メトホルミンはAMPK/BDNF/PI3K経路の活性化を介して加齢に伴う神経認知障害を軽減します パート1

加齢に伴う神経認知障害の進行を遅らせることは困難です。 私たちは、d-ガラクトース誘発性老化におけるメトホルミンの治療効果を評価しました。 さらに、我々はメトホルミンの老化防止効果に関与する可能性のある分子機構を研究しました。 30匹の雄ラットを、1 - 生理食塩水を投与する対照群、2 - d-ガラクトース（D-gal）群、8週間胃洗浄によりd-ガラクトース（100 mg/kg/日）を投与する、 ３−ｄ−ガラクトース＋メトホルミン（Ｄ−ｇａｌ＋Ｍｅｔ）処置群は、８週間の胃洗浄によるｄ−ガラクトース＋メトホルミン（２００ｍｇ／ｋｇ／日）を受けた。 神経認知評価が行われました。 炎症、酸化ストレス、BDNF バイオマーカーの測定が行われました。 AMPK および PI3K 遺伝子発現を評価しました。 海馬組織は、組織病理学的および免疫組織化学的研究のために解剖されました。 D-gal は、神経認知障害、炎症性バイオマーカーの上昇、酸化ストレスマーカーの変化、BDNF の減少、カスパーゼ -3 の発現増加を伴うシナプトフィジンと Bcl2 の発現の減少、および AMPK および PI3K 遺伝子の下方制御を引き起こしました。 神経変性変化が海馬に存在した。 メトホルミンは、D-gal 誘発性の神経変性変化を大幅に回復しました。 われわれは、メトホルミンが神経炎症の改善、酸化ストレスの軽減、アポトーシスの減少、およびシナプス可塑性の促進を通じて、加齢に伴う神経認知障害を軽減できると結論付けた。 これらのメカニズムは、AMPK/BDNF/PI3K 経路の活性化を介して媒介される可能性があります。

また、シスタンケのグリコシドは、心臓および肝臓組織の SOD の活性を高め、各組織のリポフスチンおよび MDA の含有量を大幅に減少させ、さまざまな活性酸素ラジカル (OH-、H2O2 など) を効果的に消去し、引き起こされる DNA 損傷から保護します。 OHラジカルによる。 Cistanche フェニルエタノイド配糖体は、フリーラジカルの強力な消去能力、ビタミン C よりも高い還元能力を持ち、精子懸濁液中の SOD の活性を向上させ、MDA の含有量を減らし、精子膜機能に一定の保護効果をもたらします。 Cistanche 多糖類は、D-ガラクトースによって引き起こされる実験的老化マウスの赤血球および肺組織における SOD および GSH-Px の活性を高めることができるほか、肺および血漿中の MDA およびコラーゲンの含有量を減少させ、エラスチンの含有量を増加させることができます。 DPPHに対する優れた除去効果、老化マウスの低酸素状態の延長、血清中のSOD活性の改善、実験用老化マウスの肺の生理的変性の遅延 細胞形態学的変性を伴うCistancheには優れた抗酸化能力があることが実験で示されています皮膚の老化疾患を予防および治療する薬になる可能性があります。 同時に、Cistanche に含まれるエキナコシドは、DPPH フリーラジカルを捕捉する顕著な能力を持っており、活性酸素種を捕捉し、フリーラジカルによるコラーゲン分解を防止し、チミン フリーラジカル アニオン損傷に対する優れた修復効果もあります。

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略語

D-gal D-ガラクトース

ROS 活性酸素種

IL-1 インターロイキン-1

IL-1 インターロイキン-1

IL-6 インターロイキン-6

IL-10 インターロイキン-10

TNF-腫瘍壊死因子

BDNF 脳由来神経栄養因子

AMPK AMP 活性化プロテインキナーゼ

PI3K/Akt ホスファチジルイノシトール 3- キナーゼ/プロテインキナーゼ B

RT-PCR 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応

EPM 高架十字迷路

TL転送レイテンシ

MDA マロンジアルデヒド

SODスーパーオキシドジスムターゼ

MPTP ミトコンドリア透過性移行孔

H&E ヘマトキシリンおよびエオシン

iNOS 誘導性一酸化窒素合成酵素

NF-κB 核内因子-κB

LTP 長期増強

加齢に伴って起こる生理学的機能、精神的敏捷性、記憶力の着実な喪失は、神経細胞死によって引き起こされる可能性のある多面的なプロセスです1。 多くの国で、平均寿命は 2030 年までに 85 歳を超えると予測されています2。高齢者の生活の質の低下とそれに伴う経済的および個人的支出のため、加齢に伴う認知障害が重大な社会問題として浮上しています。 さらに、脳の老化は、不可逆的に進行することが多い神経変性疾患の発症の主な原因です3。 現在、加齢に伴う神経認知障害に対して利用できる効果的な治療法はほとんどまたはまったくありません4。

乳製品に豊富に含まれる単糖である d-ガラクトース (D-gal) は、通常、酵素によってグルコースに変換されます。 しかし、長期にわたる D-gal の全身投与は、重大な健康被害を引き起こす可能性があります 5。 以前の研究では、ラットへの持続的な全身性 D-gal 送達により、ラットが老化および加齢に関連した神経変性疾患のモデルに変化する可能性があることが示唆されています 6。 D-gal 老化モデルには、老化プロセスのみに集中できるなど、自然老化モデルに比べていくつかの利点があります。 自然老化モデルでは、糖尿病や高血圧などの併存疾患が変数を複雑にしています7。

D-gal は、抗酸化酵素の活性低下やコリン作動性ニューロンの減衰など、老化した人間の脳で見られるものと同様の生化学的異常を引き起こすと考えられています。 正常な老化と多くの病気の病態生理の両方に関連する終末糖化産物は、D-gal とタンパク質のアミノ基の相互作用によって生成されます。 D-gal を投与された動物は、神経炎症、ミトコンドリア損傷、反応性酸素種 (ROS) の発生による酸化損傷を引き起こし、さらに新しさへの慣れ、空間学習の欠陥、認知機能の問題を引き起こしました8。

炎症は高齢者の認知機能低下の重要な要因である可能性があります。 高レベルのインターロイキン-6、IL-1、腫瘍壊死因子、およびC反応性タンパク質は、高齢者の罹患率および死亡率の増加と関連しています9。 ラットの慢性的な d-ガラクトース治療は、大脳皮質と海馬における神経細胞のアポトーシスシグナル伝達経路の活性化と神経炎症を誘発しました1。

加齢は脳由来神経栄養因子（BDNF）の減少をもたらします。BDNFは、学習と記憶に関連する可塑的変化に関与する重要なタンパク質であり、またニューロンの増殖と完全性の重要なメディエーターでもあります10。

老化を遅らせ、認知能力をサポートする新規化合物の発見は、最大の課題の 1 つとなっています。 メトホルミンは血液脳関門を素早く通過し、下垂体や海馬などのいくつかの脳領域に蓄積します11。 メトホルミンの長期投与により、加齢に伴う病理学的合併症の発症が減少し、ヒトの寿命が延びることが実証されています12。 さらに、メトホルミンは、糖尿病患者と非糖尿病患者の両方13,14、および神経変性疾患患者15の認知障害や不安などの行動障害を改善することが示されています。 しかし、加齢に伴う神経認知障害の改善におけるメトホルミンの効果の根本的なメカニズムは複雑であり、まだ完全には理解されていません。

メトホルミンの神経保護効果は、主に AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) シグナル伝達経路の活性化に起因すると考えられます 11。 AMPK の活性化は、シナプス伝達と記憶の固定に重要な役割を果たす BDNF の発現を上方制御します10。 AMPK 活性化のこの確立された特性に加えて、以前の結果では、メトホルミンが酸化ストレスの回復、神経炎症の軽減、アポトーシスの抑制を通じて記憶力を強化できることが実証されており、これにより神経変性疾患の分野における臨床適応が拡大する可能性があります 14。 メトホルミンは、アポトーシスの阻害と細胞生存の促進における重要なシグナル伝達経路であるホスファチジルイノシトール3-キナーゼ/プロテインキナーゼB (PI3K/Akt)経路の強力な活性化剤です16。

安全性、手頃な価格、使いやすさなどのメトホルミンの利点を考慮する。 私たちは、ラットのd-ガラクトース誘発性老化によって引き起こされる神経認知障害に対するメトホルミン投与の神経保護効果を研究しました。 さらに、これらの保護効果の根底にある分子機構も調査されました。

材料および方法

動物。エジプトのメヌーファ大学医学部の研究倫理委員会から必要な承認を得た後、体重200〜250グラムのTirty Wisterアルビノ雄ラットが実験に使用されました（登録番号10/2022 PHYS 9）。 実験手順は ARRIVE ガイドラインに従いました。 ラットを金網ケージ(80×40×30cm)に収容した。 すべての動物には、一定の環境条件と 12:12- 時間の明暗サイクルで 2 週間調整した後、研究期間中、餌と水への完全なアクセスが与えられました。

実験計画。動物をランダムに 3 つのグループ (1 グループあたり 10 匹) に分けました。

1. 対照群: 強制経口投与により生理食塩水を摂取。

2. d-ガラクトース (D-gal) グループ: 生理食塩水に溶解した d-ガラクトース (Sigma-Aldrich、セントルイス、米国) を 100 mg/kg 体重の用量で胃洗浄により 8 週間連続投与しました 17

3. d-ガラクトースとメトホルミン (D-gal と Met) 治療群: 生理食塩水に溶解した d-ガラクトース (D-gal 群と同じ用量) とメトホルミン (Sigma-Aldrich セントルイス、米国) を投与されました。連続8週間、胃洗浄により200 mg/kg/日の用量で投与16

8 週間の完了後、すべてのラットの神経行動評価が行われました。 その後、ラットに麻酔をかけ、頸椎の伸長と脱臼により屠殺した。 脳を抽出し、リン酸緩衝食塩水(pH 7.4)で洗浄した。 左半球の重量を測定し、2 つの半分に分割しました。 そのうちの 1 つは生化学分析に使用され、残りの半分は RT-PCR 研究に使用されました。 海馬組織の組織病理学的および免疫組織化学的評価のために、右半球を 10% ホルマリン生理食塩水に固定しました。

神経行動検査。新しい物体認識。 新しい物体認識テストは、慣れ親しんだ環境で新しい物体を認識するラットの能力を評価するために使用されました。 各ラットには、慣れ、訓練、およびテストの 3 つの段階を含む 3 日間のテストが行​​われました。 馴化段階ではラットをオープンフィールド装置（50cm×50cm×40cm）に入れ、何も持たずに10分間適応させた。 各ラットは、訓練段階の間、2 つの同一の物体が入った部屋に 5 分間入れられました。 24 時間後、各ラットは、古い物体の 1 つを新しいものと交換するテスト段階で 5 分間チャンバー内に置かれました。 ストップウォッチは、物体探索の時間を計測するために使用されました。 識別指数 [=(新しい物体の探索時間 – 家族の物体の探索時間)/総探索時間×100 パーセント] を使用して、ラットの認知能力を評価します。 オープンフィールドとラットの間の物体を掃除するためにアルコールが使用されました18。

モリス水迷路。 モリス水迷路は、空間学習と記憶に対するメトホルミンの影響を調べるために使用されました。 プールはステンレス鋼製で、直径 210 cm、水面下 1 cm に水中避難台を含む高さ 50 cm でした。 水温は24±1度に維持した。 獲得タスクは、毎日 4 回のトライアルで 5 日間のテストにわたってテストされました。 各試行中に秘密のプラットフォームに到達するのに必要な時間を脱出待ち時間として記録しました。 ラットが隠れたプラットフォームを見つけるのに最大 60 秒の時間が与えられた。 最大制限時間 60 秒が割り当てられ、ラットは手動で隠れたプラットフォームに誘導されました。 5日目の最後のトライアルから24時間後に単一プローブトライアルを実施しました。 プラットフォームを取り外し、ラットを訓練象限の反対側の象限からプールに入れた。 その後、ラットを 60 秒間自由に泳がせました。 ターゲット象限で費やした時間が記録されました19。

高架十字迷路 (EPM) テスト。 EPM は、ラットの不安様行動を評価するための確立された技術です。 それは木製であり、開いたアームと閉じたアーム（長さ 50 cm × 幅 10 cm）で構成されていました。 閉じた 2 本のアームは高さ 40 cm の壁で囲まれていました。 アームは中央の正方形のプラットフォーム (10×10 cm) によって取り付けられました。 装置は床から 50 cm 上にありました。 各ラットを、閉じたアームに面して装置の中央に配置し、5分間自由に動かさせた。 腕を開いた状態と閉じた状態で費やした時間を記録しました。 また、オープンアームエントリは 20 件で記録されました。また、記憶と学習を評価するために使用される転送待ち時間 (TL) も測定します。 初日 (取得セッション) に、各ラットを EPM に 90 秒間曝露しました。 ラットが閉じた腕に到達するまでに要した時間をTLとして記録した。 90秒以内に密室に侵入できなかったラットは研究から除外された。 2 日目 (保持セッション) に、各ラットをオープンアームに置き、TL を最大 90 秒間記録しました。

生化学分析。脳組織をＰＢＳ溶液で灌流し、次いで組織グラム当たり５ｍｌの冷緩衝液中でホモジナイズした。 脳組織の遠心分離は 4000 rpm で 15 分間行われ、その後上清が除去され、従来の比色分析 (QuantiChrom™、BioAssay Systems、米国）、血清腫瘍壊死因子（TNF-）、インターロイキン 10（IL-10）、および脳由来神経栄養因子（BDNF）を、ELISA キット（Quantikine、Abcam company、Cambridge、UK）を使用してメーカーの説明に従って測定しました。説明書。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応技術 (RT‑PCR) を使用した、AMPK および PI3K 遺伝子発現の定量的アッセイ。米国の Qiagen RN Easy plus Universal Kit を使用して、全 RNA を単離するために脳組織を調製しました。 その後、RNA の品質と純度が保証されました。 RNAは使用するまで-80度で保存されました。 次に、最初のステップは、米国QiagenのQuantiTect Reverse Transcription Kitを使用し、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー（シンガポール）を1サイクルのみ使用してcDNA合成を行いました。 GAPDH プライマーは、RNA ローディング コントロールとして RT-PCR 反応に使用されました。 第 2 ステップは cDNA 増幅でした。cDNA は、米国 SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit による AMPK および PI3K 遺伝子発現の相対定量 (RQ) のための SYBR グリーンベースの定量的リアルタイム PCR で使用され、以下の設計プライマー (テキサス州ミッドランド) を使用しました。 ): AMPK のフォワード プライマーは (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC) でした。 リバースプライマーは (TGTGACTTCCAGGTCGGGAGTT) でした。 PI3K のフォワード プライマーは (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA)、リバース プライマーは (GAAACTTTTTCCCACCACGA) でした。 最後に、Applied Biosystems 7500 ソフトウェア バージョン 2.0.1 を使用したデータ分析を実行しました。 AMPK および PI3K 遺伝子発現の RQ は、比較 ΔΔCt 法を使用して実行されました。この方法では、標的遺伝子 (AMPK および PI3K) mRNA の量が、内因性参照遺伝子 (GAPDH) に対して正規化され、対照と比較されます。

脳組織の組織病理学的評価。組織学的検査。 脳組織を 10% ホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋し、厚さ 5 μm の連続冠状切片を取得しました。 次に、脳海馬の切片をヘマトキシリン・エオシン (H&E) で染色し、光学顕微鏡で検査しました。

海馬の免疫組織化学的染色。 カスパーゼ-3（CAT番号：ab32351、Abcam company 152 Grove Street Waltham、M02453、USA）およびシナプトフィジン（CAT番号：ab32127、Abcam company 152 Grove Street Waltham、M02453、USA）の免疫組織化学的染色は、ウサギを使用して実行されました。モノクローナル抗体。 Bcl-2 (CAT 番号: ab59348、Abcam company 152 Grove Street Waltham、M02453、USA) については、ウサギ ポリクローナル抗体を使用して行われました。 それらは、1 mlの抗体を含む単一のバイアルに入れられました。 抗カスパーゼ-3、抗シナプトフィジン、抗Bcl-2は、それぞれ1:50、1:400、1:100に希釈して使用しました。 切片を 5 μm で切断し、自動 LINK 48 免疫染色装置 (Dako、Agilent Technologies Inc、サンタクララ、米国) で染色しました。 熱回復には、免疫染色法によりクエン酸緩衝液を使用した。 スライドは、一次希釈抗体によって自動的に染色されました。 反応のポジティブコントロールは、正常ヒト扁桃腺、ヒト膵臓、濾胞腺腫のそれぞれカスパーゼ-3、シナプトフィジン、Bcl-2の特定のパラフィン包埋切片を使用して実施されました。 ネガティブコントロールは、一次抗体を非免疫血清に置き換えることによって作成されました。

組織病理学および免疫組織化学マーカー（カスパーゼ-3、シナプトフィジン、Bcl-2）の評価は、CA1、CA2、CA3を含む海馬のさまざまな領域で行われました。

統計分析。結果は平均±標準偏差 (SD) として表されます。 Origin® ソフトウェアと偶然の確率 (p 値) を使用して、分散分析 (ANOVA) をさまざまなグループの統計分析に使用しました。 P値<0.05 were considered significant.

倫理の承認と参加への同意。この研究は、エジプトのメヌーファ大学医学部の倫理委員会のガイドラインによって承認されました。

結果

神経行動検査。新規物体検査に関しては、対照群と比較して D-gal 群の識別指数の割合が有意に低かった (-37.16±3.31 パーセント対 30.16±2.92 パーセント、それぞれ、P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

モリス迷路試験に関しては、D-gal 群の脱出潜伏期間の平均値が対照群と比較して 1 日目、2 日目、3 日目、4 日目、5 日目で有意に高かった（58.16±1.94、4{ {19}}.62±1.33、32.75±1.10、24.37±1.58、および15.29±0.98秒対40.16±2.92、25.16±1.15、17.04±1.08、11.75±1.31、および5.83±0。 86 秒、それぞれ P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

高架十字迷路試験では、ラットがオープンアームで過ごした時間の平均値は、対照群と比較して D-gal 群で有意に低かった (それぞれ 60±6.54 秒 vs 90.83±3.48 秒) 、P<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

生化学検査。脳のMDAレベルの平均値は対照群と比較してD-gal群で有意に高かったが、脳のSODレベルの平均値は有意に低かった（70±3.23nmol/mgタンパク質および13.05±1。{{7 }} U/mg タンパク質 vs それぞれ 33.76±2.13 nmol/mg タンパク質および 29.11±4.34 U/mg タンパク質、P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

脳のTNF-レベルの平均値は有意に高かったが、脳のIL-10レベルの平均値は、対照群と比較してD-gal群で有意に低かった(67.50±10.03pg/mgタンパク質および72.91pg/mgタンパク質)。 ±8.45 pg/mg タンパク質 vs. それぞれ 16.61 ±1.21 pg/mg タンパク質および 157.23 ±12.46 pg/mg タンパク質、P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

脳のBDNFレベルの平均値は、対照群と比較した場合、D-gal群で有意に低かった（それぞれ125.72±4.17 pg/mgタンパク質対225.20±5.52 pg/mgタンパク質、P）<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

定量的 RT-PCR (qRT-PCR)。 AMPK および PI3k 遺伝子の発現 (それぞれ 0.52±0.11 および 0.37±0.03、P)<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) を対照群と比較した場合 (図 6)。

病理組織学。対照群の海馬組織の H&E 染色では、目立った病理学的変化は見られませんでした。 D-gal グループは、大量の浮腫と神経膠症を伴う、多くの神経変性とアポトーシス小体を示しました。 しかしながら、Ｄ－ｇａｌ＋Ｍｅｔグループ切片は、神経変性をほとんど示さず、軽度の浮腫および軽度の限局性グリオーシスを伴うアポトーシス小体をほとんど示さなかった（図７）。

免疫組織化学。 免疫組織化学的結果により、海馬組織におけるシナプトフィジン発現の H スコア値が有意に低いことが明らかになりました (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

海馬組織におけるカスパーゼ-3発現のHスコア値は有意に高かった(P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

海馬組織における Bcl-2 発現の H スコア値は有意に低かった (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

議論

平均寿命の延長により、高齢者の病気のリスク、特に認知領域での病気のリスクが増加しますが、これは少なくとも部分的には脳の神経細胞の喪失が原因である可能性があります。 d-ガラクトースの長期注射が老化の進行、軽度の神経損傷および記憶障害の一因となることは広く受け入れられています。 D-gal 誘発性の老化には神経変性が伴うため、加齢に伴う神経変性に関与する分子機構を研究し、新しい治療法をテストするための理想的なモデルとなる可能性があります 22。

私たちの研究は、D-galの慢性投与がラットの新規性誘発探索行動と作業記憶を損なうことを示しました。 これは、新しい物体であるモリス水迷路と高架十字迷路のテストの結果から明らかでした。 これらの結果は、他の報告された研究と一致していました23。 一方で; メトホルミンによる治療は、D-gal 群と比較して作業記憶と新規性への嗜好を改善しました。 私たちの結果を裏付けるように、以前の研究では、メトホルミンがストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスの短期記憶を改善したと報告しました24。 老化は認知機能の低下だけでなく、機能障害を引き起こす不安様行動などの感情の変化とも関連していることが十分に文書化されています25。 本研究では、EPM テストの結果、対照群と比較した場合、D-gal 群では不安様行動の増加が示されました。 メトホルミンによる治療中、不安様行動は軽減されました。

本研究により、D-galの経口投与によって引き起こされる神経行動変化には、脳の酸化ストレスマーカーの乱れが伴うことが明らかになった。 脳組織ホモジネート中のMDAレベルの平均値は有意に高かったが、抗酸化酵素SODの活性は対照群と比較してD-gal群で有意に低かった。 同様の結果が以前に報告されました23,26。 D-gal は、非酵素的糖化を介してタンパク質構造内のさまざまな遊離アミンと相互作用し、高度な糖化生成物が生成されます。 その結果、ROS が生成され、DNA、脂質、タンパク質への酸化損傷を介して脳の老化が促進されます。 D-gal の慢性投与によって引き起こされる記憶喪失と学習障害は、神経新生の障害、そして最終的には神経変性を引き起こすフリーラジカルの生成に起因している可能性があります 27。 さらに、脳ニューロンは、脂質含有量が高く酸素消費量が多いため、酸化ストレスの影響を受けやすくなっています26。

逆に、メトホルミン投与は酸化還元バランスを著しく回復させた。 メトホルミンがミトコンドリア透過性移行細孔 (mPTP) を阻害し、ROS 生成と脂質過酸化を減少させることができるという証拠が示されています 28。 したがって、これは、メトホルミンの抗老化効果がその抗酸化防御によって媒介される可能性があることを示しています。

酸化ストレスに加えて、炎症も D-gal 治療の重要な老化誘発メカニズムです。 D-gal は、炎症経路を活性化する ROS の生成を促進します 3。 慢性神経炎症と炎症誘発性サイトカインの分泌は老化の特徴です29。 炎症性サイトカインが酸化ストレスに関与しているという点では一致しています。 TNF-、IL-6、IL-1は酸化ストレスの発生と進行に不可欠です。 これらのサイトカインは ROS と関連しており、核因子-κB (NF-κB) を活性化して核に移行させ、炎症反応や免疫反応に関与する iNOS や COX2 などの炎症誘発性遺伝子の発現を調節し、その結果、臓器損傷を引き起こす線維症、アポトーシス、および急性期反応30。 対照群と比較して D-gal 群では TNF-α のレベルが有意に高く、IL-10 が有意に低かったため、前述のデータは我々の結果と一致しました。

一方、メトホルミンによる治療では、D-gal グループと比較して炎症マーカーが大幅に減少しました。 メトホルミンの抗炎症効果は、NF-κB29 の阻害によって炎症反応を抑制する AMPK シグナル伝達の活性化に起因すると考えられます。 また、脳内の炎症誘発性サイトカインの産生とミクログリアの活性化が減少し、その結果、酸化ストレスが減少します30。

メトホルミンの作用の根底にある分子機構をさらに理解するために、AMPK と PI3k のタンパク質発現を調べました。 私たちの研究では、AMPKの発現が対照群と比較してD-gal群で有意に下方制御されているのに対し、メトホルミン治療群ではD-gal群と比較してそのレベルが有意に上方制御されていることが明らかになりました。 以前の研究では、年齢とともにAMPKの活性化とAMPKの応答性が低下することが報告されており、これが代謝制御の変化を説明し、結果としてオートファジーの減少と酸化ストレスの増加を引き起こす可能性があります31。 メトホルミンは、Tr-17232 での AMPK のリン酸化を増加させることによって AMPK を活性化することが判明しました。 AMPK は、認知障害に対する保護機能のメトホルミンの主な標的です。 ガデルネザドら。 は、メトホルミンによるAMPKの活性化が海馬ニューロンのBDNF/P70S6K経路の活性化をもたらし、全脳虚血/再灌流ラットモデルにおける受動的回避課題における記憶の形成を促進することを報告した。 BDNF の活性化は、学習、記憶、シナプス伝達、可塑性などの神経認知機能の調節に重要な役割を果たしています 33。いくつかの研究では、AMPK が長期増強 (LTP) のモジュレーターとして作用する可能性があり、記憶形成に必要であることが実証されています 34 。 したがって、私たちの研究におけるメトホルミン誘発性の記憶改善は、AMPK シグナル伝達の活性化によって媒介される可能性があります。

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