CistancheTubulosaからの新しいクマリングリコシルトランスフェラーゼCtUGT1の分子クローニングと生化学的特性化

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Xiping Xu、et al

概要

UDP-グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）は、二次代謝産物の生合成に関与する重要で機能的に多様な酵素ファミリーです。 クマリンは、候補となる薬理活性を持つ天然物の最も一般的な骨格の1つです。 しかし、今日まで、植物から報告された多くのGTは、主にフラボノイドを糖受容体として認識していました。 限られたGTだけがクマリンのグリコシル化を触媒することができました。 この研究では、新しいUGTがからクローン化されましたカンカニクジュヨウ、フェニルエタノイド配糖体、リグナン配糖体、イリドイド配糖体などの多様な配糖体が豊富な、貴重な伝統的な強壮剤である中国のハーブ。 配列アラインメントと系統発生分析は、CtUGT1報告されているフラボノイドUGTのほとんどから系統発生的に離れており、フェニルプロパノイドUGTに隣接しています。 広範なinvitro酵素アッセイにより、CtUGT1で生物活性配糖体の生合成に関与していなかったカンカニクジュヨウ、それはかなりの収量でクマリンウンベリフェロン1、エスクレチン2、およびハイメクロモン3のグルコシル化を触媒することができます。 グリコシル化生成物は、参照標準またはNMR分光法との比較によって同定され、結果は次のことを示しました。CtUGT1C7-OH位置でヒドロキシルクマリンのグルコシル化を位置特異的に触媒することができます。 決定した重要な残基CtUGT1の活動は、ホモロジーモデリングと分子ドッキング分析に基づいてさらに議論されました。 部位特異的変異誘発の結果と組み合わせると、H19が重要な触媒作用の基礎としてかけがえのない役割を果たしていることがわかりました。CtUGT1生物活性クマリン配糖体の酵素的調製に使用できます。

キーワード：植物糖転移酵素、クマリン配糖体、カンカニクジュヨウ、ホモロジーモデリング、部位特異的変異誘発

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序章

グリコシル化は、二次天然物の最も一般的な構造修飾タイプの1つです。 グリコシル化は、アグリコンの安定性および/または溶解性を変化させる可能性があり、複数の共役タイプにより、天然/非天然産物の多様性に大きく貢献する可能性があります。 植物では、これらの反応は通常、活性化ヌクレオチド糖から炭水化物、グリコシド、オリゴ糖である糖受容体分子への単糖部分の移動を触媒する一種の酵素であるウリジン二リン酸（UDP）依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）によって行われました。 、または多糖類[1,2]

現在まで、UGTをコードする多くの遺伝子がいくつかの植物から単離されています[3]。 グリコシル化は主に、フラボノイド[4]、フェニルプロパノイド[5]、テルペノイド[6]、ステロイド[7]、アルカロイド[8]などの幅広い二次生成物のヒドロキシル基またはカルボキシル基で起こりました。 クマリンは、多くの植物種に広く分布しているフェニルプロパノイド代謝物です。 天然に存在するクマリンは複合糖質として存在することが多く、これらの誘導体は、抗酸化剤[9]、抗ウイルス剤[10,11]、肝保護剤[12]、抗炎症剤[13]、抗癌剤[14]などの幅広い薬理活性を示しました。 ]、抗変異原性[15]、コリンエステラーゼ（ChE）およびモノアミンオキシダーゼ（MAO）阻害活性[14,15]など。糖部分をクマリンに移すことができると報告されています[16–18]。

多様なグリコシドが豊富な植物は、新しい触媒活性を持つUGTの理想的な遺伝子プールとして役立つ可能性があります。 さらに、多くのUGTは、複数の基質のグリコシル化を触媒するかなりのアクセプター乱交を持っていると報告されており、そのいくつかは植物で分離されていませんでした[19]。 この記事では、新しいグリコシルトランスフェラーゼCtUGT1から識別されましたカンカニクジュヨウ、フェニルエタノイド配糖体（PhG）、リグナン配糖体、イリドイド配糖体などの多様な配糖体が豊富な伝統的な薬草。 異種発現および機能の特徴づけは、組換えであるがCtUGT1これらの配糖体の生合成には関与していませんでしたカンカニクジュヨウ、それはヒドロキシルクマリンのグルコシル化を触媒することができ、反応はクマリンウンベリフェロン1、エスカレート2、およびハイメクロモン3の7- OH位置で位置特異的に起こり、3つの薬理学的に活性な化合物スキミング（1a）、シコリジン（2a）を生成します。 、および4-メチルウンベリフェリルグルコシド（3a）で、それぞれかなりの収率が得られます。 さらに、ベンゾフェノン基質4,4'-ジヒドロキシベンゾフェノン（4）、イソフラボン基質ゲニステイン（5）、およびアントラキノン基質アロエエモジン（6）も、CtUGT1。 の触媒能力を強調する触媒特性と重要な残基CtUGT1また、ホモロジーモデリング、AutoDock分析、および部位特異的変異誘発に基づいて評価されました。

2。実験

2.1。 植物材料と化学物質

カンカニクジュヨウこの研究で使用されたのは、新疆ウイグル自治区のヘティアンの砂漠地帯から収集されたものです。 彼らの植物のアイデンティティは、北京大学のPengfeiTu教授によって確認されました。 この研究でテストされたクマリンおよびその他の基質は、Sigma-Aldrich（米国、セントルイス）、Chengdu Push Biotechnology Co.、Ltd.（中国、成都）、およびChengdu Biopurify Phytochemicals Co.、Ltd.（中国、成都）から購入しました。 ） 特に明記しない限り。 スキミング（1a）およびシコリイン（2a）の参照標準は、武漢Chem Faces Biochemical Co.、Ltd.（武漢、中国）から購入しました。

2.2。 CistanchetubulosaからのCtUGT1の分子クローニング

のトータルRNAカンカニクジュヨウOMEGA Plant RNA Kit（GA、USA）を使用して肉質の茎から抽出し、PrimeScript™RT試薬キット（TaKaRa、Japan）を使用して、製造元の指示に従ってcDNAに逆転写しました。 縮重プライマーは、植物グリコシルトランスフェラーゼの保存されたPSPG（植物二次産物グリコシルトランスフェラーゼ）ボックスのアミノ酸配列に基づいて3'RACE用に設計されました。 の3'末端および5'末端増幅CtUGT1Smart RACE cDNA Amplification Kit（Clontech、USA）を使用し、プライマーを使用したメーカーのプロトコルに従って実施しました（表S1）。 の完全長cDNACtUGT1KOD-Plus Neo DNAポリメラーゼ（東洋紡、日本）と遺伝子特異的プライマーペア（表S1）を使用したPCRにより、次の条件下で増幅されました：94°Cで2分間の初期変性ステップ、続いて35サイクルの変性98°Cで15秒間、55°Cで30秒間のアニーリング、68°Cで55秒間の伸長、68°Cで7分間の最終伸長ステップ。 得られたすべてのDNAフラグメントをpEASY-Bluntベクター（TransGen Biotech、中国）にクローニングし、配列を決定しました。

2.3。 配列アラインメントと系統発生分析

の配列アラインメントCtUGT1報告されているグリコシルトランスフェラーゼ（表S2）は、DNAMAN 4. 0ソフトウェアパッケージ（Lynnon Biosoft、カナダ）を使用して実行されました。 モチーフとドメインは、保存されたドメインツール（http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）を使用して分析されました。 系統樹は、MEGA 7。0。14ソフトウェアを、1000回のブートストラップ複製による近隣結合法を使用してブートストラップすることによって構築されました[20]。 の翻訳されたタンパク質配列CtUGT1ClustalWを使用してNCBIGenBankデータベース（表S3）に寄託された既知の植物グリコシルトランスフェラーゼとアラインメントしました。

2.4。 大腸菌におけるCtUGT1の異種発現とタンパク質精製

のコーディング領域CtUGT1表S1に示すプライマーを使用して、制限部位としてBamHIおよびNotIを使用して増幅しました。 PCR反応は、KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼ（TOYOBO、大阪、日本）を使用して実施しました。 得られた配列は、pEASY-Bluntベクター（TransGen Biotech、中国）にクローニングすることにより検証されました。 の確認された増幅産物CtUGT1続いて消化され、発現ベクターpET -28 a（plus）（Novagen、USA）にサブクローニングされました。 次に、検証された構築物を大腸菌トランセッタ（DE3）に形質転換して、組換え株を得た。 組換え株の一晩培養物を、5 0 ug・mL-1カナマイシンと4 0 ug・mL-1クロロミセチンを1：1の比率で含むLuria-Bertani（LB）培地に接種しました{{ 19}}0。 培養物は、OD600値が0.4〜0.6に達するまで、37°C​​、200rpmで培養されました。 続いてイソプロピル- -D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.5 mMになるように添加し、細胞を18°C、180rpmで16時間増殖させました。 次に、細胞ペレットを遠心分離（7600×g、10分、4°C）で回収し、3 mL / gの冷却溶解バッファー（補足データ注1）に再懸濁し、氷上で超音波処理して破砕しました。 細胞破片は、7600×g、4°Cで約30分間の遠心分離によって除去されました。 事前に平衡化したHistrapカラム（GE Healthcare、スウェーデン、ウプサラ）を、製造元の指示に従ってアフィニティークロマトグラフィーに使用しました。 組換えタンパク質は、250 mMイミダゾールを含む10カラム容量の溶出バッファー（補足データ注1）で溶出しました。 タンパク質の純度を10％SDS-PAGEで分析しました。 精製したタンパク質を30kDa限外ろ過チューブ（Sigma-Aldrich、米国）で濃縮し、脱塩バッファー（補足データ注1）を備えたPD-10カラム（GE Healthcare、スウェーデン、ウプサラ）を使用して脱塩しました。 タンパク質濃度は、BSAを標準として使用するブラッドフォード法によって決定されました。

2.5。 CtUGT1の酵素活性アッセイと基質特異性

のグリコシル化活性を調査するにはCtUGT1、酵素アッセイは、0 .4 mMアグリコン、0.8 mM UDP-グルコース（UDPG）、および50 ugの精製物で構成される反応混合物（15 0μL）で実施しました。CtUGT1脱塩バッファー中のタンパク質。 すべての反応を30◦Cで12時間インキュベートし、300μLの冷メタノールを添加して終了させました。 混合物を15、000×gで30分間遠心分離し、HPLC-UV/ESI-MS分析用の上清を収集しました。 各反応について、3つの並行アッセイを日常的に実施しました。 HPLC（Agilent 1260、USA）には、ダイオードアレイ検出器とCAPCELL PAK C18カラム（250mm×4.6mm、5μm、資生堂、日本）を流量1 mL・min-1、カラム温度で装備しました。 30°Cに維持されました。 移動相は、A（すなわち、0.1パーセントのギ酸水溶液）とB（すなわち、アセトニトリル）で構成されていました。 グラジエントプログラムを表S4に示しました。 HRESI-MSデータは、衝突ガスとして超高純度He、噴霧ガスとしてN2を備えたESIインターフェース（島津製作所、京都、日本）を備えたLCMS-IT-TOFシステムで記録されました。 最適化されたESIソースパラメータは次のとおりです。シースガス流量、1.5mL・min-1。 補助ガス流量、1.5mL・min-1; スプレー電圧、4.5 kV; キャピラリー温度、200°C。 フルスキャンMS分析では、スペクトルを100〜1500 m/zの範囲で記録しました。

2.6。 CtUGT1の酵素活性、および速度論的研究に対する反応時間、pH値および温度の影響

の酵素活性に対する反応時間、pH値、および温度の影響CtUGT1上記の反応条件で、UDPGを糖供与体として、3を糖受容体として使用して試験した。 最適なpHを決定するために、1 0 0 mMバッファー（クエン酸-クエン酸ナトリウム）でpH値を3.0から6.{{の範囲で酵素活性を比較しました。 14}}、1 0 {{2 0}} mMバッファー（KH2PO 4- K2HPO4）、pH値は6。0から8の範囲。{{29} }、pH値が7.0から9.0の範囲の1 0 0 mMバッファー（Tris-HCl）、pH値が9.0から11.0の範囲の100 mMバッファー（Na2CO 3- NaHCO3）。 最適な反応温度をアッセイするために、反応を0〜65°Cの範囲のさまざまな温度でインキュベートしました。 反応の時間経過は、0〜24時間の12の異なる時点で評価されました。 すべての実験は3回行った。 反応混合物を上記のようにHPLC-MSによって分析した。 の速度論的研究のためにCtUGT1、酵素アッセイは、100 mM KH2PO 4- K2HPO4バッファー（pH 8.0）、25ugの精製物を含む最終容量100μLで実施しました。CtUGT1、3 mMのUDPG、およびさまざまな濃度（50〜3000μM）の3。反応は37°Cで30分間行い、100μLの氷冷メタノールで終了しました。 これらの反応はすべて3回行い、酵素活性は対応するグルコシル化誘導体の定量化によって評価しました。 ミカエリスメンテン定数（Km）およびVmaxを含む速度論的パラメーターは、GraphPadPrism5ソフトウェアを使用した非線形回帰分析によって計算されました。

2.7。 CtUGT1の基質および糖供与体の選択性

の基質の好みを探求するCtUGT1、異なる構造タイプに属する合計27の基質が、UDPGをドナーとして使用してテストされました。 それらの化学的情報を表S5に示し、それらの構造を図1および2に示しました。 S1およびS2。 糖供与体の選択性を調査するにはCtUGT1、ウンベリフェロン（1）、エスクレチン（2）、ハイメクロモン（3）、4,4'-ジヒドロキシベンゾフェノン（4）、ゲニスタイン（5）、およびアロエエモジン（6）をUDPG、UDP- Nアセチルガラクトサミン、UDP-ガラクトース、GDP-マンノース、GDP-フコース、UDPガラクツロン酸、UDP-ラムノースをそれぞれ糖供与体として。 すべての実験は3回行った。 反応混合物を上記のようにHPLC-MSによって分析した。

2.8。 CtUGT1による4-メチルウンベリフェリルグルコシド（化合物3a）の調製

分取反応混合物は、{{0}}。034ミリモルの基質化合物3、0.04ミリモルのUDPG、5mgの精製物から構成されていた。CtUGT150mLの反応バッファー中。 反応物を最適条件（100 mM KH2PO 4- K2HPO4、pH 8.0; 37°C）で穏やかに攪拌しました。 37°Cで24時間インキュベートした後、12、000×gで30分間遠心分離した後、マクロポーラスレジン（MCI GEL CHP）を使用したカラムクロマトグラフィーで反応上清を分離しました。 移動相は、100％水から100％メタノールへのグラジエント溶出でした。 各画分をHPLC-UVで分析した。 標的生成物のみを含む画分は、減圧下で蒸発乾固し、1H核磁気共鳴（NMR）分光法および13CNMR分光法によって特徴付けられた。

2.9。 CtUGT1の分子ドッキングと部位特異的変異誘発

のタンパク質モデルCtUGT1SWISS-MODEL [21–25]を使用して確立されました。 テンプレート構造として、Medicago truncatulaグリコシルトランスフェラーゼUGT85H2（PDB ID 2PQ6）の結晶構造が選択されました[26]。 確立されたモデルは、VERIFY -3D[27,28]によって評価されました。 Auto-Dock Vinaは、分子ドッキング研究に使用されました[29]。 シロイヌナズナ由来のグリコシルトランスフェラーゼであるUGT74F2[30]の結晶構造を、リガンドUDPおよびサリチル酸（PDB ID 5U6M）と複合体として、それぞれ糖供与体ポケットおよび糖受容体ポケット分析の制御構造として使用しました。 。 MGLTools（Molecular Graphics Laboratoryツール）のAuto-Dock-Tools 1.5.6を使用して、分子ドッキング用の糖供与体UDPGと基質1、2を調製しました。 活性部位の空洞の周りの残基の側鎖は柔軟に設定され、リガンドの回転可能な結合は自由に回転できるようにされました。 親和性が最も高い（kcat / mol）Vinaドッキングモデルによって判断された上位のポーズを、PyMOL2.0ソフトウェアを使用して視覚的に分析しました。

突然変異誘発の調査のために、配列最適化された遺伝子CtUGT1（補足データ注2）は、野生型として合成および試験されました。 の部位特異的変異誘発CtUGT1Fast Mutagenesis System（TransGen Biotech）を使用して実施されました。 変異体は、表S1に示す特定のプライマーを使用して、pET-28aベクターに構築された最適化された遺伝子のテンプレートから増幅されました。 構築された変異体は、異種発現のために大腸菌（DE3）に形質転換される前に、PCRとシーケンシングによって検証されました。 タンパク質精製および酵素反応は、上記のように実施および分析された。

3。結果と考察

3.1。 からのCtUGT1遺伝子の完全長cDNAクローニングカンカニクジュヨウ

カンカニクジュヨウ（L.）（RouCongRong）は、多種多様な生物活性のある天然配糖体を生成する伝統的な中国の薬草です。 そのゲノムにはかなりの数の新しいグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が存在するはずです。 興味深い触媒活性を持つ新規のグリコシルトランスフェラーゼを探すために、保存されたPSPGモチーフに基づいて3'-RACEの縮重プライマーを設計し、カンカニクジュヨウ。 得られた３'末端配列をＮＣＢＩブラストによりさらに分析し、得られた配列に基づいて５'－ＲＡＣＥの特異的プライマーを設計した。 増幅された5'cDNA末端と3'cDNA末端をスプライシングし、CtUGT11739ヌクレオチドを含む配列が得られ（図S3）、補足データ注3に記載されています。その後、オープンリーディングフレーム（ORF）CtUGT1はNCBIORFFinderツールによって検出され、1482 bpのコード配列は、表S1の特定のプライマーを使用したRT-PCR増幅によって正常にクローン化されました。 CtUGT1のcDNA配列はNCBI（受入番号MW629113）に提出されています。

3.2。 CtUGT1の配列分析と異種発現

TheCtUGT1遺伝子は、推定分子量55.78kDaの493アミノ酸残基のタンパク質をコードすると予想されました。 NCBIブラストは、CtUGT1UGT 86 A 1-のような酵素と最高の同一性（76.39パーセント）を共有します。 この種の酵素の生化学的機能は完全には特徴付けられていません。 それらは非生物的ストレスへの植物の適応に関与している可能性があると予測されています。 CtUGT1と他の植物グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを図S4に示します。

PSPGモチーフの高度に保存された44残基がCtUGT1。 PSPGボックス内では、HCGWNSのペプチド配列が373番目のアミノ酸に位置しており、これはすべてのグリコシルトランスフェラーゼの95％で検出されています[31]。 PSPGモチーフの最後の残基はグルタミンでした。これは、この酵素が糖供与体としてUDPGを使用する傾向があることを示しています[32]（図S4）。 系統樹は、予測されたポリペプチド配列に基づいて構築されました。CtUGT1さまざまな二次代謝産物の生合成に関与したさまざまな種類の植物由来のグリコシルトランスフェラーゼ。 これまでのところ、植物から報告されたグリコシルトランスフェラーゼのほとんどは、フラボン7- O-グリコシルトランスフェラーゼ、フラボノイド3- O-グルコシルトランスフェラーゼ、イソフラボン7- O-グリコシルトランスフェラーゼ、カルコングリコシルトランスフェラーゼ。 系統発生分析の結果は、CtUGT1フラボノイドGTのクレードにグループ化されていません。 代わりに、UGT74T1とUGT74S1（Linum usitatissimumのリグナングリコシルトランスフェラーゼ）およびNtGT2（Nicotiana tabacumのクマリングリコシルトランスフェラーゼ）に隣接して配置されており、CtUGT1フェニルプロパノイド基質に対していくつかの新しい触媒活性を持っている可能性があり（図1）、特にこれらのクレードに属する限られたメンバーのみが機能的に同定されていると考えられます。

その触媒活性をさらに明らかにするために、CtUGT1配列は、E。coli Transetta（DE3）細胞のT7 lacプロモーターの制御下で、His6-タグ付き融合タンパク質として発現しました。 Hisタグ付き組換え体CtUGT1Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に均一に精製されました。 精製された組換えCtUGT1の分子量は約55kDaであり（図S5）、これは予測された分子量と一致しています。

3.3。 CtUGT1のinvitroアクセプター基質特異性

のグリコシル化活性をテストするにはCtUGT1、invitro酵素アッセイを実施した。 UDPGは糖供与体として使用されました。 砂糖受容体は、さまざまな懸念に基づいて選択されました。 まず、CtUGT1遺伝子はからクローン化されましたカンカニクジュヨウその主な化学成分はPhGです。 かどうかを確認するにはCtUGT1のPhGの一般的なアグリコンであるPhGの生合成に関与していますカンカニクジュヨウチロソール（NP1、図S2）やサリドロシド（NP2、図S2）などが最初に基質として選択されました。 残念ながら、HPLCおよびHRESI-MS分析では、グリコシル化された生成物は検出されませんでした。CtUGT1PhGの生合成には関与していない可能性があります。

第二に、配列アラインメントと系統発生分析の結果（図1）に基づいて、CtUGT1系統発生的にリグナノイドおよびクマリングリコシルトランスフェラーゼと関連していたことから、CtUGT1おそらくフェニルプロパノイドグリコシルトランスフェラーゼです。 この予測を検証するために、3つのクマリン基質1、2、および3と1つのリグナノイド基質マグノロールNP17を、それぞれ糖受容体としてテストしました。 熱不活化酵素（100°C、10分）をネガティブコントロールとして使用しました。 基質としてNP17を使用した反応のHPLC-HRESI-MS分析では、生成物は見つかりませんでした。 対照的に、CtUGT1テストされたクマリン基質に対して明らかなグルコシル化能力を示しました（1,2,3）。 例として基質1を使用すると、図2Aに示すように、基質1（19.75分）と比較して保持時間（11.46分）が短縮された新しいピーク（1a）が生成されました。CtUGT137.78パーセントの収率で。 そのUV吸収スペクトルは1に対応します。HRESI-MSスペクトルは、ピーク1aがm /z325.1029で[MplusH] plusを示し、m / z347.0710で[MplusNa] plusを示したことを示しました（C15H16O8Naの計算値347.0737 ）C15H16O8の予測式は、1より162 amu大きく、グルコシル化生成物の理論式と一致しています（図2A）。 同様に、基質2（14.21分、図2B）および3（21.92分、図2C）のグルコシル化生成物も、保持時間10.85分および13.80分で検出され、変換率は22.03パーセントおよび68.67パーセントでした。 、 それぞれ。 生成物の分子量は、グルコシル化生成物の計算された質量と正確に一致し、これにより、CtUGT1クマリン化合物1〜3のグルコシル化を触媒する可能性があります（表1）。

続いて、最近報告された酵素のほとんどがin vitroで触媒作用の乱交を示したことを考慮して、CtUGT1、フラボノイド、フェノール化合物、クマリン、スチルベン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ナフタレン、イリドイドなど、さまざまな種類の天然物に属する多様な化合物に対して、UDPGを使用して広範な酵素アッセイを実施しました（図S 1- S2）。砂糖のドナー。 ベンゾフェノン基質4,4'-ジヒドロキシベンゾフェノン（4）、イソフラボン基質ゲニステイン（5）、およびアントラキノン基質アロエエモジン（6）も、CtUGT1対応するグルコシル化生成物4a、5a、6aをより高い極性で形成します（図3）。 HRESI-MS分析は、生成物のイオンピークがすべて基質のイオンピークより162 amu大きいことを示し、CtUGT1これらの化合物のグルコシル化を触媒して、対応するモノグルコシド生成物を形成する可能性があります。 4、5、6の変換率はそれぞれ4.12パーセント、14.14パーセント、23.33パーセントでした（表1）。

の糖供与体選択性CtUGT1も探求されました。 UDPGに加えて、UDP-N-アセチルガラクトサミン、UDPガラクトース、GDP-マンノース、GDP-フコース、UDP-ガラクツロン酸、UDPラムノースを含む6つのドナーが、基質1〜6をアクセプターとして使用してテストされました。 結果は次のことを示しましたCtUGT1糖供与体としてUDPGのみを選択。 他の活性化糖をテストした場合、生成物は観察されませんでした（データは示していません）。

3.4。 CtUGT1の生化学的特性と速度論的パラメーター

の生化学的性質CtUGT1図4に示すように、糖受容体として3を、糖供与体としてUDPGを使用して調査しました。CtUGT14〜6 0°Cの温度範囲でテストされ、37°C​​で最適なアクティビティが検出されました（図4A）。 pH 3。0と9。0の間の酵素活性の分析は、最適なpH値がpH 8.0（100mMバッファーKH2PO4- K2HPO4、図4C）で観察されたことを示しました。 グルコシル化産物3aの収量は1時間以内に直線的に増加し、成長速度は5時間後に横ばいになりました（図4B）。 の見かけのKm値CtUGT13の場合は218.7±7.176μM、Vmaxは0でした。02255±0.0001796nmol⋅min-1⋅ug-1。

3.5。 グルコシル化生成物の酵素的調製および構造的同定

酵素アッセイの結果に基づいて、CtUGT1さまざまな種類の天然物のグルコシル化を触媒する可能性のある特定のグルコシルトランスフェラーゼである傾向があります。 製品のHPLC-HR-MS情報を表1にまとめました。その中で、クマリン基質はかなりの変換率を示しました。 クマリンに対する酵素活性をさらに分析した。 テストされた3つのクマリン基質すべてがCtUGT1エスクレチン（2）はC -6の位置に余分なヒドロキシル基を持っていますが、C-7の位置にヒドロキシル基を持っています。 エスクレチンのグルコシル化生成物のHPLCプロファイルを図2に示します。単一の生成物のみが観察され、グルコシル化反応がC-6またはC-7の位置で位置特異的に起こったことを示唆しています。 グリコシル化部位を確認するために、HPLC-UV / HRESI-MS分析による本物のグルコシドとの比較により、生成物2aを同定しました。 本物のグルコシドシコリジン（2の7- OH位置でグルコシル化）を反応系に加えると、ピークが2aと重なり、co-HPLCプロファイルにより、2のグリコシル化生成物がCtUGT1はシコリジン[33]であり、これは、グルコシル部分がC7-OH位置に特異的に転移していることを証明しています。 製品1aは、参照標準との比較によっても識別されました。 UV-HPLCスペクトルとco-HPLC分析（図2）により、1aの化学構造はスキミング[34]に起因することが明らかになりました。これは、C7-OH位置での1のグルコシル化生成物です。

生成物3aは、スケールアップされた反応から調製され、HRESI-MS、1H NMR、および13C NMR分光法によって構造的に特徴付けられました（図S13、S14、および注4）。 1H NMRシグナルでは、基質3と比較して、C {{1 0}}位置のフェノール性ヒドロキシルシグナルが消失し、C-7の炭素シグナルがδ1をシフトしました。{{25} 13C NMRでは、C-6およびC-8信号が低磁場にシフトしているのに対し、}ppmは高磁場にシフトしています。 これらの発見により、グルコピラノシル残基が3のC-7位でフェノール性ヒドロキシル基に結合していることが確認されました[35]。 さらに、1H NMRスペクトルは、δH5。00（1H、d、J= 7。0Hz）でアノマープロトンシグナルを示しました。 糖成分は-D-グルコピラノースであることが示された。 この結果は実証されましたCtUGT1は、7-OH位置でヒドロキシルクマリンのグルコシル化を触媒するクマリンO-グルコシルトランスフェラーゼです。

3.6。 CtUGT1タンパク質のホモロジーモデリング、分子ドッキング、および部位特異的変異誘発

広範な酵素反応により、CtUGT13つのクマリンの対応するグルコシル化生成物へのグルコシル化を触媒する可能性があり、グルコシル化位置は特に7-OH位置で発生しました。 の触媒活性を決定した重要な残基を特定するCtUGT1、ホモロジーモデリング、分子ドッキング、およびCtUGT1の部位特異的変異誘発の調査が実施されました。 CtUGT1の相同分子モデリングは、SWISS-MODEL [21–25]を使用して確立されました。 2.1Åの分解能で決定されたMedicagotruncatulaグリコシルトランスフェラーゼUGT85H2（PDB ID 2PQ6）の結晶構造は、最大の配列相同性と低いE値で最高の合計スコアを示し、テンプレート構造として選択されました[26]。 確立されたモデルの合理性評価はラマチャンドランプロット（図S6）に示され、確立されたモデルの残基の88.5パーセントが最も好ましい領域にあります。 CtUGT1のホモロジーモデルは、それぞれN末端とC末端にある2つの類似したロスマン型フォールドモチーフで構成されています（図5A）。 N末端ドメインには、10本のらせんが周りに7本の平行なシートがあります。 C末端ドメインには、9つのヘリックスが隣接する6本鎖シートが含まれています（図5A、S7）。

のアクティブポケットをさらに明確にするためにCtUGT1、分子ドッキングが実行されました。 UGT85H2はアポ型構造しかないため、UDPとサリチル酸の両方を2つのリガンドとして持つ別のホモログUGT74F2をコントロールテンプレートとして選択しました。 UDPGは糖供与体として調製されました。 2つのクマリン基質1と2をそれぞれ糖受容体として調製しました。 グリコシルドナーとアクセプターの結合部位を計算し、図5に示すように別々にドッキングしました。結果は、2つの結合ポケットの両方が密に詰まったN末端ドメインとCの相互作用領域の深い裂け目の内側にあることを示しました。 -の末端ドメインCtUGT1互いに空間的に近い（図5A）。 のC末端CtUGT1他の植物のUGTに記載されているように、主にグリコシル供与体との接触に関与しており、周囲の残基のほとんどは親水性であり、高度に保存されています。 典型的なPSPGボックスのように、このモチーフの残基W377は、UDPGのグルコース基と水素結合を形成する可能性があります（図5B）。 このモチーフのN378およびS379は、UDPGの二リン酸基と水素結合を形成する可能性があります（図5B）。 さらに、ドッキングの結果によると、W356およびQ359の残基は、水素結合相互作用を介してウリジン基と相互作用し、アクティブポケット内のドナーを安定化させる可能性があります。 これらの予測された重要な残基の機能を検証するために、合計16の部位が選択され、アラニンスキャニング突然変異誘発を受けました。 これらの変異体の触媒活性は、上記の6つの陽性基質すべてを使用してテストされました。 HPLC分析では、G18、H19、S295、F296、W356、C357、Q359、H374、G376、W377、N378、S379、E382、Y397、およびD398の残基がアラニンに変異した場合、タンパク質のグリコシル化活性はテストされたすべての基板に対して完全に失われました。 これらの結果は、上記の16残基がUDPGドナーの結合とのグリコシル化活性を決定する重要な残基であることを示唆しました。CtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44％）V14、V132、E153、T212、I209など（図S8）。 芳香環を取り巻くこれらの疎水性残基は、結合ポケット内の基質とファンデルワールス相互作用を形成する可能性があると予測されています。

4。議論

グリコシル化は、多くの二次代謝産物の生合成経路における最も重要な修飾ステップの1つです。 グリコシル化は、水溶性を改善し、毒性を低減することにより、天然物のバイオアベイラビリティを高める可能性があります。 クマリンは、ベンゼン環と融合したピロン環から構築された、天然に存在するフェノール性物質の巨大なクラスの中で最も単純な形態と考えられています。 天然および合成のクマリンベースの化合物は、その多様な薬理学的および生物学的特性の結果として、医薬品化学者およびドラッグデザイン科学者から多くの注目を集めています[36]。 クマリンのさらなるグリコシル化修飾は、これらの化合物の構造的多様性を豊かにし、それらの溶解性と生物学的利用能を改善するのに役立つ可能性があります。 植物では、そのようなグリコシル化プロセスは、UDP-グリコシルトランスフェラーゼによって触媒されます。 複数のUGTが異なる植物から同定されていますが、これまでに報告されたUGTのほとんどはフラボノイドのグリコシル化修飾に関与していました。 限られたUGTのみがクマリンを基質として受け入れることができると報告されました。 この研究では、新しいグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子CtUGT1伝統的な中国のハーブからクローンされましたカンカニクジュヨウ。 配列アラインメントと系統発生分析の結果は、CtUGT1報告されているフラボノイドUGTのほとんどから系統発生的に離れており、フェニルプロパノイドUGTに非常に近い。 広範な酵素アッセイにより、CtUGT1はフェニルエタノール化合物のグリコシル化を触媒して、の主要な化学成分であるPhGを形成できないことが明らかになりました。カンカニクジュヨウ。 代わりに、クマリンを基質として認識し、グリコシル化反応を行うことができます。 生成物の構造解明は、グリコシル化部位がによって触媒されることを示したCtUGT1クマリンのC7-OH位置で位置特異的に発生しました。 CtUGT1を使用して、スキミング（1a）、シコリイン（2a）、および4-メチルウンベリフェリルグルコシド（3a）を含む3つのクマリン配糖体が正常に酵素合成され、構造的に同定されました。 これら3つの化合物はすべて、薬学的に活性な分子として報告されました。 たとえば、1aは、腎保護作用、抗炎症作用、抗癌作用、抗アメーバ作用など、さまざまな薬理作用を持っていると考えられています[37]。 2aは、セレウス菌や黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に対して高い抗菌活性を示しました[38]。 3aは、植物が化学物質や毒素に対する反応能力を向上させるのに役立ちます[39]。

クマリンに加えて、広範な酵素アッセイにより、CtUGT1また、ベンゾフェノン基質4、イソフラボン基質5、およびアントラキノン基質6に対して観察可能なグルコシル化活性を示しました。これは、CtUGT1が特定の基質耐性を持っていることを示しています。 それにもかかわらず、CtUGT1配糖体成分の生合成を触媒できなかったカンカニクジュヨウフェニルエタノイド配糖体（PhG）、リグナノイド配糖体、イリドイド配糖体など。 その上、以前の調査によれば、クマリン配糖体はから分離されませんでしたカンカニクジュヨウ。 だから、の生体内機能CtUGT1まださらに調査する必要があります。 クマリン基質に対するCtUGT1のグルコシル化活性により、この酵素はクマリンの酵素的グリコシル化修飾に有用なツールとなり、植物の二次代謝酵素が本来の機能をはるかに超える計り知れない触媒作用を発揮する可能性があることも示されました。

競合する利益の宣言

著者は、利益相反がないことを宣言します。

了承

この作品は、北京自然科学財団（助成金番号7192112）によって財政的に支援されました。 CASTによる若手エリート科学者スポンサーシッププログラム（助成金番号CACM- 2018- QNRC1-02）; 中国国家自然科学基金（助成金番号81402809）; 中国奨学金評議会国家奨学基金（助成金番号201906555010）および北京中医薬大学のエリート若手奨学生のための科学財団（助成金番号2018- JYB-XJQ006）。

付録A.補足データ

この記事の補足データは、https：//doiでオンラインで見つけることができます。 org / 10.1016/j.fitote.2021.104995。

From：'新しいクマリングリコシルトランスフェラーゼの分子クローニングと生化学的特性CtUGT1からカンカニクジュヨウ' にXiping Xu、et al

---Fitoterapia 153（2021）104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

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