腎臓上皮を標的としたミトコンドリア転写因子Aの欠損は、重度の嚢胞性疾患に関連する進行性のミトコンドリア枯渇をもたらします
Mar 23, 2022
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp：008618081934791
石井健、小林花子、田口健成ほか
前書き
ミトコンドリア（mt）の機能障害は、一般的な腎臓病のよく知られた病理学的特徴であり、細胞傷害、炎症、および線維症を引き起こす可能性があります。 腎臓では、尿細管上皮細胞は、複数のエネルギーを消費する上皮輸送機能を実行するため、酸化的リン酸化（OXPHOS）から生成されるアデノシン三リン酸（ATP）に大きく依存しています。 したがって、効率的なmt ATP産生の維持は、正常な腎機能と全身電解質ホメオスタシスに不可欠です。 さらに、最近の証拠は、ミトコンドリアが遺伝子調節、細胞シグナル伝達、および中間代謝物と活性酸素種（ROS）の生成を介した細胞分化において主要な役割を果たしていることを示しています2。一般的な腎臓病はよく理解されていません。
腎恒常性と病因におけるmt機能を調査するために、標的ミトコンドリア転写因子A（TFAM）。 TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)は、mt機能、mtコピー数の維持、およびmt DNAの構造的安定性に不可欠な核コード化因子です。これは、プロモーターDNAを曲げることによってmtゲノムの複製と転写を調節するためです。呼吸鎖複合体のタンパク質サブユニット、22は転移RNA、および2つのリボソームRNAをコードします。 したがって、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)ミトコンドリアにコードされたチトクロームb（MT-CYB）、ミトコンドリアにコードされたチトクロームcオキシダーゼサブユニット1（MT-CO1）、ミトコンドリアにコードされたATPシンターゼ膜サブユニットなどの遺伝子の転写を介してmt電子伝達とATP合成の調節に直接関与しています6（MT-ATP6）.3なしTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)、細胞はOXPHOSを介してATPを生成する能力を失い、大量のmt ROSを生成できず、ミトコンドリアが次第に枯渇するようになります。-遺伝学的研究により、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)グローバルホモ接合体であるため、正常な胚形成には不可欠ですTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)不活化は、胚の10。5日までに子宮内致死性をもたらしましたが、ヘテロ接合性欠損症は、mtコピー数を-40パーセント減少させ、呼吸鎖欠損症を引き起こしましたが、胚性致死性を引き起こしませんでした。 したがって、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A) は、細胞分化および組織恒常性における進行性mt機能障害の役割を調べるための有用な実験戦略です。 細胞型特異的な条件付き不活化TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)OXPHOSおよび/またはmtROSの生成は、細胞の分化、機能、および正常な生理学にとって重要であることが示唆されました。-1 o
核またはmt遺伝子の変異による原発性mt障害は、尿細管間質性損傷または孤立性尿細管機能障害として最も一般的に現れる腎疾患を呈する可能性があります1,12。(標的ミトコンドリア転写因子A)腎疾患の原因は報告されていません。 最近では、削減されましたTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)発現は慢性腎臓病に関連しています。 によるmtの整合性の喪失TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)不活化は、マウスに尿細管間質性疾患と腎不全を引き起こしました。これは、mt DNAストレス誘発性のサイクリックGMP-AMPシンターゼ（cGAS）-インターフェロン遺伝子刺激因子（STING）依存性炎症反応の活性化に一部起因していました。
ここでは、条件付きのマウスを報告しますTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A) 正弦波に関連するホメオボックス2（SIX2）を発現するネフロン前駆細胞の不活化は、重度の嚢胞性疾患を発症し、若い幼若マウスのように腎不全で早期に死亡します。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-マウスは、ネフロン成熟の欠陥によって特徴づけられました。これは、mtの枯渇、OXPHOSの減少、および解糖への代謝シフトに関連していました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7-腎上皮。 嚢胞性疾患の重症度を考えるとTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7-マウス、多発性嚢胞腎（PKD）の2つのマウスモデルを分析しました。これは、ポリシスチン-1（Pkd1）またはシスチン-1（Cys1）のいずれか、およびヒトの変異に起因します。常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）の患者からの組織。 私たちはそれを確立しますTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)ネズミとヒトの両方のPKD組織からの嚢胞で調節不全です。 まとめると、私たちの研究はTFAMが(標的ミトコンドリア転写因子A)調節不全とmtの枯渇は、腎嚢胞性疾患の特徴であり、それらの病因に寄与する役割を果たしている可能性があります。
結果
TFAM（標的ミトコンドリア転写因子A)SIX2系統細胞の不活化は、腎不全を引き起こす重度の嚢胞性疾患を引き起こします
腎上皮のmt機能を調べるために、不活化TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)SIX 2-発現前駆細胞では、集合管（CD）を除くすべてのネフロンセグメントが生じます。15このために、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)Six2プロモーターの転写制御下で強化緑色蛍光タンパク質/Creリコンビナーゼ融合タンパク質（eGFP / Cre）を発現する細菌人工染色体トランスジェニックマウスを用いたfloxed対立遺伝子（図1a）。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)eGFP / Cre導入遺伝子（Six 2- eGFP / Cre plus; T fam）のフロック対立遺伝子およびヘテロ接合体は、以降、Six2-Tfam-/-変異体と呼ばれます。 6匹の2-Tfam-/-マウスは、予想されるメンデルの法則の比率で生まれ、出生時の目視検査では、同腹仔対照と区別できませんでした。 ただし、Six2-間の体重の違いTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A){{0}}変異体と同腹仔対照は生後日までに明らかになりました（P）14（5.7±0。変異体では3g、対照では7.5±0.3g、n {{11} }それぞれ、P =0。004;補足表S1）。 6つ2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A) 変異マウスは、対照と比較して腎臓が肥大していることを特徴としていました（腎臓/体重比は1.45パーセント±0変異体では.19パーセント、対照では0。60パーセント±0.02パーセント、n =4それぞれ、P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7-変異体は、有意なアルブミン尿を発症しました（尿中アルブミン/クレアチニン比= 362.4±75.18mg / g in Six 2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)--変異体vs.P14、n=6および10の対照における43.58±3.39mg/ g; P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-'変異体、ヘテロ接合性のマウスTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)正常に発達したSIX2前駆細胞の欠損は肥沃であり、明白な腎臓病を発症しませんでした（補足図S1）。
図1| SIX2系統細胞におけるTfamの不活性化は、重度の嚢胞性疾患と腎不全を引き起こします。（a）Tfamfloxed対立遺伝子内の標的配列の実験的アプローチと位置を示す概略図。 同腹仔対照（Cre）および生後日（P）7のSix{{0}}Tfammiceから単離された全ゲノム腎臓DNAのポリメラーゼ連鎖反応分析。 非組換えTfamfloxed対立遺伝子は2-lox（2）で示されます。 1- loxによる組換え対立遺伝子、wtによる野生型対立遺伝子。 þまたは-は、Six 2- eGFP/Cre導入遺伝子の有無を示します。 （b）左のパネル、P20歳のCreコントロールおよびSix2-Tfamマウスの腎臓の写真。 腎臓の重量（KW）は、体重（BW）のパーセンテージとして表されます（n¼4–14）。 右のパネル、Cre同腹仔対照（co）およびSix 2- TfamマウスのP7歳（それぞれn¼7および6）の血中尿素窒素（BUN）レベル、およびCre対照およびSix{のカプランマイヤー生存曲線{16}}ログランク検定と比較したTfamマウス（n¼10–13）。 （c）ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色され、平滑筋アクチンについて免疫組織化学によって分析された、P7およびP29歳のCreコントロールおよびSix2-Tfamマウスからのホルマリン固定パラフィン包埋腎臓切片の代表的な画像（ACTA2）およびクラスター分化（CD）抗原31。数字の記号は嚢胞構造を示し、アスタリスクは糸球体を示します。 バー腎臓全体の断面の場合は¼1mm、高倍率のH＆E画像の場合は100 mm、IHC画像の場合は50mm。 データは平均SEMとして表され、2-テールスチューデントのt検定によって分析されました。 ***P<0.001。>www.kidney-international.org。
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Six2-の分析TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-マウス。ROSA26-ACTB-tdTomatoも発現しました。-eGFPCreレポーター対立遺伝子。ここではSix2-mT/mGと呼びます。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7マウス、嚢胞構造の大部分がTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-腎臓（補足図S3）。 これらの発見は、Six 2-におけるリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（p-ERK）および-カテニンレベルの増加と一致しています。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-腎臓組織（補足図S3）。 まとめると、私たちのデータは、Six 2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/腎臓は、腎嚢胞性疾患に頻繁に関連する分子的特徴を示します。
Six2-ではネフロンの成熟に欠陥がありますTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/マウス組織特異的なマウスになるまでに数週間かかることがあるためTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)不活化は病状を発症します。次に、Six2-における腎疾患の発症の時間経過を調べました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A){{0}}マウス。 P 0、P7、およびP14の年齢のコントロールおよび変異マウスから腎臓を収集し、組織学的方法、免疫蛍光（IF）染色、および評価のために全腎臓抽出物の遺伝子発現分析を使用しました。 P0歳でのSIX2およびE-カドヘリンのIF染色は、対照およびSic2-からの腎臓を示しました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-組織学的に類似していた。 SIX2プラスキャップ間葉、E-カドヘリン発現尿管先端などの皮質腎性ゾーン構造、および腎小胞やコンマ型およびS型体などの新生ネフロン構造の形成は、Sixではブロックされませんでした{{7} }TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7-腎臓（図2a）。 これらの組織学的所見は、腎性マーカーをコードする遺伝子の発現レベルと一致していた。 Six2、ペアボックス2（Pax2）、LIMホメオボックスタンパク質1（Lhx1）、およびspalt様転写因子1（Sall）mRNAレベルは、コントロールとSix2-の間で有意差はありませんでした。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/ P 0腎臓からの総腎臓ホモジネート中のマウス（図2b）。 これはTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)SIX2ネフロン前駆細胞の不活化は腎性構造の形成に有意な影響を与えませんでした。
図2|ネフロンの成熟は6匹の2-Tfam-7マウスで欠陥があります。（a）生後日（P）0のCre〜コントロールおよびSix 2- Tfam-/kidneysからのホルマリン固定パラフィン包埋切片の代表的な画像。 腎臓切片をトルイジンブルーで染色し、免疫蛍光法でサインオキュリス関連ホメオボックス2（SIX2）およびE-カドヘリン（ECAD）の発現を分析しました。 尿管は白い破線で囲まれています。 キャップ間葉（CM）、コンマ型ボディ（CSB）、S型ボディ（SSB）、および尿管先端（UT）に注釈が付けられています。 （b）左パネル、Cre同腹仔対照と比較したPO年齢の6つの2- Tfam- /変異体からの総腎臓ホモジネートにおける定量的ポリメラーゼ連鎖反応による発生マーカーの相対的mRNA発現レベル（それぞれn =6） ）。 右のパネル、Cre-同腹仔対照と比較したP7歳の6つの2- Tfam7変異体からの総腎臓ホモジネートにおける相対的な糸球体（グロム）およびネフロンセグメント特異的遺伝子発現（それぞれn =4）。 PT、近位尿細管; mTAL、ヘンレ係蹄の太い上肢。 DT、遠位尿細管; CD、集合管。 （c）P 0、P7、およびP14歳のアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ（AB-PAS）染色腎臓切片。 矢印は刷子縁のあるPAS陽性細管を示し、アスタリスクは糸球体を示し、数字記号は嚢胞性細管を示し、バー= 100 umはAB-PAS画像、50umはトルイジンブルー染色画像およびIF画像を示します。 データは平均±SEMとして表されます;2-テールスチューデントのt検定;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org。
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発生期のネフロン構造の形成は阻害されませんでしたが、アルシアンブルー/過ヨウ素酸-シフおよびロータステトラゴノロバスレクチンによる染色は、Six2-の末端ネフロン成熟の欠陥を示しました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A){{0}}年齢P0のマウス。 アルシアンブルー/過ヨウ素酸-管状基底膜と刷子縁を染色するシフ、および近位尿細管細胞の刷子縁の特定のオリゴ糖を識別するロータステトラゴノロバスレクチンは、両方とも変異腎臓で減少しました。 図2cは、P 0、P7、およびP14の時点でのアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ染色を示しています。 P 0、P7、およびP14の時点でのWilms腫瘍1タンパク質のロータステトラゴノロバスレクチン組織化学およびIF染色を補足図S4に示します。 PO年齢で、ロータステトラゴノロバスレクチンで陽性に染色された相対面積は、2.10パーセント±0。51パーセントおよび0。39パーセント±0。1パーセントでした。年齢P7対対照の6.25パーセント±0.28パーセントおよび6.2パーセント±1.1パーセント（それぞれn=3-4、P= 0。0004および0.0007;補足図S4）。 これらの組織学的所見と一致するのは、糸球体およびネフロンセグメント特異的マーカーであるポドシン、ネフリン、アクアポリン1（Agp1）、リン酸ナトリウム共輸送体2a（NaPi2a）、ウロモジュリン、塩化ナトリウムカリウム共輸送体2をコードする遺伝子の発現の有意な減少です。 （Nkcc2）、およびSix 2-のチアジド感受性塩化ナトリウム共輸送体（Ncc）TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/マウス（図2b）。 まとめると、これらのデータは、Six 2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-腎臓は、成熟した近位ネフロンセグメントと糸球体の数の漸進的な減少を示します。
Six 2- eGFP/Creアクティビティが結果として生じるためTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-キャップ間葉由来のネフロンセグメントが不足しているため、尿管芽由来のCD上皮細胞の成熟はSixでは影響を受けないと予測しました2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/腎臓。 この概念と一致するのは、遠位尿細管およびCDのN-アセチル-D-ガラクトースと反応するDolichos biflorus凝集素による染色は、Six2-におけるDolichosbiflorus凝集素陽性構造の相対的な過剰発現を示したということです。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-腎臓。 P7歳では、Dolichos biflorus凝集素の陽性染色領域は、変異体の総面積の13.91パーセント±0。9パーセントでしたが、対照の1.93パーセント±0。1パーセントでした（n {{11} }、P=0。0002;補足図S4）。両方ともCD上皮細胞で発現されるナトリウムチャネル上皮1アルファサブユニット（Scnnla）またはアクアポリン2（Agp2）のmRNA発現は、コントロール（図2b）。Six2-とは対照的TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-腎臓、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)ホメオボックスB7（HOXB7）前駆細胞の不活化は、CD上皮細胞を生じさせ、CDネフロンマーカーの発現を失い、軽度の尿細管拡張を引き起こしますが、嚢胞形成は引き起こしません（補足図S5）。 まとめると、私たちのデータは、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)SIX2前駆細胞の機能は、新生ネフロン構造の発達を阻止しませんが、終末ネフロンの成熟を阻害します。
TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-嚢胞は一般的なネフロンセグメントマーカーが不足しています
の組織発生の起源を特徴づけるためにTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7腎嚢胞、IF分析を実施しましたTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 umは、ウロモジュリンの管腔内沈着によって特徴づけられました。これは、近位尿細管の遠位にあるネフロンセグメントとヘンレ係蹄の下降ループからの発生を示唆していました（図3b）。
図3ITfam-/cystsは、一般的なネフロンセグメント固有のマーカーを発現しません。(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50ええと。 （b）Six 2- mT/mGからのホルマリン固定パラフィン包埋腎臓切片の代表的な画像。 Tfam -7 P14歳のマウスは、IFによってeGFPとウロモジュリンが染色されました。 アスタリスクは、管腔内のウロモジュリンを含む嚢胞を示しています。 管腔内ウロモジュリンの存在は、最大直径が50-100 umの嚢胞、または最大直径が100umを超える嚢胞で調べられました。 バー=（a、b）100um。 この画像の表示を最適化するには、wwwkidney-international.orgでこの記事のオンラインバージョンを参照してください。
mt機能と形態の進行性異常TFAM（標的ミトコンドリア転写因子A)-7-上皮細胞
の代謝結果の時間経過を特徴づけることTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)欠失、我々は最初にmRNAレベルを調べたTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)とTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-規制されたmt-Col、mt-Cyb、およびmt-Atp6TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-PO、P7、およびP14歳の腎臓。 予想通り、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)、mt-Col、mt-Cyb、およびnt-Atp6 mRNAレベルは大幅に減少しました（図4a）。 eGFP（Six 2- mT / mG; Tfam -7マウス）でタグ付けされたT fam -7-上皮細胞は、MT-CO1タンパク質発現の有意な減少を示しました（補足図S7）。 mt DNAのコピー数は63％減少しました。これは、mtの枯渇と一致しています。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)欠乏症（図4a）。 対照的に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをコードする核遺伝子の発現：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット3（Ndufs3）およびコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラボタンパク質サブユニットA（Sdha）は、P 0年齢では影響を受けなかったが、P7およびP14歳では減少した。 （図4a）。 mt遺伝子およびタンパク質分析からのこれらの発見は、Tfam-/-上皮におけるmtコピー数の進行性の喪失と一致している。
次に、の代謝効果を調査しましたTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)P7歳で分離された一次近位尿細管上皮細胞（PTEC）の不活化。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7 PTECは、基礎酸素消費率の大幅な低下を示しました（変異体では40.77±4.10、対照では61.75±5.18 pmol / min / 10細胞、n=3各、P= 0。034 ）、ATP関連呼吸（変異体の場合は33.11±3.91、対照の場合は46.92±4.91 pmol / min / 10 *細胞、各n=3、P=0。093）、最大呼吸（116.8±変異体の場合は14.19対対照の225.5±13.55pmol/ min / 10 *細胞、各n=3、P =0。005）、および予備の呼吸容量（変異体の場合は76.05±10.18対163.7±コントロール用の8.61pmol/ min / 10 *セル、各n=3、P=0。003;図4b）。
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mtの枯渇と損傷の程度をさらに特徴づけるために、我々は調べたTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-透過型電子顕微鏡および3-次元構造化照明顕微鏡（3D SIM）による腎臓。 P7歳で、ミトコンドリアは不規則な形とバルーニングを示しました。これは、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)ノックアウトマウス。 透過型電子顕微鏡分析は、サイズの増加や異常なクリステなどのミトコンドリアの構造異常が出生後に進行したことを示しました。これは、変異体と対照の間の形態学的差異がP 0歳ではあまり目立たず、年齢とともにより重篤になったためです（図4c ）.3D SIMを使用して、Six 2- mT/mGのmtボリュームとネットワークサイズを調べました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/P7歳の6匹の2-mT/mG対照マウスと比較した変異体。 mt体積は、セクションごとに5〜8細管の断面で測定され、IF染色によって電位依存性陰イオン選択性チャネル1について染色された25〜40eGFP陽性皮質上皮細胞を調べました。 eGFP陽性細胞あたりの総mt体積が大幅に減少することがわかりました（変異体では62.66±16.46 um /細胞、対照では177.4±30。17μm'/細胞、n=3それぞれ、P= 0。0289）であり、総細胞体積あたりの総mt体積の比率が、対照の0。230±0.01から6の0.089±0.016に変化したことに関連していました。 2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7ミュータント（それぞれn=3、P =0 .0017;図4c）。 調べたすべてのeGFP陽性細胞で遭遇した最大のmtネットワークを測定する最大mtネットワークサイズは、Six2-で減少しました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/腎臓（変異体の場合は143.2±23.2μm²、対照の場合は318.3±49.45um²、それぞれn=3、P=0。0327）。 まとめると、超微細構造とSIMの所見、およびmt遺伝子とタンパク質の分析からの所見は、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-7-上皮。
図4| Tfam- /腎臓上皮は、進行性のミトコンドリア枯渇を特徴としています。（a）生後日（P）{{0}}、P7、およびP14（対照に対する倍数変化、それぞれn =6）での定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるミトコンドリア（mt）遺伝子発現およびCre〜同腹仔対照（co）およびSix 2- Tfam- /マウスからの総腎臓ホモジネート中のmtDNA含有量（P7）。 （b）Seahorse XFe24プラットフォームでP7歳のCre同腹仔対照および6つの2-7家族から分離された一次近位尿細管上皮細胞（PTEC）の酸素消費率（OCR）。 オリゴマイシンA（オリゴA、アデノシン三リン酸[ATP]シンターゼ阻害）、カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（FCCP、脱共役剤）、および酸化的リン酸化ロテノンの阻害剤で処理されたコントロールおよびTfam-7PTECの代表的なOCR測定およびアンチマイシンA（AA）。 また、計算された基礎呼吸と最大呼吸、ATPに関連した呼吸、および予備の呼吸能力（それぞれn =3）も示されています。 （c）透過型電子顕微鏡によるミトコンドリアの超微細構造分析。 Cre-controlおよびSix2-Tfam -7マウスのP0およびP7歳の腎臓切片の代表的な透過型電子顕微鏡画像。赤い矢印は、ミトコンドリアを示しています。 バー= 500nm。 （d）Six 2- mT / mG（co）およびSix 2- mT/mGからの腎臓切片の3次元構造化照明顕微鏡画像。 Tfam-/-P7歳のマウス。 強化緑色蛍光タンパク質（eGFP）、チトクロームcオキシダーゼサブユニット4（COXⅣ）、および電位依存性陰イオン選択性チャネル1（VDACが免疫蛍光抗体法によって検出されました。4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAP ）は核染色（青色蛍光）に使用されました。白い破線は対照の腎尿細管と変異腎臓の嚢胞内腔の輪郭を描き、数字の記号は対照の尿細管内腔または変異腎臓の嚢胞内腔を示しています。mt領域はImarisで定量化されました。ソフトウェア（Oxford Instruments、Abingdon、UK;各n =3）。eGFP陽性細胞あたりの総（tot）mtボリューム（vol）（25-40細胞/サンプル分析）、総mtボリュームの比率総セルボリュームあたり、およびセルあたりのmtネットワークの最大（最大）サイズ。mtネットワークサイズは、断面あたり5セルの管状断面で決定されました。バー=4um。データが表示されます。平均±SEMとして、学生のtテストによって分析されました。* P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM（標的ミトコンドリア転写因子A)欠乏は腎上皮代謝を解糖にシフトします
腎臓のPTECは、ATP生成に脂肪酸酸化とOXPHOSを使用し、糖新生を起こします。 学位Tamの不活性化に関連する代謝変化についての追加の洞察を得るために、Six2-の子供たちのRNAシーケンス分析を実行しました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-およびP7歳のCre〜同腹仔対照マウス。 解糖系に関与する主要な調節遺伝子、たとえばヘキソキナーゼ2（Hk2）やエノラーゼ2（Eno2）がアップレギュレーションされていることがわかりました。 対照的に、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ1B（Acaalb）などの酪酸酸化に関与する遺伝子の発現と同様に、トリカルボン酸回路に関与するほとんどの遺伝子の発現が減少しました（例えば、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1 [Idh1）、中鎖アシル補酵素Aデヒドロゲナーゼ（Acadm）（図5aおよびb、補足図S8）。 Seahorse XFe24プラットフォーム（Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州）を使用した、P7歳でのトリカルボン酸回路制御および変異腎臓に関与する遺伝子の発現低下と一致しています。 変異体PTECは、基礎解糖の有意な増加を特徴としました（プロトン流出速度= 117。4±12。0変異体では7 pmol / min、対照では73.34±6.33 pmol / min、n {{25 }}、P= 0。{{30}} 0 32）および解糖系プロトン流出速度に対するmt酸素消費速度の比率が対照の0.73±0.08から減少変異型PTECでは0.34±0.02まで（n=3、P=0。0074）。 まとめると、これらのデータは次のことを示していますTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/-上皮細胞は、OXPHOSおよび酪酸酸化から解糖への代謝シフトを受けていました（図5d）。
図5]腎上皮ミトコンドリア転写因子A（TFAM）欠損症は、解糖系の増加と異常な酪酸代謝に関連しています。（a）生後日（P）7（n {{6）の6匹の2- Tfam-/-およびCre-同腹仔対照（co）マウスから単離された全腎臓皮質のRNA配列決定による代謝遺伝子発現の分析}} 各）。 解糖系とトリカルボン酸回路に関与する、特異的に調節された代謝遺伝子が示されています。 mRNA発現が統計的に有意に増加している遺伝子は赤で示され、発現が減少している遺伝子は緑で示されています。（b）定量的ポリメラーゼ連鎖反応による選択された差次的調節遺伝子のmRNA発現レベル（n=4-6）。 （c）6匹の2-7Tfam-7変異マウスにおける脂肪酸代謝の変化。 P14歳のSix2-Tfam-7およびCrelittermateコントロールマウスのオイルレッドO染色腎臓切片の代表的な画像。 矢印はオイルレッドO陽性細胞を指しており、数字のsianはコストを表しています。 バー= 10um。（d）Cre同腹仔対照およびP7歳の6つの2- Tfam- /腎臓から分離された一次近位尿細管上皮細胞（PTEC）の解糖フラックス分析（それぞれn=4 ）SeahorseXFe24プラットフォーム上。 示されているのは、コントロールおよび2-デオキシグルコース（2- DG）および酸化的リン酸化阻害剤ロテノンおよびアンチマイシンA（AA）で処理されたTfam -7 PTECにおける解糖プロトン流出速度（グリコPER）の代表的な測定値です。 。 また、ベースラインでの平均糖PERと、糖PERに対するミトコンドリア（mt）酸素消費率（OCR）の比率も示されています。 データは平均±SEMとして表され、スチューデントのt検定を使用して分析されました。 （続き）
減少TFAM（標的ミトコンドリア転写因子A)マウスおよびヒトのPKD組織での発現はmtの枯渇に関連しています
シックス2-TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/腎臓はPKD腎臓と非常によく似ています。次に、次のことを評価しました。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)PKD組織で調節不全でした。 最初に調べたTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)2つの確立された遺伝的PKDマウスモデルにおけるTFAM調節遺伝子発現。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)mRNAレベルは、Pkd1-/-およびCyspk/pkマウスの腎臓全体のホモジネートで有意に減少しました。これらのマウスは、Pkd1またはCys1のいずれかに変異があります。 これは、ミトコンドリアおよび核にコードされたmt遺伝子の発現の減少、ならびに調節不全の解糖系遺伝子の発現と関連していた。 Six2-に似ていますTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)-/腎臓、Pkd 1-7およびCysPkpk腎臓は、Eno2およびHk2の上昇と、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Pkg）1、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（Pdk）1、およびPdk4転写レベルの有意な低下を特徴としました（図6a）。TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)IF染色によって評価されるタンパク質発現は、隣接する非嚢胞性尿細管からの上皮細胞と比較して、嚢胞内層上皮細胞で減少しました（図6b）。 これは、RNA蛍光insituハイブリダイゼーションによるmt-Co1およびmt-Atp6発現の低下と関連していました（図6b、補足図S9）。 3D SIMで測定したmt体積は、隣接する非嚢胞性尿細管の上皮細胞または正常な対照腎臓のPTECと比較して55％減少しました。 正常な対照PTECと非嚢胞性尿細管からのPTECとの間のmtvol-umeの違いは見つかりませんでした（図6c）。
図6| ミトコンドリア転写因子A（TFAM）の発現は、Pkd1-7-およびCysPkepk腎嚢胞で減少します。（a）Pkd 1-7およびCyskidneys（n=3-5）におけるミトコンドリアおよび核にコードされたミトコンドリアおよび解糖系遺伝子の相対的mRNA発現レベル（Cre同腹仔コントロールの倍数変化）（b）腎臓の代表的な画像生後日（P）22で分析されたPkd1-7および同腹仔対照マウスの切片。 示されているのは、TFAMの免疫蛍光（IF）染色と、ミトコンドリアにコードされたチトクロームcオキシダーゼ1（mt-Co1）およびミトコンドリアにコードされたATPシンターゼ膜サブユニット6（mt-Atp6）転写産物のRNA蛍光insituハイブリダイゼーション（RNA-FISH）です。 白い矢印は、TFAM、mt-Co1、またはmt-Atp6の発現が大幅に低下した嚢胞内層上皮細胞を示しています。 糸球体はglでマークされています。 TFAMを発現する管状構造は、赤色蛍光によって識別されます。 アスタリスクは、検出可能なmt-Co1およびmt-Atp6転写産物を含む管状上皮細胞を示しています。4'、6-ジアミジノ-2-フェニンドール（DAPI）を核染色（青色蛍光）に使用しました。 バーは、IF画像の場合は= 25 um、RNA-FISH画像の場合は10μmです。 （c）三次元構造化照明顕微鏡。 示されているのは、ロータステトラゴノロバスレクチン（LTL）およびIFのチトクロームcオキシダーゼサブユニット4（COXIV）および電位依存性陰イオン選択性チャネル1（VDAC）発現の組織化学によって分析されたPkd1-7-腎臓の腎臓切片の画像です。 ミトコンドリア（mt）の量は、COXIV染色に基づいてImarisソフトウェアで定量化されました。 矢印は嚢胞内層上皮細胞を示し、番号記号は嚢胞内腔を示し、アスタリスクは非嚢胞性尿細管を示しています。 上皮細胞を裏打ちする嚢胞は破線で囲まれています。 バー= 10μm（左パネル）および3μum（右パネル）。 データは平均±SEMとして表され、スチューデントのt検定*Pを使用して分析されました。<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
の損失かどうかを調べるためにTFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)発現はヒトPKDの一般的な分子的特徴であり、免疫組織化学、IF染色、RNA蛍光insituハイブリダイゼーション、および3DSIMによって5人のADPKD患者からの腎摘出標本を分析しました。 減少TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)免疫組織化学によって分析された腎嚢胞の75.2パーセント±7.5パーセントで発現が観察された。 これは、RNA蛍光insituハイブリダイゼーションによるMT-CO1およびMT-ATP6の発現低下と関連していた（図7a、補足図S10）。 嚢胞内層上皮細胞のmt体積は、3D SIMで評価した場合、約70％減少しました（図7b）。 まとめると、2つのPKDマウスモデルとヒトADPKD組織の分析は、TFAM(標的ミトコンドリア転写因子A)欠乏症とmtの枯渇は、PKD組織でよく見られる所見であり、腎嚢胞性疾患の病因に影響を与える可能性があります。
図7| 多発性嚢胞腎患者の腎嚢胞におけるミトコンドリア転写因子A（TFAM）の発現が低下します。（a）TFAM発現の免疫組織化学、電位依存性陰イオン選択性チャネル1（VDAC）の免疫蛍光（IF）によって分析された、正常なヒト腎臓および多発性嚢胞腎（PKD）患者の腎臓からのホルマリン固定パラフィン包埋切片の代表的な画像）発現、およびミトコンドリアにコードされたチトクロームcオキシダーゼ1（MT-CO1）およびミトコンドリアにコードされたATPシンターゼ膜サブユニット6（MT-ATP6）mRNA発現のためのRNA蛍光insituハイブリダイゼーションにより、矢印は嚢胞内層上皮細胞を識別し、数字記号は嚢胞内腔を示す、およびアスタリスクは糸球体を示します。 バー= 100μm（低倍率画像の場合）および10 um（高倍率画像の場合）（b）VDAC発現についてIFで分析されたヒトPKD腎臓切片の代表的な3-次元構造化照明顕微鏡画像。4'、{ {17}}ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAP1）を核染色（青色蛍光）に使用しました。 破線は尿細管を示し、数字の記号は管状または嚢胞の管腔を示します。 ミトコンドリア（mt）の量は、Imarisソフトウェア（n=5）を使用して定量化されました。 バー=4μm。データは平均±SEMとして表され、スチューデントのt検定を使用して分析されました。* P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
