長い非コードRNA KCNQ1OT1は老化およびカロリー制限ⅡにおいてMiR-760を介してプロテインキナーゼCK2を制御する

3. ディスカッション

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 ヌクレオチド)、およびより小さい miR.NA (21-25 ヌクレオチド) [1-3]。 KCNO10T1 は当初、クロマチンの高次構造 (4 61 の確立を介して kcng1 遺伝子座内のいくつかの遺伝子をサイレンシングする lncRNA として同定されました。最近では、他のKCNO1OT1の生物学的機能に関連するものも含めて報告されています。線維症,脳虚血,脳卒中アテローム性動脈硬化症, 発癌, 骨形成分化, 骨折の治癒、 と心肥大(7-13)。 しかし、KCNO10T1 が細胞老化と CR を調節する詳細な機構はまだ不明です。 そこで、KCNO10T1が老化やCRに関与しているかどうかを明らかにすることを試みた。 この研究は、KCNO10T1 ノックダウンが、SA{7}}gal 活性の誘導、p53-21Cip1/WAF1 経路の活性化、SAHF 形成に必要な H3K9 トリメチル化の増加、SASP 因子 (L{{ヒト癌 HCT116 および MCF-7 細胞における、13}}、IL-6、および MMP3) の発現 (図 1 および 2A)。 酸化ストレスは老化の重大な原因であるため (14,15、ROS 生成に対する KCNO10T1 の効果が調査されました。予想どおり、KCNO1OT ノックダウンにより、HCT116 および MCF-7 細胞の細胞内 ROS が増加しました (図 2B)。さらに、KCNO10T1 のレベルはLPS 誘導性老化細胞では mRNA が減少し、KCNQ10T1 の異所性発現によりこれらのがん細胞における LPS 媒介 SASP 因子発現が抑制されました (図 3A、B) さらに、KCNO10T1 ノックダウンはヒト肺線維芽細胞 IMR における SA-B-gal 活性を誘導しました{ {39}} 細胞では、KCNO10T1 発現が IMR-90 細胞の複製老化中に減少しました (図 6)。これらの結果を総合すると、KCNO10T1 がアンチエイジング試薬と抗酸化物質人間のがん細胞は線維芽細胞にくっついています。

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Ck2 ノックダウンは、SA-gal 染色 [16]、p53-p21Cip1/WAF1 経路 (171ROS 生成 [18SAHF 形成 (191)、および SASP 因子発現 20]) の活性化などの老化マーカーを誘導することが以前に示されています。 KCNO10T1 と CK2 の関係を調べました。この研究は、CK2x の過剰発現が、KCNO10T1 ノックダウンによって引き起こされるこれらの老化マーカーを無効にすることを示しました (図 1、2、および 6B)。さらに、KCNO10T1 ノックダウンは、CK2x のタンパク質および mRNA レベルを低下させました (図 1B、2A、および 4B)。 )、KCNO10T1 (36,181-37,140) の過剰発現は CK2x の mRNA レベルを刺激しました (図 4A)。このことは、KCNQ1OT1 が細胞内で CK2a の正の制御因子として機能していることを示しています。標的 mRNA (1-3] の発現。以前の研究で、miR-760 が CK2a (21,22] および KCNO10T1 [27]) と相互作用することが示されているため、KCNO10T1、CK2x、および miR{{この研究は、miR-760 模倣物による追加治療が KCNQ10T1- 媒介 CK2x 上方制御を抑制し、miR-760 阻害剤による追加治療が KCNO10T1 ノックダウン媒介 CK2 を抑制することを示しています。下方制御 (図 4)。 一貫して、KCNO10T1 発現を減少させる LPS での治療により、miR-760 のレベルが増加しました (図 3C)。 したがって、これらの研究は、KCNQ1OT1 RNAの量がmiR-760を調整し、それによってCK2xのmRNAに結合するmiR-760の利用可能性を調節できることを示唆しています。 KCNO1OT1 と CK2a は、miR-760 結合をめぐって競合する転写産物の能力を通じてクロストークする可能性があります。

CR が提供するのは、アンチエイジング効果(23]、CR がどのように KCNQ1OT1 および miR-760 を制御するかを調べました。この研究は、CR 条件が KCNO10T1 および CK2x の発現を増加させ、miR-760 のレベルを低下させたことを示しています (図 5A、B)。 miR-760 模倣物による処理は CR 媒介 CK2x アップレギュレーションを抑制しました (図 5C)。一貫して、KCNO10T1 ノックダウンは miR-760 のレベルを増加させましたが、追加の条件では KCNQ10T1 ノックダウン媒介 miR{{19} を抑制しました最後に、CR 条件は、複製老化を介して、KCNO1OT1 および CK2a の発現低下を回復しました (図 6C)。まとめると、これらの結果は、CR 条件が KCNO10T1 の上方制御を介して miR-760 を下方制御することを明らかにしました。 lncRNA SNHG6 は CRC 細胞において miR のスポンジとして機能しますが [25]、CR は実験条件下で SNHG6 発現を変化させませんでした (データは示されていません)。CR はどのようにして KCNQ1OT1 を上方制御しますか他のグループは、転写因子 NFY および -catenin が KCNO10T1 を調節することを以前に実証しました (28,29]。 しかし、少なくとも実験条件下では、CR は NF-Y および B-カテニンの発現を調節できませんでした (データは示さず)。 したがって、CR 状態における KCNO10T1 の特異的な上流制御因子を同定するには追加の研究が必要です。

結論として、この研究の結果に基づいて、老化と CR における KCNQ1OT1 の役割のモデルが提案されました。 KCNQ1OT1 は、miR-760 をスポンジングすることで CK2 を上方制御します。 KCNQ1OT1-miR-760-CK2 経路は老化と CR に関与しています。 LPS 処理と線維芽細胞の細胞分裂は、KCNQ1OT1 を下方制御することによって老化を誘導します。 CR は、KCNQ1OT1-miR-760-CK2 経路を活性化することにより老化を抑制します (図 6D)。 したがって、この研究は、KCNQ1OT1が老化および加齢関連疾患の新規治療標的であること、およびCRの効果を模倣する代替治療法であることを示唆しています。

4. 材料と方法

4.1. 材料

4.2. 細胞培養とCR

ヒト二倍体線維芽細胞のIMR-90細胞は、American Type Culture Collection（ATCC、米国バージニア州マナサス）から集団倍加レベル（PDL）24で入手しました。ヒト乳がんMCF-7細胞、結腸癌 HCT116 細胞 (ATCC) および IMR-90 細胞を、10 パーセント (v/v) のウシ胎児血清と 1 パーセント (v/v) のペニシリン - ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で、加湿雰囲気下で培養しました。 37 °C で 95 パーセント (v/v) の空気と 5 パーセント (v/v) の CO2。 IMR-90 セルの PDL は、式 PD=log(Nf/Ni)/log2 を使用して計算されました。ここで、Nf は最終的なセル数、Ni は播種されたセルの初期数です。 細胞飢餓（カロリー制限）の場合、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、アミノ酸を含まない5.5 mMグルコースを含むアール平衡塩類溶液（Thermo Fisher、米国マサチューセッツ州ウォルサム）中で7時間培養しました。

4.3. RNA 抽出と miRNA 定量的リアルタイム PCR

4.4. DNA トランスフェクションと RNA 干渉

4.5. さ～ -gal 活性アッセイ

サブコンフルエント培養中の細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、PBS中の3パーセント（v/v）ホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、染色してインキュベートしました。 1 mg/mL 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル -D ガラクトシド、40 mM クエン酸-リン酸ナトリウム (pH 6.0)、5 mM フェリシアン化カリウム、5 mM フェロシアン化カリウムを含む溶液150 mM NaCl、および 2 mM MgCl2、37 °C で 24 時間。 青色に染色された細胞を倍率 400 倍で少なくとも 10 視野で計数し、陽性細胞のパーセンテージとして表しました。

4.6. 細胞内ROSレベルの測定

酸化感受性蛍光プローブ CM-H2DCFDA を使用して ROS レベルを評価しました。 細胞を 5 μM C​​M-H2DCFDA で暗所、37 °C で 20 分間処理しました。トリプシン処理により剥離し、PBS で洗浄しました。 蛍光強度が抑制されたCoulter Elite ESP Cell Sorter (Beckman Coulter Inc.、ブレア、カリフォルニア州、米国) を使用してマイニングされました。 の死んだ細胞を分析から除外するために、前方散乱ゲートと側方散乱ゲートを設定しました。 少なくともゲート内の 10,000 個のイベントがサンプルごとに取得されました。

4.7. 逆転写 (RT)-PCR

4.8. イムノブロッティング

4.9. 統計分析

データの一元配置分散分析テストは、SPSS パッケージ プログラム (IBM、ニューヨーク州アーモンク、米国) を使用して実行されました。 p 値が次の場合、結果は有意であるとみなされました。<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05. 

補足資料: 次のサポート情報は次の場所からダウンロードできます。

著者の貢献: Y.-SB が実験を考案および設計し、YL が実験を実行し、Y.-SB が論文を執筆しました。 すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

資金提供: この研究は、科学・情報通信・未来計画省(NRF-2019R1A2C1005219)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)を通じて、基礎科学研究プログラムによって支援されました。

治験審査委員会の声明: 該当なし。

インフォームドコンセント声明: 該当なし。

データの可用性に関する声明: 適用されません。

利益相反: 著者は利益相反がないことを宣言します。

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