長い非コードRNA KCNQ1OT1は老化とカロリー制限においてMiR-760を介してプロテインキナーゼCK2を制御する

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1. はじめに

長い非コード RNA (lncRNA) は、タンパク質に翻訳されない 200 ヌクレオチドを超えるサイズの転写物です。 LncRNA は、細胞内の転写制御を含むさまざまな機能を担っています。シスまたトランス、核ドメインの構成、およびマイクロRNA (miRNA) との相互作用 [1–3]。 特に、lncRNA と miRNA の相互作用ネットワークを理解することは、遺伝子の制御機構について新しい視点を提供します。 lncRNAKCNQ1OT1のフルネームはKCNQ1重複転写物 1 は、RNA ポリメラーゼ II によってアンチセンス方向に転写される 91 kb の転写物です。KCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1KCNQ1 遺伝子のイントロン 10 に存在します。 のKCNQ1遺伝子座はヒト 11 番染色体の短腕 (11p15.5) にあります。 G9a と H3K27 ヒストンメチルトランスフェラーゼ PRC2 (ポリコーム抑制複合体 2) のリクルートを通じて、KCNQ1OT1クロマチンと相互作用して複雑な折り畳み構造を形成し、複数の標的遺伝子を沈黙させます。6]。 さらに、KCNQ1OT1さまざまな miRNA (たとえば、miR-760、miR{{1} }a、miR-452-3p、miR-320a、miR-701-3p、miR-2054）、これらはすべて標的遺伝子の発現を制御します[7–13]。 それにもかかわらず、生物の生物学的役割は、KCNQ1OT1老化とカロリー制限（CR）における影響は依然として不明である。

細胞老化は、テロメア短縮、発がん活性化、酸化ストレスなどのいくつかの細胞ストレスによって刺激される、増殖の最終停止です。14,15]。 以前の研究では、2つの触媒( および/または 0 ) サブユニットと 2 つの制御 サブユニット、老化調節因子として。 CK2阻害は、老化関連マーカーを含むいくつかの老化マーカーの発現を誘発します。 -ガラクトシダーゼ (SA-) -gal) アクティビティ [16], p53–p21Cip1/WAF1軸の活性化 [17]、活性酸素種 (ROS) の生成 [18]、老化関連ヘテロクロマチン病巣 (SAHF) の形成 [19]、および老化関連分泌表現型 (SASP) の発現 [20]。 miR-186、miR-216b、miR-337-3p、miR-760はCK2を阻害することで細胞老化を促進します [21,22]。 栄養失調を伴わずに総カロリー摂取量を慢性的に減らすカロリー制限（CR）は、細胞の老化を遅らせる最も効果的な戦略です。23]。 最近、CK2 が CR によって上方制御され、オートファジーを誘導することが報告されました。24]。 しかし、CR 媒介 CK2 アップレギュレーションの根底にある分子機構は依然として不明です。

この研究では、KCNQ1OT1老化と CR が評価されました。KCNQ1OT1ノックダウンはCK2の下方制御を介して老化表現型を促進した ヒトがんの MCF-7 細胞と HCT116 細胞、肺線維芽細胞の IMR-90 細胞に含まれます。 この研究は次のことを示していますKCNQ1OT1CK2を上方制御します 老化および CR 中に miR-760 との相互作用を介して発現することを示唆しています。KCNQ1OT1加齢に伴う疾患の新たな治療標的となる可能性がある。

2. 結果

2.1. KCNQ1OT1 ノックダウンによる SA-活性化 -gal 染色、p53-p21Cip1/WAF1経路、および CK2 を介した H3K9 トリメチル化 ヒトがん細胞のサイレンシング

MCF-7 細胞と HCT116 細胞をトランスフェクトしましたKCNQ1OT1の関与を調べるための siRNAKCNQ1OT1老化の中で。KCNQ1OT1ノックダウン上方制御された SA- -gal活性（図1A)。 さらに、免疫ブロットの結果は次のことを示しました。KCNQ1OT1 ノックダウンp53およびp21のレベルを上方制御したCip1/WAF1、SAHF の特徴 (H3K9 トリメチル化 (H3K9me3) の増加および H3K9 アセチル化 (H3K9Ac) の減少) (図1B)。 CK2 のダウンレギュレーションがこれらの老化マーカー（SA の活性化）を誘導することが以前に報告されています。 -gal 染色、p53-p21Cip1/WAF1経路、および SAHF) [16,17,19]。 そこで、次のことを検討した。KCNQ1OT1CK2と相互作用します。 興味深いことに、異所性 CK2 発現はSA-の誘導を無効にした -gal 活性、p53、p21Cip1/WAF1、および H3K9me3 によって媒介されます。KCNQ1OT1ダウンレギュレーション（図1A、B）。 さらに、KCNQ1OT1 ノックダウンCK2のタンパク質レベルを低下させた （形1B)。 これらの結果を総合すると、次のことが示唆されます。KCNQ1OT1ノックダウンは CK2 を下方制御することにより細胞老化を誘導します。

2.2. KCNQ1OT1 ノックダウンによる SASP 因子発現と CK2 を介した ROS 生成 ヒトがん細胞のサイレンシング

かどうかを調査した。KCNQ1OT1老化細胞が炎症誘発性因子を分泌するという報告により、ダウンレギュレーションにより SASP 因子の発現が増加した [14,15]. KCNQ1OT1ノックダウンは、インターロイキン（IL）を含む SASP 因子の発現を誘導しました-1 、IL-6、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) 3 (図2A). KCNQ1OT1酸化ストレスは老化の主な原因であるため、ダウンレギュレーションにより細胞内 ROS の量が増加しました。14,15]。 この目的のために、HCT116 細胞と MCF-7 細胞をKCNQ1OT1siRNAとCM-Hで染色2DCFDA。KCNQ1OT1フローサイトメトリー中の FL 蛍光の右シフトによって示されるように、ノックダウンにより ROS 産生が増加しました (図2B)。 CK2 のダウンレギュレーションが SASP 発現を誘導することが以前に報告されています。20] と ROS 生成 [18]。 CK2の異所性発現 によって媒介される、SASP 因子の発現と ROS 生成の誘導を無効にします。KCNQ1OT1ダウンレギュレーション（図2A、B）。 まとめると、これらの結果は次のことを示しています。KCNQ1OT1ノックダウンは、CK2 を下方制御することにより ROS の生成と炎症を誘発します。

図 1. KCNQ10T1 ノックダウンは、ヒトがん細胞における CK2x サイレンシングを介した SA--gal 染色、p53-p21CipI/WAF 経路、および H3K9 トリメチル化の活性化を誘導しました。 HCT116 および MCF{{10}} 細胞を、pcDNA3.1.HA-CK2x の非存在下または存在下で 2 日間、KCNO10T1 siRNA でトランスフェクトしました。 (A) 細胞を5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル--D-ガラクトシドで染色し、代表的な画像を倍率20倍で取得しました（上）。 スケールバー=100 うーん。 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 グラフは青色に染色された細胞の割合を表します (下)。 (B) 免疫ブロット法を使用して、特異的抗体を使用して各タンパク質のレベルを決定しました (上)。 3-アクチンを対照として使用しました。グラフは、B-アクチンと比較した各タンパク質の定量を表します (下)。 データは平均 SEM として報告されます。* p < 0.05; ** p < 0.01、** p < 0.001.H3K9me3、ヒストン H3 Lys9 トリメチル化。 H3K9AC、H3 Lys9 アセチル化。

図 2. KCNQ10T1 ノックダウンは、ヒトがん細胞における CK2x サイレンシングを介した老化関連分泌表現型 (SASP) 因子発現と活性酸素種 (ROS) 生成を誘導しました。HCT116 細胞と MCF-7 細胞に KCNO1{ {20}}pcDNA3 の非存在下または存在下で 2 日間 T1 siRNA を投与。1-HA-CK2a。 (A) 各 mRNA のレベルは、特定のプライマーを使用した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) によって決定されました (上)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 グラフは、6- アクチンに対する各 mRNA の定量を表します (下)。 (B) 細胞を 10 UM CM-HDCEDA とインキュベートしました。フローサイトメトリー分析によって蛍光強度を測定しました (上)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 グラフは相対蛍光レベルを示します (下)。データは平均±SEM として報告されます。 * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001。

2.3. KCNQ1OT1はCK2のサイレンシングを介したリポ多糖（LPS）媒介SASP因子発現に関与していた ヒトがん細胞における

LPSによる治療はCK2を下方制御することにより細胞老化を引き起こすため [20]、LPSが下方制御されるかどうかをテストしましたKCNQ1OT1表現。 LPS による治療 (6µg/µL) の転写レベルを低下させたCK2 とKCNQ1OT1ヒトのがん細胞では（図3A)。 さらに、KCNQ1OT1LPS で処理した細胞における SASP 因子の発現について調べました。 ただし、LPS による治療 (6µg/µL) SASP 因子の増加 (IL-1 、IL-6、MMP3) ヒトがん細胞における発現。 pcDNA3 による追加治療。1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140) は、LPS を介した SASP 因子の誘導を無効にしました (図3B)。 miR-760、miR- 186、miR-337-3p、miR-216bの協調作用がCK2のサイレンシングを通じて早期老化を刺激することが以前に示されています。 HCT116 細胞内のタンパク質 [21]、そして miR-760 と miR-186 が複製老化 IMR-90 細胞で上方制御されていたこと[22]。 LPD による処理によって影響を受けるこれらの miRNA の発現パターンが決定されました。 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) 分析により、LPS で処理した HCT116 細胞と MCF-7 細胞の両方で miR-760 の量が 200% 以上増加したことが明らかになりました (6µg/µL)、対照細胞との比較。 miR-186はLPS処理によって上方制御されず、miR-337-3pとmiR-216bはこれらの細胞で異なって制御されました（図）3C)。 したがって、これらの結果は、LPS がダウンレギュレーションを介して miR-760 量を増加させたことを総合的に示しています。KCNQ1OT1、結果として CK2 ダウンレギュレーション媒介老化。

図 3. KCNO10T1 は、ヒトがん細胞における CK2x のサイレンシングを介して、リポ多糖 (LPS) 媒介老化関連分泌表現型 (SASP) 因子の発現に関与していました。 (A) HCT116 および MCF-7 細胞を LPS (6 μg/μL) で 2 日間処理しました。 各 mRNA のレベルは、特異的なプライマーを使用した RI-PCR によって測定されました (上)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 B-アクチンを対照として使用しました。 グラフは、B-アクチンに対する各 mRNA の定量を表します (下)。 (B) 細胞を、pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) の非存在下または存在下で LPS (6 ug/uL) で処理しました。二日間。 各 mRNA のレベルは、特定のプライマーを使用した RI-PCR によって測定されました (左)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータは、3- アクチンがコントロールとして使用されたことを示しています。 グラフは、β-アクチンと比較した各 mRNA の定量を表します (右)。 (C) 細胞を LPS (6 μg/μL) で 2 日間処理しました。総 RNA を細胞から単離し、PCR 分析に供して miR-760、miR-186、miR{{ 26}}p、および miR-216b は正規化に RNU48 を使用します。 データは平均値±SEMとして示されています。 *p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001。

2.4. KCNQ1OT1 上方制御された CK2 ヒト癌細胞内の miR-760 をスポンジングすることにより

次に、KCNQ1OT1CK2を調節する miR-760 による式。 HCT116 および MCF-7 細胞に、pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181-37,140) または KCNQ1OT1 siRNA を、miR-760 模倣体または阻害剤とともにトランスフェクトしました (配列は補足表 S1 に示します)。 の異所性発現KCNQ1OT1(36,181–37,140) の mRNA レベルが増加しました。CK2 一方、miR-760 模倣物による追加治療は抑制されましたKCNQ1OT1-媒介CK2 アップレギュレーション（図4A)。 対照的に、KCNQ1OT1ノックダウンによりmRNAレベルが低下CK2 一方、miR-760 阻害剤による追加治療は抑制を抑制しましたKCNQ1OT1ノックダウン媒介型CK2 ダウンレギュレーション（図4B)。 miR-760 模倣物と阻害剤は両方とも、KCNQ1OT1これは、miR-760 が上流のレギュレーターではなかったことを示しています。KCNQ1OT1。 まとめると、これらの結果は次のことを示しています。KCNQ1OT1の量が増えますCK2 miR-760をスポンジングすることによるmRNA。 補足図S1は、次の配列と結合部位を示しています。KCNQ1OT1、miR-760、およびCK2 mRNA、TargetScan と Miranda を使用して決定。

図 4. KCNQ10T1 は、ヒトがん細胞内の miR-760 をスポンジングすることにより CK2x を上方制御しました。 (A) HCT116 細胞と MCF-7 細胞を、pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) で 2 日間トランスフェクトしました。 miR-760の有無。 (B) HCT116 および MCF-7 細胞を、miR-760 阻害剤の非存在下または存在下で 2 日間、KCNO10T1 siRNA でトランスフェクトしました。 各 mRNA のレベルは、特異的なプライマーを使用した RT-PCR によって測定されました (上)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 グラフは、B-アクチンに対する各 mRNA の定量を表します (下)。 データは平均±標準誤差として報告されています。 * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001。

2.5. CR 状態 ヒトがん細胞における miR-760 による CK2x の上方制御 KCNQ1OT1 の上方制御による下方制御

CR 条件では CK2x mRNA のレベルが上方制御されていたため、KCNQ1OT1 発現は CR 条件で上方制御されていると考えられました [24]。 この仮説を検証するために、HCT116 細胞と MCF-7 細胞を CR 条件でインキュベートしました。 図5Aに示すように、これらの細胞ではKCNO10T1およびCK2xの発現がCRによって誘導され、KCNQ10T1 siRNAによる追加処理によりCR媒介CK2a誘導が抑制されたことから、KCNQ10T1がCR条件におけるCK2xの正の制御因子であることが示された。 さらに、リアルタイム qPCR による分析では、CR 条件では miR-760 のレベルが 70% 減少する一方、miR-186、miR-216b、miR{{22} のレベルは低下したことが示されました。 CRconditions の }}p は変化しないか増加しました (図 5B)。 次に、CR媒介CK2xアップレギュレーションに対するmiR-760の効果を調べた。 miR-760による治療はeoCR媒介CK2x上方制御を模倣し、miR-760がCK2ain CR状態の主要な負の制御因子であることを示している（図5C）。 最後に、リアルタイム gPCR 分析により、KCNO10T1 siRNA による処理により miR-760 のレベルが増加するのに対し、CR は KCNO10T1 ノックダウン媒介 miR-760 の誘導を抑制したことが明らかになりました (図 5D)。 まとめると、これらの結果は、CR が KCNQ10T1 を上方制御することによって miR-760 を下方制御し、その結果、ヒト癌細胞において CK2x の上方制御を引き起こしたことを示しています。 lncRNA SNHG6 は、CRC 細胞内の miR-760 のスポンジ [25]、CRが上方制御するかどうかをテストしましたSNHG6の発現。 しかし、SNHG6CR 条件では式は変化しませんでした (データは示されていません)

図 5. ヒトがん細胞におけるカロリー制限 (CR) 条件は、KCNO10T1 アップレギュレーションを介した miR-760 ダウンレギュレーションによって CK2x をアップレギュレートしました。 (A、C、D) HCT116 および MCF-7 細胞を KCNO1{{20}}T1 siRNA (A および D) または miR-760 (C) で 1.5 日間トランスフェクトしました。その後、CR 条件下で 7 時間インキュベートしました。 (B) HCT116 細胞と MCF-7 細胞を CR 条件下で 7 時間インキュベートしました。 (A、C) 各 mRNA のレベルは、特定のプライマーを使用した RT-PCR によって決定されました (上) 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 3-アクチンは、B-アクチンに対する各 RNA の定量を表す対照グラフとして使用されました (下)。 (B、D) 全 RNA を細胞から単離し、正規化のために RNU48 を使用した qPCR による分析を行って、表示された miRNA の相対レベルを決定しました。データは平均値と SEM を加えたものとして示されています * y < 0.05.*p < 0.01;** * p < 0.001。

2.6. KCNQ1OT1はヒト肺線維芽細胞の複製老化中にダウンレギュレートされ、CR状態が回復した

CK2x は複製老化細胞や老化組織で下方制御されるため [16]、ヒト肺線維芽細胞 IMR-90 細胞の老化中に KCNO1OT1 が下方制御されるかどうかを調べました。 KCNO10T1 ノックダウンにより、CK2xin IMR-90 細胞の mRNA レベルが減少しました (図 6A)。 逆に、KCNO1OT1 ノックダウンは IMR-90 細胞における SA-P-gal 活性を上方制御し、CK2a の異所性発現は KCNO1OT1 下方制御によって媒介される SA-3- gal 活性の誘導を無効にしました (図 6B)。 KCNQ10T1発現が複製老化によってどのように減少するかを調べるために、老化に似た状態が観察されるまでIMR-90細胞を繰り返し継代しました。 PDL 47 のほとんどの細胞は SA-B-gal に対して陽性に染色されましたが、継代初期 (PDL 34) の細胞では SA-B-gal に対して陽性に染色された細胞はほんのわずかでした (データは示さず)。 KCNO10T1の転写レベルは、継代初期（PDL 34）細胞と比較して、複製老化細胞（PDL 47）では60パーセント減少しており、KCNO10T1が複製老化中に下方制御されていることを示しています。 最後に、CR 条件では、通常のカロリー条件と比較して、継代初期 (PDL 34) 細胞で KCNO1OT1 が 150% 増加しました。 しかし、CR 条件では、通常のカロリー条件と比較して、複製老化細胞 (PDL 47) において KCNO10T1 がより強く (250%) 増加しました。 これは、CR が複製老化によって媒介される KCNO10T1 および CK2x の発現低下を救済できることを示しています (図 6C)。 まとめると、これらのデータは、複製老化が KCNQ10T1 の下方制御を介して CK2x 発現を減少させ、CR が KCNO1OT1-CK2 軸を介して複製老化を抑制できることを示しています

図 6. KCNQ1011 はヒト肺線維芽細胞の複製老化中に下方制御され、カロリー制限 (CR) 条件によって回復することができました。 (A) IMR-90 細胞 (PDI36) に KCNO10 T1 siRNA をトランスフェクトしました。 各 mRNA のレベルは、特異的なプライマーを使用した RT-PCR によって測定されました (上)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータを示します。3-アクチンをコントロールとして使用しました。 グラフは、6- アクチンに対する各 mRNA の定量を表します (下)。 (B) IMR-90 細胞 (PDL 36) を、pcDNA3.1-HA-CK2a の非存在下または存在下で 2 日間、KCNO10T1 siRNA でトランスフェクトしました。 細胞は5-ブロモ-4-クロロ3-インドリル--D-ガラクトシドで染色され、代表的な画像が20倍の倍率で得られました（左）スケールバー= 100 um 。 3 つの独立した実験からの代表的なデータが示されています。 グラフは青く染色された細胞の割合を表します (右)。 (C) PDL 34 および PDL 47 の IMR-90 細胞を CR 条件下で 7 時間インキュベートしました。 各 mRNA のレベルは、特定のプライマーを使用した RT-PCR によって測定されました (左)。 3 つの独立した実験からの代表的なデータを示します。3-アクチンを対照として使用しました。 グラフは、6- アクチンに対する各 mRNA の定量を表します (右)。 データは平均土 SEM として報告されます。* p < 0.05、** p < 0.01; *** p < 0.001。 (D) 老化と CR に対する KCNO10T1 の役割を示す考えられるモデル。 PDL、人口倍増レベル