド（LNA-ASO）処理グループ（ASO-1W）、および2-週のLNA ASO処理グループ(ASO-2W)。 ５０ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ－ＡＳＯ投与の開始時、動物は５週齢であった。 LNA-ASO は以下のレジメンに従って合計 4 回静脈内投与されました。ASO-2W 群では 1、4、8、11 日目。 そして1日目、2日目、3日目、4日目はASO-1Wグループ。 コントロール-1WおよびASO-1Wグループの動物は7日目に屠殺されました。コントロール-2WおよびASO-2Wグループの動物は7日目に屠殺されました。 14. 各終末解剖では、イソフルランによる深い麻酔下で、臨床病理学のための血液サンプルが腹部大静脈から収集されました。 採血後、直ちに腹部大動脈を切断して放血によりすべてのラットを安楽死させた。 体外表面、胸腔、腹腔、内臓を肉眼的に検査し、左腎臓を摘出し、顕微鏡検査のために加工した。 すべての操作は田辺三菱製薬株式会社の「実験動物の飼養及び保管並びに動物実験に関する規程」に準拠して実施した。

血清サンプルは、血液サンプルを 4 度で遠心分離することによって得られました。 TBA-2000 FR 装置 (キヤノン メディカル システムズ株式会社、栃木県、日本) を使用して血清生化学分析を実施し、血中尿素窒素 (BUN) およびクレアチニン (CRE) レベルを評価しました。

腎臓を次のように 3 つの固定液を使用して固定しました。腎臓を横方向に 3 つのセグメントに分割した後、腎盂を含む中央部分を 10% NBF で 5 日間固定しました。 頭蓋部分はカルノフスキー固定液 (武藤純薬株式会社、東京、日本) で固定されました。 尾部を４％ＰＦＡ中で４度で１７時間固定し、その後１０％ＮＢＦ中に２４時間置いた。 各固定サンプルを脱水し、パラフィンに包埋しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色用に組織切片を調製しました。 免疫組織化学的染色は、腎損傷分子-1 (KIM-1; R&D Systems Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州、米国; 1:300 希釈) およびリソソーム関連膜タンパク質 2 (LAMP{{ 13}}；Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム；1:1000 希釈）抗原回復後（クエン酸緩衝液、pH 6.0、10 分間加熱または加圧下で 20 分間加熱）。 Histofine Simple Stain Rat MAX PO (ニチレイバイオサイエンス株式会社、東京、日本) を二次抗体として使用しました。

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