縦断的免疫プロファイリングにより、回復期の新型コロナウイルス-19における長期的な体液性免疫を媒介する優勢なエピトープが明らかになった

背景: 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、病原性が高く伝染性の高いコロナウイルスであり、これまでに 520 万人が死亡する世界的なパンデミックを引き起こしました。 長期免疫の血清学的特徴、特にSARS-CoV-2感染後の持続的な抗体反応を媒介する優性エピトープに関する疑問は、まだ解明されていない。

客観的: 私たちは、2019 年コロナウイルス病 (COVID-19) 患者における免疫応答の動態と寿命、および SARS-CoV-2 に対する持続的な長期液性免疫に関与するエピトープを分析することを目的としていました。

メソッド: 私たちは、主に新型コロナウイルスの中等度の症状を経験した 31 人を対象に、発症後 180 ～ 220 日までの SARS-CoV-2 の免疫動態を評価し、次に、主に中程度の症状を引き起こす主要なエピトープのプロテオームワイドなプロファイリングを実行しました。持続的な体液性免疫反応。

結果: 縦断的解析により、新型コロナウイルス-19患者における持続的なSARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的抗体と中和抗体、およびSARS-CoV-2感染後の初期段階でのサイトカイン産生の活性化が明らかになりました。 長期の抗体応答を媒介できる高反応性エピトープは、スパイクタンパク質と ORF1ab タンパク質に位置することが示されました。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の主要なエピトープは、S1 サブユニットと S2 サブユニットの N 末端ドメインにマッピングされ、風土病のヒトコロナウイルス間で程度の異なる配列相同性と、初期 SARS コロナウイルス間の高い配列同一性を示しました。 CoV-2 (武漢-湖- 1) と現在流行している変異種。

カンサスサプリメントの利点 - 免疫システムを強化する方法

結論: SARS-CoV-2 感染は、スパイクに位置する優性エピトープと長期免疫応答を媒介する ORF1ab タンパク質を標的とすることにより、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の回復期の個人に持続的な体液性免疫を誘導します。 私たちの発見は、合理的なワクチン設計と診断開発を支援する道を提供します。 (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41)

キーワード:

SARS-CoV-2、COVID-19、長期免疫応答、体液性免疫、プロテオームワイドペプチドマイクロアレイ、ドミナントエピトープ

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV- 2) は、現在進行中のコロナウイルス感染症 2019 (COVID-19) パンデミックの原因病原体であり、他の 2 つの既知の高病原性ヒトウイルスを含むベータコロナウイルス属に属しています。コロナウイルス: 重症急性呼吸器症候群 (SARS) および中東呼吸器症候群 (MERS) のコロナウイルス。1 2019 年 12 月下旬に最初に記録された症例が発生して以来、SARS-CoV-2 感染により 2 億 6,300 万人以上が感染しました。 2021 年 11 月の時点で、世界中で感染者が確認され、520 万人が死亡しており、5 大陸の 220 の国と地域が影響を受けています2。感染後の臨床症状は、無症候性感染、軽度または中等度の症状、さらには生命を脅かす重度の肺炎など、多岐にわたります。3複数のタイプのワクチンアプローチが利用可能になっているにもかかわらず、多くの国は依然として感染の新たな波を封じ込めるのに苦労しており、感染力の増加と抗ウイルス免疫反応に対する耐性を示すと思われるウイルスの変異体が出現している。 中和抗体によって媒介される効果的な体液性免疫応答は、感染をブロックし、ウイルス病原体を排除するための強力かつ不可欠な適応免疫を備えている必要があります。 SARS-CoV-2 感染後、発症後 7 ～ 14 日で、感染者の間で高い率 (90% 以上) の強力な血清変換が観察されました。4-6 抗原特異的な IgA、IgG、そして、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質（S）とヌクレオカプシドタンパク質（N）を認識するIgMは、病気の急性期と回復期の初期段階で検出可能でした。4,5,7中和抗体の大きさは、年齢、症状のある感染症、疾患の重症度に関連している可能性があります。 重篤な新型コロナウイルス感染症-19の症状を示している高齢の患者や個人は、より高レベルの中和抗体を発現する傾向があります。4、8-10 抗体反応の寿命に関するいくつかの研究により、ウイルスに対する血清/血漿の反応性が失われたにもかかわらず、一部の症候性の新型コロナウイルス感染症-19の症例では、時間の経過とともに抗原の減少と中和抗体力価の低下が見られ、新型コロナウイルス感染症-19の回復期患者では、感染後最長8～12か月間、全体的な長期体液性免疫の持続的なレベルが観察されました。 .10-13 さらに、SARS-CoV-2 抗原特異的メモリー B 細胞の数は、発現する B 細胞クローンの継続的な選択と蓄積とともに、少なくとも 6 ～ 12 か月間安定していました 12,13。中和抗体12,14は、SARSCoV-2感染後の持続的な体液性免疫の維持を示しています。

カンサスサプリメントの利点 - 免疫力の向上

中和抗体はウイルス感染に対する宿主防御において基本的な役割を果たします。 SARS-CoV-2 の非常に強力なモノクローナル抗体のパネルが特定されました。これは主に、ビリオン表面上で三量体に集合してウイルスの侵入を促進する S タンパク質の受容体結合ドメインに位置するエピトープを標的としています15-17 S1 サブユニットおよび S2 サブユニットの N 末端ドメイン (NTD) を含む S タンパク質の他の領域にも、中和抗体を誘導できる免疫原性エピトープが含まれています。16 ,19,20 SARS-CoV-2 の抗体は、中和に加えて、ナチュラルキラー細胞によって引き起こされる抗体依存性の食作用や単球またはマクロファージによる抗体依存性の細胞傷害など、Fc 媒介のエフェクター機能を介して in vivo での保護を与える可能性があります。 21,22 ウイルス感染と戦うことに加えて、自然感染やワクチン接種によって生成された抗体は、抗原/抗体免疫複合体形成による炎症活性化やウイルス感染力の増強、または Fc 依存性機能によってウイルスの発症を促進する可能性があります。23-25ただし、ウイルス感染の増強は生体内での SARS-CoV-2 では観察されていません。 抗体応答のこれらの多様な役割により、SARSCoV-2 エピトープの体系的な特徴付けと、中和エピトープまたは非中和エピトープを標的とする長期持続抗体の特性が必要になります。 SARS-CoV-2感染後の抗体反応の動態と期間に関する最近の進歩にもかかわらず、長期の体液性免疫反応を維持する顕著なエピトープに関する縦断的分析は依然として限られています。 これまでの研究では、主に ELISA ベースのアッセイ、26,27 ファージまたは細菌ディスプレイベースのアプローチ、28-31、およびマイクロアレイ ベースの技術を使用して、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) に感染した個人における抗体反応のエピトープのプロファイリングが行われてきました。30、{{ 38}} SARS-CoV-2 S タンパク質のいくつかの免疫優勢エピトープが同定されています。 最も頻繁に検出された領域は、S2 サブユニットの融合ペプチド (FP) の近くまたはそれにまたがってマッピングされ、S2 サブユニット内および S1 サブユニットの C 末端ドメイン上の 2 番目の 7 アミノ酸配列がマッピングされていました。26、28-30、 32,33 さらに、血清学的スクリーニングにより、N タンパク質、膜 (M) タンパク質、ORF1ab、ORF3a、ORF7a など、SARS-CoV-2 プロテオーム全体の他のタンパク質に位置するエピトープも明らかになりました。28-30、 34,35 これまでの研究は抗原性エピトープに関する重要な洞察を提供していましたが、これらの研究は主に回復期初期の新型コロナウイルス-19患者のエピトーププロファイリングに焦点を当てていました。 耐久性のある SARS-CoV-2 特異的抗体応答を媒介する正確なエピトープとエピトープ認識の動態はまだ解明されていません。 ここでは、新型コロナウイルス-19患者における体液性免疫反応の動態と寿命、特にSARS-CoV-2に対する長期持続免疫に関与するエピトープについての理解を深めるために、包括的な縦断分析を実施しました。 31人の新型コロナウイルス-19患者における、症状発現後180〜220日以内の免疫プロファイリングの結果。 抗原結合抗体および中和抗体、ならびに血清サイトカインレベルの評価に基づいて、ペプチドを使用して持続的な体液性免疫応答を媒介する、SARSCoV-2 の ORF1ab、S、および N タンパク質に位置するエピトープのパネルをさらに特定しました。 SARS-CoV-2の完全なプロテオームを含むマイクロアレイ。 私たちの結果は、ウイルス感染を克服するための長期免疫の特徴を明らかにし、合理的なワクチン設計や改良された血清学的診断ツールの開発に役立つでしょう。

方法

研究参加者とサンプル収集

SARS-CoV-2 による免疫反応の動態を長期的に評価するために、南通大学付属南通第三病院に入院した SARS-CoV-2 感染者 31 人から 101 個の血清サンプルが収集されました（南通市） 、中国）2020年1月から3月にかけて。患者は全員、逆転写定量的PCR検査によりSARS-CoV-2感染が確認されたと診断された。 中華人民共和国国家衛生健康委員会が発表した新型コロナウイルス肺炎の診断および治療プロトコルのバージョン7に従って、疾患の重症度は軽度から中等度（非重症）または重度の新型コロナウイルス-19と定義されました36。患者は追跡調査されました。急性感染症からの回復後、4～8か月間持続的に回復します。 血液サンプルは、31 人の研究参加者のうち 20 人の患者を対象に、症状発現後 4 日から 219 日まで長期的に収集されました (1 人あたり中央値 4.5 サンプル、範囲は 2 ～ 8)。一方、各時点で単一時点のサンプリングが行われました。他の11人は回復期後期（発症後122日から214日）にあった。 したがって、年齢と性別が一致した健康なドナーからの血清 (n 5 20) も対照群として含まれました。 研究参加者には、以前に SARS または MERS に感染したことが記録されている者はいなかった。

この研究は、南通大学付属南通第三病院の倫理委員会によって承認されました（承認EL2020006）。 各研究参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 血清は、遠心分離によって血清ゲルチューブ中の末梢血から分離され、アリコートに形成され、使用前に２８０℃で保存された。

細胞株

HEK293T 細胞と Huh7 細胞を、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (Gibco)、100 U/mL ペニシリン (Gibco)、および 100 mg/mL を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (Gibco; Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) で培養しました。 5% CO2、378℃で mL のストレプトマイシン (Gibco)。

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ELISAによるIgG抗体の検出

ヒト血清サンプル中の抗原結合 IgG 抗体のレベルは ELISA によって測定されました。 96 ウェル ELISA プレート (Corning、ニューヨーク州コーニング) を SARS-CoV-2 ヌクレオカプシドタンパク質 (Sino Biological、北京、中国、カタログ番号 40588-V08B) でプレコートしました。 、50 ng/ウェル）またはスパイクタンパク質（Sino Biological、40589-V08B1、100 ng/ウェル）、SARS-CoV スパイクタンパク質（Sino Biological、40634-V08B、100 ng/ウェル）ウェル）、または MERS-CoV スパイクタンパク質（Sino Biological、40069-V08B、ウェルあたり 50 ng）を 48℃ で一晩投与します。 0.05% Tween 20 を含むリン酸緩衝食塩水 (PBS) 中の 5% 無脂肪乳 (PBS-T) で 378℃ で 2 時間ブロッキングした後、開始希釈 1 で段階希釈した熱不活化血清サンプルを 3- 倍します：２００をプレコートプレートに添加し、３７℃で２時間放置した。 各ステップの間にウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。 西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗ヒト IgG 抗体 (Abcam、ケンブリッジ、英国、1:100、000 希釈) と 378℃ で 1 時間インキュベートし、その後テトラメチルベンジジン基質 (Life Technologies、カールスバッド) を添加することで、反応を視覚化しました。 、カリフォルニア）。 進行中の反応を 2 mol H2SO4 で停止し、補正波長を 630 nm に設定して 450 nm で吸光度を測定しました (OD450 2 OD630)。 結合抗体のエンドポイント力価を計算するために、曲線の直線部分 (y 5 kx 1 b) 内で血清希釈の log10 対補正光学濃度 (OD) 値 (OD450 2 OD630) をプロットすることでデータを直線化しました。 、ｒ２＞０．９９）、調整されたＯＤ値（ＯＤ｛｛５８｝｝ＯＤ６３０）｛｛６０｝｝がエンドポイント力価を与えるために計算された血清希釈度。 ペプチド免疫化マウスの抗原特異的 IgG 抗体は、ペプチドベースの ELISA によって評価されました。 簡単に説明すると、96- ウェル ELISA プレート (Thermo Fisher Scientific) を、炭酸緩衝液 (pH 9.6) 中の 4 つの混合ペプチド (ペプチド 318、356、510、および 530) 1 ウェルあたり 1 mg で 48℃ で一晩コーティングしました。 ５％無脂肪乳を含むＰＢＳ−Ｔでブロッキングした後、ウェルを１：４０に希釈した血清サンプルとともに３７℃で１時間インキュベートした。 続いて、プレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウス IgG 抗体 (Abcam) とともにインキュベートしました。 反応はテトラメチルベンジジン基質 (Life Technologies) で視覚化し、2 mol H2SO4 で反応を停止した後、450 nm での吸光度を測定しました。

シュードウイルスの生成と滴定

SARS-CoV-2 (NC_045512) または C 末端 19 aa 欠失のある SARS-CoV (AY291315.1) スパイクタンパク質、または MERS-CoV (JX{{10) をコードするコドン最適化遺伝子}}) C 末端 16 aa で切断されたスパイクタンパク質を、それぞれ pcDNA3.1(1) ベクターにクローニングしました。 100 mm 組織培養ディッシュで培養した HEK 293T 細胞に、スパイクタンパク質をコードするプラスミド 1 mg と env 欠損ルシフェラーゼ発現バックボーン (pNL4-3.luc.RE) 15 mg を、ポリエチレンイミン (Polysciences 、ペンシルバニア州ウォリントン）。 シュードウイルスを含む細胞培養上清をトランスフェクションの48時間後に収集し、濾過し、アリコートで280℃で保存した。 ウイルス力価（50％組織培養感染量）を決定するために、シュードウイルスの段階希釈物を、96-ウェルプレートにあらかじめ播種した1 3 104Huh7細胞に加えました。 感染の 12 時間後、ウイルスを含む培地を新鮮な増殖培地に交換し、細胞をさらに 48 時間培養しました。 細胞溶解のルシフェラーゼ活性は、マイクロプレートリーダー (BioTek Instruments、バーモント州ウィヌースキー) を使用して Steady-Glo ルシフェラーゼ アッセイ システム (ウィスコンシン州マディソン、プロメガ) で測定し、平均バックグラウンド値の 10 倍を超える相対発光単位を生成するウェルを考慮しました。ポジティブ。

シュードヴィrus中和アッセイ

新型コロナウイルス-19患者または健康なドナーからの熱不活化血清サンプルを2-倍段階希釈し、組織培養感染量50%の200シュードウイルスとともに37℃で1時間インキュベートしました。 次に、混合物を適用して、96-ウェルプレートに事前に播種したHuh7細胞を二重に感染させました。 感染後 12 時間でウェルに新鮮な増殖培地を補充し、48 時間後に細胞のルシフェラーゼ活性を測定しました。 SARS-CoV-2 および SARS-CoV シュードウイルスに対する 50% 中和力価 (NT50) は、GraphPad Prism 8.0 ソフトウェア (GraphPad Software、カリフォルニア州ラホーヤ) を使用した非線形回帰によって計算されました。 そして、MERS-CoV偽ウイルスのNT50は、血清サンプルを適用せずにウイルス対照と比較して相対発光単位の50％減少をもたらす血清の最高希釈として定義された。

タンパク質マイクロアレイベースのサイトカイン検出

複数のサイトカインの定量的測定（IL-1a、IL-1b、IL- 4、IL-6、IL-8、IL-10 、IL-13、MCP-1、IFN-g、およびTNF-α）の血清サンプル中の分析は、マルチプレックスELISAアレイ（RayBiotech、ジョージア州ピーチツリーコーナーズ）を使用して、製造元のプロトコールに従って実施されました。 簡単に説明すると、サイトカイン特異的抗体でプレコートしたスライドガラスをサンプル希釈液で室温で30分間ブロックし、続いて60 mLの2-倍希釈した血清サンプルまたはサイトカイン標準希釈液を加えました。 48℃で一晩インキュベートした後、スライドを5回洗浄し、80 mLのビオチン化検出抗体カクテルで染色し、次にCy3同等の色素結合ストレプトアビジンで室温で1時間染色した。 蛍光強度は、InnoScan 300マイクロアレイスキャナー(Innopsys、イリノイ州シカゴ)により532nmで検出され、データはQ-Analyzerソフトウェア(RayBiotech)により分析された。

ペプチド合成とウシ血清アルブミンとの結合

SARS-CoV-2 プロテオームをカバーする合計 515 個のペプチド (長さ 15 aa、11 aa 重複) が、SARS-CoV のアミノ酸配列に基づいて GL Biochem (中国、上海) によって合成されました。 -2株武漢胡-1。 製造業者の指示に従って、架橋剤Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific)を使用して、ペプチドをウシ血清アルブミン(BSA)と結合させた。 簡単に説明すると、スルホ-SMCCをBSAに対して30-倍モル過剰で添加し、続いてPBSに透析した。 続いて、システインを含むペプチドを1:1(wt/wt)の比率で添加し、2時間インキュベートし、さらにPBSで透析して遊離ペプチドを除去した。

ペプチドマイクロアレイの作製

ペプチドマイクロアレイ、SARS-CoV-2のペプチド、ならびにネガティブコントロール（BSA）およびポジティブコントロール（抗ヒトIgGおよび抗ヒトIgM抗体; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）を準備するには、スーパーマラソンプリンター（Arrayjet、エディンバラ、スコットランド、英国）を使用して、PATH基板スライド（Grace Bio-Labs、オレゴン州ベンド）上に三重に固定化しました。 次いで、ペプチドマイクロアレイを、さらなる使用のために２８０℃で保存した。

カンクサ-免疫システムを改善する

マイクロアレイベースのエピトープマッピング

マイクロアレイベースの血清分析は、Li et al.37 の方法に若干の変更を加えて実施されました。 同一のサブアレイ用に個別のチャンバーを作成するために、14- チャンバーのゴム製ガスケットを各ペプチド マイクロアレイ スライドに取り付けました。 使用前にスライドアレイを室温まで温め、その後、PBS-T中の3% BSAで3時間ブロックした。 新型コロナウイルス-19患者からの血清サンプル、または2人の0人の健康なドナー（対照群）からのプール血清を、ほとんどのサンプルでPBS-Tで1:200に希釈し、各サブアレイとともに2時間インキュベートしました。 48℃。 アレイを PBS-T で洗浄し、1:1000 希釈の Cy3- 結合ヤギ抗ヒト IgG および Alexa Fluor 647 結合ロバ抗ヒト IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories、ペンシルバニア州ウェストグローブ) とインキュベートしました。室温でそれぞれ1時間。 インキュベーション後、アレイを PBS-T で洗浄し、室温で遠心分離して完全に乾燥させました。 続いて、LuxScan 10K-A マイクロアレイ スキャナー (CapitalBio、北京、中国) を使用してアレイをスキャンし、FL 蛍光強度データを取得し、GenePix Pro 6.0 ソフトウェア (Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール) によって分析しました。

図1. 新型コロナウイルス-19患者における抗体反応の縦断的動態。 研究デザインの概略図。 合計 31 人の SARS-CoV-2 感染者と 20 人の健康なドナーが研究に登録されました。 血清サンプルの採取は、SARS-CoV-2感染者31人のうち20人の患者に対して複数の時点で縦断的に実施され、他の11人の患者に対しては単一の時点でのサンプリングが実施された。 参加者の数とさまざまなアッセイで使用された血清サンプルがリストされています。 B および C、31 人の COVID-19 患者からの合計 101 の血清サンプルを、異なる時点で SARS-CoV-2 N タンパク質 (B) および S タンパク質 (C) に結合する IgG 抗体について ELISA で検査しました。症状発症後 (1-30、n 5 37 日、31-61、n 5 18、100-150、n 5 21、日 {{21) }}、n 5 25)。 20 人の健康なドナーからの血清サンプルが対照群として含まれました。 D、SARS-CoV-2 シュードウイルスに対する経時的な NT50 は、非線形回帰によって計算されました。 E、疾患発症後の示された時点での新型コロナウイルス-19患者における血清中和活性の分布が示されている。 NT50力価が20未満のサンプルは中和なしとして定義されました

ペプチドマイクロアレイデータ解析

IgGデータとIgMデータをそれぞれ分析しました。 各スポットのシグナル強度は、前景からバックグラウンドを差し引いたものとして定義され、各ペプチドの三重スポットの平均値とされました。 COVID-19 サンプルの陽性ペプチド反応のカットオフ値は、健康なドナー コントロールの信号強度の 2 倍に設定されました。 3 つのサンプリング時点すべて (疾患発症後 10-60、100-150、および 180-220 日) で検査されたサンプルの中で陽性率が 80% を超えるペプチドを、優勢かつ持続的なペプチド、および以下のペプチドと定義しました。すべての時点で 60% を超える陽性反応頻度は、3- 準優性かつ持続的であるとみなされました。 3 つのサンプリング時点グループにおける各ペプチドの平均シグナル強度が計算されました。 高いシグナル強度（試験したすべてのサンプルのシグナル強度の平均 1 SD を超える）を示すペプチドも選択されました。 データ処理と分析は R v3.6.3 ソフトウェア (https://www.r-project.org/) によって実行され、異なるサンプリング時点グループ間の有意な信号強度の変化が Limma に基づいて評価されました。 P < 0.05 の差は統計的に有意であるとみなされました。

マウスの免疫化

6〜8週齢の雌BALB/cマウスをBeijing Vitalstar Biotechnology (北京、中国)から購入した。 すべてのマウスは特定の病原体のない施設で飼育され、この動物研究は天津医科大学（中国、天津）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 免疫化のために、マウスのグループ（n 5 5）に、50 mgのミョウバン（InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）と混合した各ペプチド（それぞれペプチド318、356、510、および530）を1用量あたり25 mg筋肉内注射しました。および10 mgのCpGアジュバントを投与し、アジュバントの存在下で1用量あたり50 mgのペプチドを2-週間間隔で2回追加免疫した。 アジュバントのみを用いたワクチン接種は陰性対照として機能した。 ２回目および３回目の免疫後１０日目または１４日目に免疫マウスから血清を採取した。

統計的および構造的分析

すべてのグラフは GraphPad Prism によってプロットされました。 図 1、2、および 4 のグループ間の統計的比較は、Tukey 多重比較を使用した 1- 方法 ANOVA によって実行されました。 www.jacionline.org で入手可能なオンライン リポジトリの図 1、図 E9 および図 E10 に示されている相関は、ピアソン相関分析によって決定されました。 P < 0.05 の差は統計的に有意であるとみなされました。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 (タンパク質データバンク [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX および PDB ID: 6ZGI) の構造と SARS-CoV{{ １３｝ヌクレオカプシドタンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：６ＹＵＮ）を利用して、スパイクタンパク質上に位置する同定されたエピトープおよびヌクレオカプシドタンパク質の二量体化ドメインの構造の詳細を分析した。 さまざまなヒトコロナウイルス間の配列アラインメントと相同性分析は、MEGA v10.1.6 ソフトウェアの Clustal W アルゴリズムによって実行されました。

結果

SARS-CoV-2 感染は持続的な抗原特異的結合と中和抗体を誘導します

SARS-CoV-2感染後の抗体反応を長期的に評価するために、PCR検査でSARS-CoV-2感染が確認された31人から101個の血清サンプルを採取した（図1、A）。 研究参加者には、中等度の新型コロナウイルス感染症患者26名-19、無症状患者1名、軽症患者2名、重篤な症状患者2名が含まれていた（www.jacionline.orgで入手可能なオンラインリポジトリの表E1を参照）。 この研究に登録された患者の年齢は 17 歳から 66 歳（年齢中央値 45 歳）で、男性（51.6％）と女性（48.4％）の被験者がほぼ均等に分布していました。 研究参加者に最も多かった症状は発熱（83.9％）、咳（67.7％）、筋肉痛（22.6％）、悪寒（22.6％）で、罹患期間の中央値は15日であった。 20人の新型コロナウイルス-19患者から合計90個の血清サンプルが、入院中と回復後の退院中に症状発症後最大219日までの複数の時点で収集された（図1、A、オンラインリポジトリの表E2を参照）。 他の11人の参加者からのサンプリングは、回復期後期（症状発症後122日から214日後）の単一時点で実施された。 さらに、年齢と性別分布が一致する 20 人の健康なドナーからのサンプルを対照群として含めました (表 E1)。 血清サンプル中の抗原特異的 IgG 抗体は、SARS-CoV-2 N タンパク質または S タンパク質でプレコートされた ELISA によって定量されました。 健康なドナーと比較して、新型コロナウイルス-19患者では、抗Nおよび抗S IgG抗体の両方が症状発現後30日以内に発現し、幾何平均エンドポイント力価は4.10（log10抗N IgG）であり、 4.20 (log10 抗 S IgG) (図 1、B および C、www.jacionline.org のオンライン リポジトリの表 E3 を参照、図 E1、A および B、および図 E2)、血清変換による以前の観察と一致SARS-CoV-2 感染後 1 ～ 2 週間で発生します。5,38 その後、抗原結合抗体力価は時間の経過とともにさまざまな程度に低下しました。 新型コロナウイルス-19患者では抗N IgG抗体レベルの急速かつ劇的低下が観察されたが、健康なドナーと比較して抗S IgG力価は発症後180～220日まで高レベルが維持された（図1、B） 、C）。 相関分析により、log10 抗 N IgG 力価と抗 S IgG 力価の間の有意な相関関係が明らかになりました (r 5 0.50 および P < .001、図 1、F)。 結合抗体の定量に加えて、新型コロナウイルス感染者における機能的中和抗体の動態-19が、シュードタイプ化されたSARS-CoV-2を使用してさらに決定されました。 症状発現後4日から30日の間に採取された患者血清サンプルの95%以上(35/37)には、SARS-CoV-2に対する強力な中和活性があり、大部分のサンプルは中程度の(NT50 80-320)を示しました。 ) から強力な (NT50 > 320) 中和活性 (図 1、D および E)。 注目すべきことに、中和力価がないか、または低い2つのサンプル（最低血清希釈度1:20でNT50）が、ウイルス感染後の初期（症状発現後4日目と11日目）に、強力な中和抗体を誘発する前に収集されました（図）。 1、D、および図 E1、C）。 新型コロナウイルス患者における SARS-CoV 中和抗体のレベルは時間の経過とともに低下しているにもかかわらず、症状発現後 180～220 日間に採取されたほとんどの患者血清サンプル（24/25）では、SARS に対する中和陽性が持続しました。 CoV-2、幾何平均NT50力価が2.8-倍減少（図1、DおよびE、表E3、図E3）。 予想通り、抗 N IgG 抗体と比較して、SARS-CoV-2 S 結合 IgG 力価と中和抗体力価との間に強い相関関係が確認されました (r 5 0.61 および P < .001; 図 1) 、G および H)、SARS-CoV-2 S タンパク質が中和抗体の主要な標的であるという発見と一致しています。 SARS-CoV-2 の S タンパク質は、毒性の高い SARS-CoV と高い配列類似性 (76% の配列同一性) を共有し、MERS-CoV とは低い配列相同性 (34% の配列同一性) を示します。 コロナウイルス間の血清学的交差反応性は報告されている8、10、28、29。しかし、SARS-CoV-2に対する抗体の他のコロナウイルスに対する交差反応性の長期追跡評価に関するデータは依然として限られている。 私たちは、SARS-CoV-2感染者の縦断血清中の交差結合抗体と交差中和抗体を決定しました。 その結果、患者血清サンプルの80％以上が症状発症後1か月以内にSARS-CoVおよび/またはMERS-CoVのSタンパク質に結合し、サンプルの27％が二重交差反応性を示したことが示されました（図1、I）。 初期（発​​症後1-30日）に検査されたサンプルでは、​​SARS-CoV Sタンパク質に対する反応性がMERS-CoV（35％）よりも高い割合（73％）を示しました（図1、I）。 二重交差結合抗体とSARS-CoV交差結合抗体は時間の経過とともに徐々に減少し、発症後180～220日では二重交差結合抗体はわずか8％、SARS-CoV単一交差結合サンプルは20％となった（図1） 、I; www.jacionline.org で入手可能なオンライン リポジトリで、www.jacionline.org にあるこの記事のオンライン リポジトリの図 E4、A、図 E5、A、および図 E6 を参照してください。 興味深いことに、MERS-CoV S タンパク質反応性抗体の陽性率は、時間が経っても比較的一定のままでした (図 1、I)。 高い交差結合能力とは異なり、少数の患者血清サンプルのみが SARS-CoV および/または MERS-CoV シュードウイルスを交差中和しました (図 1、I、図 E4、B、図 E5、B、および図 E7 を参照)。オンラインリポジトリ)。 症状発症後 1 ～ 30 日で採取されたサンプルの約 27% が交差中和活性を示し、この数は 180 ～ 220 日では 20% に低下し、SARS-CoV 交差中和活性はさらに劇的に変化しました (図 1、I) ）。 発症後 30 日以内に、MERS-CoV よりも SARSCoV を交差中和したサンプルの割合が高かった。 SARS-CoV と MERS-CoV の交差中和を示すサンプルの割合が同様であるにもかかわらず、交差中和陽性の血清サンプルでは MERS-CoV の NT50 値が SARSCoV の NT50 値よりもはるかに低かったことは注目に値します (図 E4、 B;図 E5、B;図 E7）。

カンサス植物の免疫システムを高める

SARS-CoV-2 感染によりサイトカイン産生が活性化される

SARS-CoV-2感染後の免疫学的変化を包括的に特徴付けるために、我々はさらに、新型コロナウイルス-19患者の血清中のサイトカインレベルの動態の変化を評価しました。 症状発症から最初の 2 か月以内に収集された 55 の縦断血清サンプルが、タンパク質ベースのマイクロアレイによるサイトカイン産生の検出に使用されました。 病気の最初の 1 か月間で、IL{6}}a (炎症誘発性)、IL-6 (炎症促進性)、IL{9}} (抗炎症性) など、複数のサイトカインの血清レベルの上昇が観察されました。 ）、これらは、重症の新型コロナウイルス感染症-19症例におけるサイトカイン放出症候群39,40、ならびにIFN-g（TH1型）およびIL-4（TH2型）と関連している（図2、A、 www.jacionline.org で入手可能なオンライン リポジトリの図 E8)。 具体的には、IL{20}}、IL{21}}、および IFN-g の血清レベルは、患者の症状発現後 15 日以内に増加し、後期には減少しましたが、IL-1 の放出は減少しました。 αおよびIL-4は、病気の発症から16〜30日間に著しく増加し、その後急速に正常に低下することが示されました（図2、A）。 相関分析により、IL-10とSARS-CoV{{ 34}} N タンパク質結合抗体 (r 5 0.321 および P < .05)、IL-1b 産生と S タンパク質結合抗体 (r 5 20.335 および P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

プロテオーム全体のエピトープマッピングにより、新型コロナウイルス-19患者の持続的な体液性免疫反応を媒介する主要なエピトープが特定される

SARS-CoV-2に対する体液性免疫の際立った特徴を経時的によりよく特徴付けるために、ペプチドベースのマイクロアレイを使用してプロテオーム全体のエピトープマッピングを適用しました。 SARS-CoV-2 プロテオームをカバーするペプチド ライブラリーを生成し、スライドに固定しました。各ペプチドは長さが 15 aa で、11 aa の重複がありました。 無症候性 (n 5 1) または軽度 (n 5 2) から中等度 (n 5 15) または重度 (n 5 1) の患者 19 名からの合計 51 個の縦断血清サンプル) SARS-CoV-2 感染が検査されました (表 I)。 比較的バランスの取れたサンプリング数、間隔、時点を達成するために、症状発現後 16 日から 219 日の範囲で、各 COVID-19 参加者からサンプルを 2 つまたは 3 つの時点で連続的に収集しました。 無症候性感染を示した 1 名を除き、大多数の患者 (18/19) がウイルス感染後に中和抗体を生成しました (表 I)。 異なるサンプリング時点に従って、サンプルは 3 つのグループに分けられました: 10-60 日 (n 5 18)、100-150 日 (n 5 18)、および {{28 }} (n 5 15)。 新型コロナウイルス-19患者におけるウイルスエピトーププロファイルの縦断的評価は、20人の健康なドナーから採取したプール血清を陰性対照として使用し、血清IgG抗体とIgM抗体の両方について実施されました。 SARS-CoV-2 プロテオーム マイクロアレイを使用して、ペプチド結合抗体応答の動態を決定し、(1) 結合シグナル強度、および (2) 各ペプチドの陽性反応サンプルの割合 (陽性率) について分析しました。 。 陰性対照のシグナル強度の 2 倍として設定された陽性ペプチド結合応答のカットオフ値に基づいて、少なくとも 1 人の患者と反応性のある合計 460 個の IgG 陽性ペプチドと 479 個の IgM 陽性ペプチドを同定しました。血清サンプル。 SARS-CoV-2 の陽性ペプチド数とさまざまなオープン リーディング フレーム (ORF) にわたる応答の分布は、さまざまなサンプリング グループ間で比較的安定しており、時間の経過とともに陽性ペプチド数はわずかに減少する傾向がありました (図 3、 A)。 最も多くの反応性がレプリカーゼ ポリタンパク質 ORF1ab で同定されました。これはゲノム全体の 3 分の 2 以上を含む最大の ORF です (図 3、A)。 興味深いことに、SARS-CoV-2感染後早期（発症後10-60日、ペプチド結合陽性反応と血清サイトカインレベルの間に中程度から強い相関関係があることが観察されました。オンラインリポジトリの図E10を参照） www.jacionline.org)。 IgM に対する陽性結合ペプチドの数は、IL-6 および IL-10 の血清レベルと関連していることが示されました。 同様に、全反応性ペプチドの平均シグナル強度と IgM に対する ORF1ab 結合ペプチドの平均シグナル強度は、血清サンプル中の IL-6 および IFN-g 産生と正の相関を示しました。 これらのデータは、SARS-CoV-2感染後のサイトカインレベルの変化が、抗原特異的な体液性反応によって認識されるエピトープの大きさと幅に影響を与える可能性があることを示唆しています。 陽性エピトープの特定に基づいて、3 つのサンプリング グループのそれぞれの中で、COVID-19 サンプルの 80% 以上で一貫して反応性を維持する最も一般的なエピトープ (優勢エピトープおよび持続エピトープと呼ばれる) をさらに選択しました。 その結果、長期の体液性免疫応答を媒介できるこれらの高度に優勢なエピトープは、SARS-CoV-2 ORF1ab ポリタンパク質および S タンパク質に位置しており、IgM 抗体によって認識されるエピトープの数が多いことが明らかになりました (n 5 33)。 IgG 抗体 (n 5 10) (図 3、B、および表 II。www.jacionline.org のオンライン リポジトリの図 E11 および図 E12 を参照)。 ORF1ab ポリタンパク質は、長期応答を媒介する最大数の優性エピトープを有しており、エピトープは非構造タンパク質 (nbsp) 2-5、nbsp 8-10、nbsp 12-14、および nbsp 16 (表 II)。 特に、血清サンプリングの時点に関係なく、100%の新型コロナウイルス-19患者由来のIgGおよびIgM抗体によって認識できる1つの免疫優勢エピトープ2073（ORF1ab、aa5801-5815）を同定しました（図） 3、B、および表 II;オンライン リポジトリの図 E13 および図 E14 を参照)。 この反応性の高いペプチドは、ORF1ab ポリタンパク質のヘリカーゼ (nsp 13) 領域内に位置しており、SARS-CoV-2 複製中に二本鎖 RNA テンプレートを巻き戻すのに不可欠です。41 ORF1ab の選択されたペプチドのうち、2 つの免疫優勢ペプチドIgG 抗体によって認識される平均シグナル強度が最も高い番号 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) と番号 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815) は両方とも nsp 13 に位置します。IgM 応答の場合、ペプチド 685 nsp 2 上の (ORF1ab、aa 249-263) および nsp 13 上のペプチド 1985 (ORF1ab、aa 5449-5463) は、最も強力な結合強度を示しました (図 3、B)。 さまざまなペプチドのベースラインシグナル（健康なドナーからプールされた血清）の変動を考慮して（図3、B）、さらに、健康な対照グループと比較した、各主要ペプチドに関するシグナル強度の変化倍数を計算しました。 結果は、nsp 13 領域に位置するペプチド 2073 (IgG 結合) およびペプチド 1985 (IgM 結合) が、180 ～ 220 日まで収集された患者血清の中で最高のペプチド結合強度 (変化倍数) を維持することを示しました (図 E13 および図 E14)。

図2. 新型コロナウイルス-19患者におけるサイトカイン産生の動態。 A、急性期および回復期初期に16人の新型コロナウイルス-19患者から採取した55の血清サンプル中のサイトカイン産生レベルが、タンパク質マイクロアレイベースのELISAによって検出されました（1-15日、n日） 5 11; 日 16-30、n 5 26; 日 31-61、n 5 18; 健康なドナー、n 5 20）。 各ドットは個々の血清サンプルを表します。 点線は検出限界を示します。 統計的有意性は、Tukey 多重比較を使用した 1- 方法 ANOVA によって決定されました。 *P < .05、**P < .01、および ****P < .0001。 B、(A)に示した新型コロナウイルス-19患者における各サイトカイン産生レベルの変化倍率を、健康なドナーからの20サンプルの平均値と比較したもの。 各列は、症状の発症後の指定された時点から収集された個別の血清サンプルを示します。 各行は、テストされた 1 つの個別のサイトカインを表します。

表I. エピトープマッピングにおける新型コロナウイルス-19患者の特徴とサンプルコホート

図 3. SARS-CoV-2 感染者における長期の抗体応答に寄与する主要なエピトープの IgM および IgG 認識。 SARS-CoV-2のプロテオームをカバーするペプチドマイクロアレイを使用した、19人の新型コロナウイルス感染者におけるエピトープの血清認識の縦断的分析-19。 患者サンプルにおけるペプチド結合の陽性応答のカットオフ値 (n 5 51) は、20 人の健康なドナーからのプールされた血清のシグナル強度の 2 倍として設定されました。 A、10-60 日 (n 5 18)、100-150 日 (n 5 18) に収集された 1 つ以上のサンプルで検出された陽性結合ペプチドのペプチド数と分布、発症から 180- 220 日 (n 5 15) 日後。 数字は、各 ORF から同定された IgG および IgM エピトープの合計を示します。 B、3 つのサンプリング時点すべてにおいてサンプルの 80% 以上で持続的に反応性を示した、優勢および持続性の IgG および IgM エピトープのシグナル強度 (x 軸)。 各ドットは、健康なドナーからプールされた血清（上）、または症状発症後の指定された時点から収集された個別の患者血清サンプルを示します。 E、エンベロープタンパク質。

TABLE II. Epitopes with >3 つのサンプリング時点すべてで 80% の陽性率

SARS-CoV-2 S タンパク質の優勢かつ持続的なエピトープは NTD サブユニットと S2 サブユニットに位置します

SARSCoV-2 S タンパク質から合計 4 つの主要かつ持続的なエピトープが同定されました: ペプチド 318 (S, aa 45-59) およびペプチド 356 (S, aa 197-211)。 NTD 地域内。 S2' 切断部位と S2 サブユニットの FP の一部を覆うペプチド 510 (S, aa 813-827)、および接続領域に位置するペプチド 530 (S, aa 893-907) FP と S2 サブユニットの最初の 7 繰り返し領域の間 (図 3、B、および表 II)。 我々が選択したSタンパク質のこれらの重要なペプチドの中で、Sタンパク質のNTDに位置するペプチド318は、最も強力な結合強度を有していた(対照に対する倍率変化；図E13および図E14)。 構造分析により、これらのエピトープが単量体 S タンパク質の表面に完全に露出していることが明らかになりました。 ただし、ペプチド 318、356、および 530 のエピトープの一部の残基は三量体 S タンパク質の表面下に隠されており (図 4、A および B)、このことは、S モノマー構造とトリマー構造の両方が、特定の環境下で宿主免疫系によって効率的に認識されることを示唆しています。状況。 具体的には、ペプチド 318 の 2 つのループ セグメント (aa 45-46 および aa 56-59) が三量体 S タンパク質上に露出し、中央の b 鎖が内部に埋もれています。 そして、コア b ストランド (aa 203-209) およびループ セグメント (aa 210-211) を含む、ペプチド 356 のほとんどの残基は表面上でアクセス可能です。 ペプチド 510 には S2' 切断部位と FP の中央ヘリックスが含まれており、両方とも S タンパク質の表面に完全に存在します。 ペプチド 530 の残基はほとんどが謎であり、ループのごく一部 (aa 893-895) のみが三量体 S タンパク質上に露出しています (図 4、C)。 7つの一般的なヒトコロナウイルス間の配列相同性分析により、S2サブユニットに位置する2つのエピトープ（ペプチド510および530）が他のコロナウイルスと高い配列同一性を共有していることが明らかになり、ヒトコロナウイルス間でこれらのエピトープを標的とする血清学的交差反応性が示唆された（図4、D）。 ペプチド 318 の配列は SARSCoV と高い類似性を示しましたが、ペプチド 356 についてはコロナウイルス間で低いレベルの配列相同性が示されたことから、この領域を標的とする SARS-CoV-2 特異的な抗体応答が示唆されました (図 4、D)。 新たに出現し、世界中で流行している SARS-CoV-2 変異株を考慮して、初期の SARS-CoV-2 株（武漢-湖{{52}世界保健機関の変異ウイルス分類によると、懸念される 5 つの変異株 (アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、およびオミクロン) に加えて、注目される 2 つの変異株 (ラムダおよびミュー) が含まれます (2021 年 11 月 30 日更新) ）。 結果は、これらの優性および持続性エピトープの配列が、新しい Omicron 変異体で同定された単一の N211I 変異を除いて、分析された変異体間でほぼ同一であることを示しました (図 4、E)。 これらのデータは、初期の SARS-CoV-2 株によって生成された抗体が現在循環している変異株を一貫して認識する可能性があり、これらの主要なエピトープが SARS-CoV-2 感染時の持続的な長期抗体反応を媒介できる可能性があることを示しています。亜種。 S タンパク質上で同定されたエピトープの免疫学的特徴をさらに決定し、ペプチド ワクチン候補としてのこれらの S タンパク質エピトープの潜在的価値をさらに調査するために、選択したペプチドを使用してマウス免疫研究を実施しました。 BALB/cマウスに、ミョウバンおよびCpGアジュバントの存在下で各ペプチドを3回接種した(図4、F)。 選択された 4 つのペプチドのうち、ペプチド 356 でワクチン接種すると、2 回目および 3 回目の投与後に抗原特異的抗体が誘発されました (図 4、G)。 血清中和アッセイの結果から、線状ペプチドによる免疫では、SARS-CoV-2に対する有意なレベルの中和抗体が生成されないことが明らかになり(図4、H)、これらの線状ペプチドは強力な中和抗体応答の誘導において不十分であることが示唆されました。

SARS-CoV-2 の N タンパク質には、ウイルス感染後の持続的な抗体反応を媒介する最も反応性の高いエピトープが欠如しています

多くの研究により、SARS-CoV-2 N タンパク質の強力な抗原性が解明されています4,11,12。しかし、現在の選択基準に基づいて、N タンパク質に位置する優勢で持続的なエピトープを特定することはできませんでした。 (3 つのサンプリング時点すべてで 80% 以上の陽性率)。 新型コロナウイルス感染者-19のNタンパク質のエピトーププロファイルを縦断的に評価するために、一貫して陽性反応性を維持するサブドミナントエピトープを選択するためのペプチドマイクロアレイから得られたデータに基づくエピトープスクリーニングの第2ラウンドを実施しました。 3 つのサンプリング時点のそれぞれで、新型コロナウイルス-19 サンプルの 60% 以上に含まれています（サブドミナントおよび永続的エピトープと呼ばれます）。 SARS-CoV-2 N タンパク質の合計 4 つのサブドミナントおよび持続性エピトープが同定され、その中でペプチド 2455 (N, aa 213-227) は、新型コロナウイルスの IgG 抗体と IgM 抗体の両方に対する反応性を示しました。{{16 }} 患者は比較的高いレベルのシグナル強度を示します (図 5、A および B、およびオンライン リポジトリ (www.jacionline.org) の表 E4 を参照)。 2 つの重複ペプチド、ペプチド 2455 (N, aa 213-227) とペプチド 2456 (N, aa 217-231) は、N 末端 RNA 結合ドメイン間の Ser/Arg リッチなリンカー領域に位置します。 Nタンパク質のC末端二量体化ドメイン。 ペプチド 2482 (N, aa 321-335) およびペプチド 2491 (N, aa 357-371) は、N タンパク質の二量体化ドメイン内に完全または部分的に位置しています (表 E4)。 N タンパク質の完全な立体構造に関する 3- D 構造が欠如しているため、C 末端二量体化ドメインの二量体構造上の 2 つの同定されたエピトープの構造分析のみを実行しました。 ペプチド 2482 の残基は二量体化界面で逆平行に配置された 2 本の b 鎖を形成しますが、ペプチド 2491 の aa 357-364 は二量体の反対端に位置するヘリックスベースの構造を形成します (図 5、C)。 。 初期のSARS-CoV-2（武漢湖-1株）と7つの新たな変異株との間の配列アライメントにより、Nタンパク質におけるこれらのサブドミナントおよび持続性エピトープの配列が、現在流行している変異株間でほぼ同一であることがさらに明らかになった。デルタ変異体ではペプチド 2455 の単一 G215C 置換が発生し、ラムダ変異体ではペプチド 2455 の単一 G214C 変異が同定されており、これらのペプチドを標的とする抗体が新興 SARS-CoV-2 変異体の抗原を認識する可能性があることを示唆しています（図 5、D） ）。

【図４】持続的な体液性免疫応答の媒介という点での、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の主要なエピトープ。 A および B、単量体 (A) および三量体 (B) S タンパク質の 3-D 構造上の主要な永続的エピトープの位置 (PDB ID: 6VXX)。 エピトープは緑色 (ペプチド 356、aa 197-211)、赤色 (ペプチド 318、aa 45-59)、青色 (ペプチド 510、aa 813-827)、および紫 (ペプチド 530、aa) で強調表示されます。 893-907)、それぞれ。 閉じた構造にある 3 つの S モノマーは、それぞれ灰色、ピンク、シアンで示されています。 C、S 三量体の閉じた状態における SARS-CoV-2 S タンパク質の主要なエピトープの詳細な構造分析 (PDB ID: 6VXX)。 D、一般的なヒトコロナウイルスの間で同定されたエピトープの配列アラインメント。 SARS-CoV-2 と他のヒトコロナウイルスの間で保存されているエピトープ残基は灰色で網掛けされています。 E、初期のSARS-CoV-2（武漢胡株-1）および7つの新たな変異株のエピトープ保存分析。 黒い点は、武漢-胡-1株と示された株との間の同一の残基を表す。

【図５】SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に位置するサブドミナントエピトープは、持続的な抗体応答を媒介することができる。 疾患発症後の複数の時点で収集された患者血清サンプル中のサブドミナントペプチド（60％を超えるサンプルで永続的に反応性）のA、IgG、およびIgM認識頻度。 B、同定されたサブドミナントエピトープの経時的なシグナル強度動態。 各ドットは、症状発症後の指定された時点で COVID-19 患者から採取された個別の患者血清サンプルを表します。 水平の点線は、各ペプチドの陽性反応のカットオフ値を示します。 C、N タンパク質の C 末端二量体化ドメイン上のエピトープの詳細な構造解析 (PDB ID: 6YUN)。 エピトープは青色 (ペプチド 2482、aa 321-335) と茶色 (ペプチド 2491、aa 357-364) で標識されています。 2 つのモノマー構造は、それぞれ灰色とシアンで示されています。 D、初期のSARS-CoV-2（武漢-胡株-1）と7つの新たな変異株の間で同定されたNタンパク質エピトープの配列アラインメント分析。 黒い点は、武漢湖-1株と示された変異株との間の同一の配列を示す。 アミノ酸配列の変化は赤色で強調表示されます。

図 6. SARS-CoV-2 感染者によって認識される、結合強度が高く、反応頻度が時間の経過とともに低下するライナーエピトープ。 A および B、高い結合シグナル強度 (すべての試験サンプルのシグナル強度の平均 1 SD 以上) を示すが、時間の経過とともに陽性率が減少する同定されたペプチドの縦方向分析と分布。 エピトープの認識頻度 (A) と信号強度 (B) を、症状発症後の 3 つのサンプリング時点でプロットしました。 (B) の各ドットは、症状発症後の指定の時点で採取された個々の患者の血清サンプルを表します。 点線の水平線は、各ペプチドの陽性のカットオフ値を示します。 統計的有意性分析は、Limma of R v3.6.3 ソフトウェアに基づいて実行されました。 *P < .05 および **P < .01。 C、SARS-CoV-2 S タンパク質構造上の 2 つの隣接するエピトープ、ペプチド 510 (優性および持続性) とペプチド 511 (高いシグナル強度と時間の経過とともに減少する陽性) の位置と配列の比較 (PDB ID: 6ZGI) 。 2 つのエピトープ間の重複領域は緑色で強調表示されます。 固有の配列は赤と青でラベル付けされます。

縦断的血清学的分析により、信号強度は高いが時間の経過とともに反応性が低下するエピトープを特定

上記の持続的な体液性免疫応答の原因となる選択された高反応性エピトープに加えて、我々はさらに、強力な結合強度（すべての試験サンプルのシグナル強度の平均 1 SD を超える）を示した 9 個の陽性ペプチドのパネルを同定し、特徴付けました。体液性免疫反応が弱まるという一般的な傾向に従って、時間の経過とともに、新型コロナウイルス-19患者からの血清サンプルの反応性が低下する傾向（陽性率の変化が20%を超える）。 これらのエピトープは、3 つの主要な抗原、ORF1ab、S、および N タンパク質内に位置しています (図 6、A; オンライン リポジトリ www.jacionline.org の表 E5 を参照)。 さらに、ORF1ab の 4 つのペプチド (ペプチド 784-IgG、1617-IgM、および 1986-IgM) および N (ペプチド 2457-IgG) タンパク質のシグナル強度の大幅な低下が観察されました。初期のサンプリング時点（発症後 10-60 日）と後期のサンプリング時点（症状発症後 100-150 日または 180-220 日）のサンプルの間（図 6） 、B）。 注目すべきことに、S タンパク質ペプチド 510 (優性および持続性、図 3、B) とペプチド 511 (高いシグナル強度および時間の経過とともに減少する陽性率、図 6、A) の 2 つのペプチドは、互いに大きく重複しているにもかかわらず、異なるパターンを示しました。経時的な患者血清サンプル間の反応性。 配列と位置の分析により、ペプチド 510 には S2' 切断部位と追加のアミノ酸 813-SKRS-816 が含まれているのに対し、ペプチド 511 は完全に FP 内にあり、拡張された 828-LADA{{29} が含まれることが示されました。 }} 残基は三量体 S タンパク質の表面に完全に露出しています (図 6、C)。 これらの結果は、SARS-CoV-2に対するより長く持続する強力な体液性免疫に最終的に寄与する可能性があるエピトープの新しい特徴を明らかにしました。

議論

SARS-CoV-2感染に対する長期免疫応答の体系的な特徴付けは、診断法の改善、効果的な治療介入、ワクチンの開発にとって重要です。 現在の研究では、180～220日間の追跡期間にわたる新型コロナウイルス-19患者の包括的な長期的分析を実施し、ウイルス感染後の持続的な体液性免疫反応と活性化されたサイトカイン産生を示しました。

重要なのは、SARS-CoV-2のプロテオームにわたるペプチドベースのマイクロアレイを利用することで、エピトープ認識の動態をさらに明らかにし、長期の体液性免疫を媒介できる主要なエピトープのパネルを同定したことです。 SARS-CoV-2 感染後の体液性免疫反応の持続期間に関する我々がここで報告する調査結果は、以前に発表されたデータの一部を裏付けています 5,10,12,13,42 が、長期にわたる血清サンプルを使用した詳細な血清学的プロファイリングとエピトープ スクリーニングを実行することにより、そのデータを拡張します。プロテオーム全体のマイクロアレイ アプローチを通じて、新型コロナウイルス感染者-19から採取します。 この研究では、SARS-CoV-2 S タンパク質内の 4 つの主要なエピトープ（ペプチド 318、356、510、530）が、80% 以上の COVID-19 患者と持続的に反応できることを特定しました。症状発現後 180 ～ 220 日以内のサンプルを検査しました。 S2 切断部位と S2 サブユニットの FP を含むペプチド 510 (S, aa 813-827) は、他のグループの以前の研究で一般的に同定されています。26,28,32-34 機能分析により抗体が示されましたこの領域を標的とすることは、S タンパク質の表面に高度に露出しているにもかかわらず、SARS-CoV-226 に対して限られた中和能力を示す可能性があります (図 4、AC)。 ペプチド 530 (S, aa 893-907) の場合、FP と S2 サブユニットの最初の 7 進繰り返し領域の間に位置し、残基は一般に S タンパク質の三量体構造の内側に埋もれています。 SARS-CoV-2に対する強力な中和抗体によるアクセスは困難です（図4、AC）。 さらに、SARS-CoV-2の長期抗体応答を媒介できる2つのS1-NTD指向性ペプチドも選択されました。 ペプチド配列と位置に関する分析により、これら 2 つのペプチドの残基、ペプチド 318 (S, aa 45-59) とペプチド 356 (S, aa 197-211) が、報告されている認識されたエピトープに非常に近接していることが示されました。 S1 サブユニットの NTD を標的とする非常に強力な中和抗体の重要な部位は別として、感染促進抗体によって認識される 23,25 が、これら 2 つの同定されたペプチドに対する非中和抗体によるエピトープ認識の可能性を示唆しています。 上記の詳細に加えて、選択されたペプチドによるマウスの免疫化により、これらの非受容体結合ドメイン線状ペプチドの強力な中和抗体応答の誘導における有効性が低いことがさらに示されました（図 4、G）。 総合すると、これらのデータは、SARS-CoV-2感染に対する長期の体液性免疫応答を媒介する優勢な線状エピトープが、おそらく中和能を全く持たないか、または限定された抗体を誘導することを示唆している。 SARS-CoV-2 抗体のエピトープ状況、特に S タンパク質指向性エピトープをより深く理解することで、抗体の機能解析に対する新たな洞察が得られ、革新的かつ合理的なワクチン設計がさらに促進されます。 中和抗体はウイルス感染を排除するための保護を与えますが、非中和抗体はウイルス除去中に有益な役割、中立的な役割、さらには有害な役割を果たす可能性があります。 非中和抗体は、抗体依存性の食作用および抗体依存性の細胞毒性に関連して、Fc を介したさまざまなエフェクター機能を介して in vivo で追加の保護を提供します。 対照的に、いくつかの研究は、コロナウイルス感染における非中和抗体の病原性の役割の可能性を提案しています。 SARS-CoV および MERS-CoV に対する複数の種類のワクチン候補を使用した以前の研究では、ワクチン接種された小動物およびヒト以外の霊長類において、ウイルス攻撃後に免疫病理の増強が観察されました。 SARS-CoV-2 S タンパク質の NTD を標的とする抗体は、Fcg 受容体非依存性機構を通じて in vitro でウイルス感染を増強することができました 23,25 が、動物モデルで受動的に投与された感染増強抗体は SARS に対して防御的であることが示されています。 -生体内でのCoV-2感染。 コロナウイルス感染時の物議を醸す抗体の役割を考慮すると、生体内でのウイルス感染との闘いにおけるこれらの主要かつ持続的なエピトープの認識における抗体の潜在的な役割を検証するには、さらなる研究が必要です。 SARS-CoV-2に対する合理的なワクチン設計の次の段階は、非常に強力な中和抗体と防御的な非中和抗体を誘発するとともに、感染を増強するエピトープまたは免疫優性エピトープの提示を減少させることによって考えられる可能性があります。有益な効果。 これまでの多くの研究は、中和に関する抗体機能の描写を目的とした SARS-CoV-2 の S タンパク質のみに焦点を当ててきましたが、私たちは包括的なプロテオーム全体のエピトープ マッピングを実行し、ORF1ab ポリタンパク質内のエピトープのパネルを特定しました。は、長期にわたって患者血清サンプルの高い割合で一貫して認識されました。 複数の非構造タンパク質上に分布するこれらの ORF1ab 指向性ペプチドは、SARS-CoV-2 ビリオンを標的とする機能的な抗体を誘発しない可能性がありますが、自然感染とワクチン接種を区別するのに役立つ診断ツールとして適用できる可能性があります。 世界中でワクチン接種者の数が増加しているため、Sタンパク質とNタンパク質に基づく現在の血清学的検査は、SARS-CoV-2感染の検出のための分子検査を支援する効果的なアプローチとして課題に直面している。ウイルス感染後の免疫状態の判定。 新型コロナウイルス感染者における ORF1ab 内の最も一般的で持続的な反応性ペプチドを利用することで、受容体結合ドメインベースの S タンパク質を含むワクチン接種状態を考慮せずに、自然感染の血清学的診断が実行されます。ベースおよび不活化ウイルスベースのワクチンアプローチ。 SARSCoV-2感染者とワクチン接種者の両方を含む大規模なコホートにおいて、同定されたORF1abペプチドの反応性、感度、特異性を評価するには、今後の研究が必要である。 さらに、完全長タンパク質と比較してペプチドの感度が低いことや、一般的なヒトコロナウイルス間の交差反応性の可能性を克服するには、複数のペプチドの組み合わせ戦略による検出効率をさらに評価する必要がある。 私たちの研究の主な限界は、小規模な患者コホートから得られたサンプルが比較的少ないことと、参加者の大部分が重症ではない 新型コロナウイルス感染症を経験していることです。 これらは、陽性反応の頻度と免疫反応の大きさに関する我々の結論の一部を制限する可能性があり、これらは疾患の重症度によって異なる可能性があります。 それにもかかわらず、この研究で提示されたデータは、SARS-CoV 感染後の経時的な免疫応答の動態と、新型コロナウイルス感染者の持続的な体液性免疫を媒介できる主要なエピトープの特徴についての貴重な洞察を提供します。{109}} これらの発見を総合すると、ウイルス感染によって誘発される自然免疫の寿命についてのより深い理解が得られ、革新的なワクチン接種戦略や診断アプローチの改善に広範な影響を及ぼします。

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