カルノフスキーの固定剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド II で治療された腎臓における組織処理に由来する空胞として現れるアーチファクトを防止します
Apr 03, 2024
肉眼的には異常な変化は観察されませんでした。 さらに、血液化学において、腎臓パラメータ（すなわち、BUNおよびCRE）は、どのグループでも有意な変化を示さなかった（表1）。
シスタンケ サプリメント 腎機能サポート サプリメント PhGs75% Ech 30% Act 12%
10% NBF で固定した腎臓の病理組織学的所見の概要を表 2 に示します。顕微鏡的には、近位尿細管、特に S1 セグメントと S2 セグメントの好塩基性顆粒と空胞が、ASO-1W の両方で観察されました。腎臓については 10% NBF で固定された ASO-2W グループ (図 1A)。 これらの変化は、ASO-1W グループよりも ASO-2W グループの方が深刻でした。 好塩基性顆粒の蓄積は、主に近位尿細管の刷子縁で凝集体および／または点状構造として観察された。 好塩基性顆粒は、エンドソームまたはリソソーム内と近位尿細管上皮の細胞質内に自由に存在することが報告されているため、これらの異なる形態はそれらの蓄積領域を反映している可能性があります。 つまり、凝集体と断続構造はそれぞれリソソームと細胞質に蓄積する可能性があります。 近位尿細管の液胞は丸くて粗い形状であり、ほとんどが隣接する液胞と融合していました。 さらに、液胞の一部にはかすかな好塩基性顆粒が含まれており (図 1E)、このことは液胞が ASO の蓄積に関連していることを示唆しています。 免疫組織化学的に、LAMP-2は液胞の膜表面で陽性でした（図1Gおよび1H）。 結果は、空胞化がリソソームの拡張であることを示しました。 ASO-1W グループと ASO-2W グループの間の空胞化の重症度の違いは、リソソームに蓄積された ASO の数の違いを示している可能性があります。 リソソームに蓄積される ASO の量は、ASO への曝露時間が増加するにつれて増加すると推測されます。 その結果、組織の処理により、リソソームの膨張が空胞化として現れました。
表 1. 血液化学データ
表 2. 10% N で固定した腎臓の病理組織学的所見
中程度の空胞化が観察されましたが、近位尿細管変性は明らかではなく、空胞化上皮の大部分は免疫組織化学的染色で KIM-1 について陰性でした（図 1D）。 対照的に、カルノフスキー固定液で固定されたサンプルでは、近位尿細管内の空胞はすべての個体で存在しませんでしたが、好塩基性顆粒が頻繁に観察されました (図 1B)。 好塩基性顆粒は、細胞構造がよく保存されていたため、10% NBF 固定を受けたサンプルのものよりも顕著でした (図 1F)。 4% PFA 固定を行ったサンプルでは、液胞と好塩基性顆粒が観察されました。 ただし、空胞化の重症度は、10% NBF 固定を受けたサンプルよりもわずかに低かった (図 1C)。
オリゴヌクレオチドは水溶性の高い分子であり、細胞成分を完全に架橋できないため、処理中に組織から抽出されます。
これらの結果に基づいて、我々は、近位尿細管の液胞が固定方法の影響を受け、10% NBF および 4% PFA 固定を受けた組織で観察された形態学的変化は、組織処理中の ASO 蓄積領域におけるアーチファクトである可能性があると結論付けました。 言い換えれば、尿細管変性、KIM-1の発現増加、または腎臓パラメーターの異常な変化が観察されなかったため、空胞化は毒性学的に重要ではない可能性があります。 したがって、ASO 治療動物の腎臓の正確な病理学的検査のためのオプションの固定方法としてカルノフスキー固定液を使用することをお勧めします。
結論として、我々の現在の調査結果は、従来のNBF固定法を使用した場合に空胞形成が過大評価されている可能性があることを明らかにしました。 カルノフスキー固定液は、人工液胞と真の腎毒性を区別するのに有用なツールである可能性があります。
図 1。アンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) で処理した腎臓の代表的な顕微鏡写真。(A) 10% 中性緩衝ホルムアルデヒド溶液 (NBF)、(B) カルノフスキー固定液、または (C) 4% パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液 (PFA) で固定した腎臓に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むロックド核酸 (LNA-ASO) 処理群 (ASO4W) の組織病理学的変化。(D) 10% NBF で固定した腎臓に対する ASO9W の腎障害分子 (KIM8) に対する免疫組織化学染色。(E) 10% NBF および (F) カルノフスキー固定液で固定された腎臓に対する 1- 週間の LNA-ASO 治療群 (ASO-1W) における組織病理学的変化。 10% NBF で固定した腎臓の (G) ASO-1W および (H) ASO-2W のリソソーム関連膜タンパク質 2 (LAMP-2) の免疫組織化学的染色。 (A) 近位尿細管には好塩基性顆粒 (黒色矢印) と空胞 (黒色矢印) が観察されます。 ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色。 Bar=20 μm。 (B) 液胞は観察されないが、好塩基性顆粒（黒色矢印）が観察される。 H&E染色。 Bar=20 μm。 (C) 好塩基性顆粒 (黒色矢印) と空胞 (黒色矢印) が観察されます。 しかし、空胞化の重症度は、10% NBF 固定を行ったサンプルよりも低かった。 H&E染色。 Bar=20 μm。 (D) 空胞化した近位尿細管の大部分は KIM-1 に対して陰性です。 Bar=20 μm。 (E、F) 近位尿細管で観察された液胞の一部には、好塩基性顆粒がかすかに含まれていました (緑色の矢印)。 好塩基性顆粒がはっきりと観察され、細胞構造が保存されています (緑色の矢印)。 H&E染色。 バー=20 μm。 (G、H) 液胞の膜表面は LAMP-2 に対して陽性です (青い矢印)。 バー=20 mm。
潜在的な利益相反の開示: 著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞：著者らは、親切なアドバイスをくださった吉川恵介氏と太田哲也氏に感謝します。
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