MTHFD2は、エフェクターおよび制御性T細胞の運命と機能を制御する代謝チェックポイントです

グラフィカルな抽象

著者：

杉浦綾香、ガブリエラ・アンドレジェバ、ケルシー・ヴォス、...、アシュトーシュ・K・マンガラム、ジョシュア・D・ラビノウィッツ、ジェフリー・C・ラトメル

対応：

jeff.rathmell@vumc.org

簡単に言えば：

ヌクレオチド合成は、急速なT細胞増殖をサポートするために必要です。 杉浦ほか de novoプリン代謝シグナルがT細胞の分化と機能を誘導し、MTHFD2を炎症性疾患の代謝チェックポイントおよび治療標的として特定することを示しています。

ハイライト

• MTHFD2は、活性化CD4T細胞がdenovoプリン合成を維持するために重要です

• 不十分なMTHFD2は、Th17細胞のTreg細胞様の表現型と代謝を促進しますd MTHFD2の阻害は、mTORC1シグナル伝達を抑制し、ヒストンのメチル化を変化させます

• MTHFD2は、invivoでの炎症と自己免疫から保護するために標的にすることができます

MTHFD2は、エフェクターおよび制御性T細胞の運命と機能を制御する代謝チェックポイントです。

杉浦綾香、¹Gabriela Andrejeva、¹ケルシー・ヴォス、¹ダレン・R・ハインツマン、¹Xincheng Xu、⁵マシュー・Z・マッデン、¹Xiang Ye、¹キャサリン・L・バイエル、¹Nowrin U. Chowdhury、²メリッサ・M・ウルフ、²アリッサ・C・ヤング、¹ダルトンL.グリーンウッド、¹Allison E. Sewell、¹Shailesh K. Shahi、³サマンサ・N・フリードマン、³アランナ・M・キャメロン、⁴Patrik Foerch、⁴ティムボーン、⁴フアンC.ガルシア-カナベラス、⁵ジョン・カリホリッチ、¹ドーンC.ニューコム、²アシュトーシュ・K・マンガラム、³ジョシュア・D・ラビノウィッツ、⁵とジェフリーC.ラトメル^1,6,*

¹Vanderbilt Center for Immunobiology、Department of Pathology、Microbiology、and Immunology、Vanderbilt University Medical Center、Nashville、TN 37232、USA

²医学部、血液腫瘍学部門、ヴァンダービルト大学医療センター、ナッシュビル、テネシー州37232、米国

³アイオワ大学病理学部、アイオワシティ、IA 52242、米国

⁴Sitryx Therapeutics Limited、マグダレンセンター、オックスフォードサイエンスパーク、オックスフォード、英国

⁵Ludwig Cancer Research Institute Princeton Branch、Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics、Princeton University、Princeton、NJ 08544、USA6リードコンタクト

*対応：jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

まとめ

抗原刺激は、T細胞代謝の再プログラミングを促進して、生合成、生体エネルギー、およびシグナル伝達の要求の増加に対応します。 1炭素（1C）代謝酵素メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ2（MTHFD2）が、活性化T細胞におけるdenovoプリン合成とシグナル伝達を調節して、増殖と炎症性サイトカインの産生を促進することを示します。 病原性Tヘルパー-17（Th17）細胞では、MTHFD2は、抑制能力の不適切な獲得とともに、転写因子FoxP3の異常なアップレギュレーションを防ぎました。 MTHFD2欠損症は、制御性T（Treg）細胞の分化も促進しました。 機械論的に、MTHFD2阻害は、プリンプールの枯渇、プリン生合成中間体の蓄積、および栄養センサーmTORC1シグナル伝達の低下をもたらしました。 MTHFD2は、Th17細胞のDNAとヒストンのメチル化を調節するためにも重要でした。 重要なことに、MTHFD2の欠損は、複数のinvivo炎症性疾患モデルにおける疾患の重症度を軽減しました。 したがって、MTHFD2は、プリン代謝を病原性エフェクター細胞シグナル伝達と統合するための代謝チェックポイントであり、1C代謝経路内の潜在的な治療標的です。

前書き

適応免疫応答の効果的な動員には、急速な細胞増殖と増殖を受けるために、CD4とT細胞の強力な活性化が必要です。 これには、栄養素センサーmTORC1によって駆動される代謝の再プログラミングが含まれ、異化作用の休止状態から、生合成、生体エネルギー、およびシグナル伝達の要求が増加した同化作用の成長状態になります。 サイトカイン環境に応じて、CD4とT細胞は、エフェクターと、エフェクター機能を駆動する別個の代謝プログラムを持つ調節サブセットに分化します（Bantug et al。、2018; Buck et al。、2015）。 これらのサブセットのバランスは、炎症性疾患や自己免疫疾患を予防しながら、正常な免疫にとって重要です。 たとえば、多発性硬化症（MS）は、インターロイキン-17（IL - 17）産生Tヘルパー-17（Th17）細胞の増加と、抑制性制御性T（Treg）細胞の減少または無効を特徴としています。 （Dendrou et al。、2015）。 これらのT細胞サブセットの特定の代謝プログラムを標的とすることは、免疫療法への代替アプローチを提供します。

細胞代謝に基づく治療は、抗葉酸化学療法剤が急性リンパ芽球性白血病の子供に有効であることが示された1948年に始まりました（Farber et al。、1948）。 葉酸は、プリン生合成、メチル供与体の生成、および細胞の酸化還元バランスの維持のための1炭素（1C）代謝に寄与します（Ducker and Rabinowitz、2017; Yang and Vousden、2016）。 その後、メトトレキサート（MTX）、フルオロウラシル（5- FU）、メルカプトプリン（6- MP）などの多くの薬剤が、この経路を標的とするように開発されてきました。 癌細胞や活性化T細胞などの急速に増殖する細胞は、これらの経路への依存関係を共有してDNAとRNAを合成します。 MTXは、関節リウマチ（RA）などの自己免疫疾患の治療に一般的に使用されています（Brown et al。、2016）。 しかし、標的酵素の幅広い発現のために、これらの治療薬は一般的で潜在的に重篤な副作用と関連しています。 目的の細胞集団で選択的に重要な代謝酵素標的を特定することは、より安全でより効果的な免疫療法の開発につながる可能性があります。

1C代謝には、単一炭素単位の移動を伴う葉酸およびメチオニンサイクルが含まれます。 セリンは1Cドナーとして機能し、テトラヒドロ葉酸（THF）を5、10-メチレンTHFに活性化し、同時にグリシンを生成します。 5、10-メチレンTHFは、NAD（P）を使用して酸化し、プリン前駆体10-formylTHFを生成します。 あるいは、10- formylTHFは、ATP依存的にギ酸塩とTHFから合成することができます。 細胞質ゾル経路では、10- fomylTHFの産生はメチレンTHFデヒドロゲナーゼ1（MTHFD1）によって媒介されます。 MTHFD1の喪失は、細胞質ゾル10- formylTHFの細胞を飢餓状態にし、プリン生合成能力を除去し、MTHFD1の変異は、重症複合免疫不全症（SCID）を引き起こします（Field et al。、2015）。 ミトコンドリア経路は、ミトコンドリアMTHFD2およびMTHFD 1- like（MTHFD1L）に依存しています。

図1.1C代謝とMTHFD2は活性化CD4でアップレギュレーションされます^プラスT細胞とEAEの文脈で

（A）インビトロで分化したCD4におけるヌクレオチド代謝種の変化^プラス質量分析によって測定されたナイーブ細胞と比較したT細胞サブセット（n=3生物学的複製）。

（B）invivo肺炎症モデルにおける標的CRISPRスクリーニングのワークフロー。

（C）一次CD4における1C代謝を標的としたinvivoCRISPRスクリーニングからのgRNA存在量の変化^プラスT細胞（MAGeCKによって実行された統計分析、n=3生物学的複製）。

（D）T細胞の発達および活性化中に（C）で同定された遺伝子のmRNA発現（ImmGen RNA-seqデータブラウザーからのデータ）。

（E）ナイーブおよび活性化CD4における（C）で同定された遺伝子のタンパク質発現^プラスT細胞（Immunological Proteome Resource [ImmPRes]からのデータ）。

（F）健康な対照個体と比較して示された炎症性疾患を有する個体の全血における（C）で同定された遺伝子のmRNA発現（Aune et al。、2017）。 RA-MTX、MTX治療中のRA; SLE、全身性エリテマトーデス; 診断時のMS-Txナイーブ、治療ナイーブMS; MS確立、治療中および疾患寛解中のMS; n=3 –8人のドナー。

（G）2003年（上;スケールバー、100mm）および4003（下;スケールバー、50mm）倍率で症候性EAEを有するマウスの脊髄の馬尾セグメントにおけるCD3およびMTHFD2染色を示すIHC（データは代表的である） 2つの独立した実験の）。

（HおよびI）相対（H）平均蛍光強度（MFI）および（I）CD4におけるMTHFD2のmRNA発現^プラス症候性EAEを有するマウスの脾臓および脊髄および対照マウスの脾臓からのT細胞（平均±SD、一元配置分散分析、データは、6つの合計生物学的複製を用いた2つの独立した実験の代表である）。

（J）未分化CD4におけるMTHFD2mRNA発現^プラス抗CD3および抗CD28抗体による活性化の0、5、および24時間後のT細胞（平均±SD、一元配置分散分析、n=3生物学的複製）。

（K）CD4プラスT細胞サブセットでの活性化後5日間の相対MTHFD2 MFI、休止細胞に正規化（平均±SD、n=3生物学的複製）。 図S1も参照してください。 統計的に有意な結果にはラベルが付けられます（* p<0。05、**><0。01、*** p=""><0.001、****>

MTHFD2は、すべての腫瘍で最も高度に誘導および過剰発現される遺伝子の1つです（Nilsson et al。、2014）。 MTHFD2は、胚発生中に広くアップレギュレートされますが、ほとんどの成体組織ではほとんどまたはまったく発現していません（Nilsson et al。、2014）。 抗がん療法（Zhu and Leung、2020）では、MTHFD2阻害は酸化ストレスの増加（Ju et al。、2019; Wan et al。、2020）、グリシン依存性（Koufaris et al。、2016）、および不十分につながる可能性がありますプリン合成（Ben-Sahra et al。、2016; Pikman et al。、2016）。 MTHFD2欠損症は、グアニンの枯渇やそれに続くmTORC1-活性化GTPaseRhebの阻害など、複数のメカニズムを通じてmTORC1活性を抑制することもあります（Emmanuel et al。、2017）。 MTHFD2の欠損は、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）を活性化できるアデノシン一リン酸（AMP）類似体5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボヌクレオチド（AICAR）（Ducker et al。、2016）を含むプリン合成経路中間体の蓄積も引き起こします。 mTORC1を阻害する（Su et al。、2019）。

1C代謝は複数の栄養素入力を統合し、治療的に扱いやすいため、CD4における1C代謝の役割を調べました。^プラスTエフェクター（Teff）およびTreg細胞サブセット。 初代マウスT細胞における偏りのないinvivoCRISPR-Cas9-ベースの標的スクリーニングを通じて、炎症性疾患のある個人でも一貫してアップレギュレーションされたヒットとしてMTHFD2を特定しました。 特に、MTHFD2の欠損はTeff細胞の増殖と機能を損ないました。 MTHFD2欠損は、Treg細胞の分化を促進しながら、Th17細胞における異常なFoxP3発現と抑制活性も促進しました。 これらの影響は、AICARの蓄積、プリン濃度の低下、mTORC1シグナル伝達のダウンレギュレーション、ミトコンドリア代謝の増加、およびDNAとヒストンのメチル化の変化に関連していました。 インビボでは、MTHFD2を標的とすることで複数の炎症性疾患モデルから保護されました。 これらのデータは、MTHFD2がTh17細胞とTreg細胞の代謝チェックポイントとして機能することを示しており、抗炎症免疫療法の標的としてのこの酵素の可能性を浮き彫りにしています。

結果

1C代謝とプリン合成はCD4で異なって活性です^プラスT細胞サブセット

ヌクレオチド合成はCD4全体で異なる可能性があるという仮説を立てました^プラスT細胞サブセット。 CD4^プラスT細胞はinvitroでTh1、Th17、およびTreg細胞に分化し、質量分析のために72時間後に収集されました。 ヌクレオチド種の量は、ナイーブ細胞と比較してすべてのサブセットで一般的に上昇しました（図1A）。 特に、プリン合成中間体は、Th17細胞でグリシンアミドリボヌクレオチド（GAR）、1-（ホスホリボシル）イミダゾールカルボキサミド（SAICAR）、およびAICARの蓄積が最も高く、差次的に豊富でした（図S1A）。

CD4の依存性をテストするには^プラス1C代謝における酵素上のT細胞、一次CD4でin vivoCRISPR-Cas9-ベースのスクリーニングを実施しました^プラスT細胞（図1B）。 カスタムガイドRNA（gRNA）ライブラリは、陽性対照および非標的陰性対照（NTC）として結節性硬化症複合体2（TSC2）とともに、1C代謝の酵素を標的とするように構築されました。 CD4^プラスオボアルブミン（OVA）特異的T細胞受容体（TCR）トランスジェニックOT-II Cas9ダブルトランスジェニックマウスから単離されたT細胞にこのライブラリーを形質導入し、Rag1に静脈内移植しました。^{__ /__}ホスト。 次に、マウスを鼻腔内OVAで免疫して肺の炎症を誘発した。 これらのマウスの肺から回収されたT細胞の配列が決定され、入力頻度と比較してgRNAの濃縮または枯渇が確立されました。 TSC2 gRNAは濃縮されており、T細胞におけるこのタンパク質の阻害的役割をサポートしています。 対照的に、PPAT、AHCY、MAT2A、およびMTHFD1 gRNAは大幅に枯渇し、GART、DHFR、DNMT1、MTRR、MTR、SHMT2、およびMTHFD2 gRNAはそれほど減少しておらず、これらの遺伝子がT細胞増殖および炎症機能に寄与することを示しています。インビボ（図1CおよびS1B）。

次に、画面から特定された遺伝子の発現プロファイルを調べました。 すべてが発達中の胸腺細胞で協調的にアップレギュレーションされましたが、MTHFD2 mRNAおよびタンパク質は刺激された末梢T細胞で最も強く誘導されました（図1Dおよび1E）。 さらに、さまざまな炎症性疾患および自己免疫疾患を患う個人の全血からの別個に公開されたRNAシーケンス（RNA-seq）データセット（Aune et al。、2017）では、MTHFD2は、潰瘍性大腸炎、クローン病を含む複数の状態にわたって一貫して過剰発現していました。 、腹腔疾患、RA、全身性エリテマトーデス（SLE）、乾癬、乾癬性関節炎、Sjo¨gren症候群、およびMS（図1F）。 特に、最近MSと診断された個人は、健康なドナーまたは疾患寛解を伴う治療を受けているMSの個人と比較して、MTHFD2の発現が有意に上昇していました（図S1C）。 したがって、CD4^プラスT細胞の増殖と生存は特定の1C代謝遺伝子に依存しており、これらの遺伝子の発現は、T細胞の発達、活性化、分化の段階、および病理学的炎症の状況によって異なります。

図2.MTHFD2の欠損はCD4を損なう^プラスT細胞の増殖と機能

（A–D）（A）CellTrace Violet（CTV）希釈、（B）生存率、（C）CD25発現、および（D）CD4でのTF発現によって測定された増殖^プラス活性化後72時間MTHFD2iで処理されたT細胞サブセット（平均±SD、一元配置分散分析、データは9つの合計生物学的複製による3つの独立した実験の代表です）。

MTHFD2はCNS浸潤CD4で高度にアップレギュレーションされています^プラス実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）および活性化CD4のT細胞^プラスinvitroでのT細胞

MTHFD2の調節は、CD4とT細胞では十分に説明されていません。 インビボでの炎症性病変におけるMTHFD2の発現を測定するために、CD4^プラスミエリン特異的TCRトランスジェニック2D2マウスのT細胞が活性化され、Rag1に養子移入されました^{__ /__}EAEを誘発するマウス。 マウスが後肢麻痺を示し始めた後、脊髄の馬尾セグメントを免疫組織化学（IHC）によって分析した。 2D2 T細胞を投与されたマウスは、MTHFD2およびCD3の濃縮を示しました。^プラスコントロールには存在しなかった細胞（図1G）。 CD4かどうかを直接判断するには^プラスT細胞は炎症を起こした病変でMTHFD2をアップレギュレートし、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）および百日咳毒素（PTX）によって誘発されたEAEのモデルにさらされたマウスの脾臓および脊髄からのT細胞を分析のために収集しました。 CNS浸潤CD4^プラス一致した脾臓CD4と比較してT細胞はMTHFD2を過剰発現しました^プラスフローサイトメトリー（図1H）およびqRT-PCR（図1I）で測定した、コントロールおよびEAEマウスのT細胞。 CD4におけるMTHFD2発現の動態^プラス次に、invitroでのT細胞を測定した。 MTHFD2 mRNAの強力なアップレギュレーションは、刺激の5時間後に検出され、24時間までに減少し始めました（図1J）が、分化したCD4^プラスT細胞サブセットは、活性化の48時間後にMTHFD2タンパク質の最高の発現を達成しました（図1K）。 これらのデータは、MTHFD2がCD4でアップレギュレーションされていることを示しています^プラスinvitroおよびinvivoで炎症部位に活性化されたT細胞。

CD4^プラスT細胞サブセットは、活性化、増殖、生存、およびサイトカイン産生のためにMTHFD2を特異的に必要とします

次に、CD4とT細胞サブセットの活性化、分化、増殖、および機能におけるMTHFD2の役割をテストしました。 CD4^プラスT細胞は、最適なTh1、Th17、およびTreg細胞の分化とビヒクルまたはMTHFD2阻害剤（MTHFD2i; DS18561882）のためにサイトカインの存在下でin vitroで活性化されました（Kawai et al。、2019）。 72時間後、すべてのサブセットで増殖が減少し（図2A）、生きているサイクリング細胞の数が減少しました（図S2AおよびS2B）。 Th1細胞とTh17細胞では生存率が低下し（図2B）、CD25発現で測定した活性化はすべてのサブセットで低下しました（図2C）。 系統を特徴付ける転写因子（TF）の発現はTh1細胞で減少しました（T-bet^プラス）がTh17細胞では変化しない（ROR t^プラス）そしてTreg細胞（FoxP3^プラス）（図1D）。 Teff細胞機能を測定するために、細胞を12-ミリステート13-アセテート（PMA）とイオノマイシンで再刺激しました。 MTHFD2iの存在下で分化した場合、有意に少ないTh1細胞がインターフェロン-g（IFNg）を発現し、Th17細胞がIL -17を発現しました（図2E）。 これは、初期活性化の障害によるものではありませんでした。これは、薬物曝露が活性化後24時間まで遅延した場合にこれらの表現型が維持されたためですが、この設定では系統年齢を特徴付けるTF発現は変化しませんでした（図S2C–S2F）。 したがって、最大のCD4にはMTHFD2が必要です。^プラスT細胞の活性化、増殖、生存、およびサイトカイン産生。

これらの薬理学的効果を遺伝的に検証するために、Mthfd2を生成しました^{fl / fl}マウス系統とそれをCd4-creトランスジェニックマウスと交配させて、条件付き遺伝子欠失を達成しました。 予想通り、CD4を活性化^プラスMthfd2からのT細胞^{fl / fl}Cd 4- cre plus（CD4^ΔMthfd2）マウスは、Mthfd2の細胞と比較してMTHFD2の発現が低かった。^{fl / fl}Cd 4- cre^プラス（野生型[WT]）同腹子（図2F）。 ベースラインでは、CD4DMthfd2マウスのCD4はわずかに少なかった^プラスWTと比較した脾臓のT細胞（図2G）。 CD4のinvitroでの活性化と分化、細胞数と生存率^ΔMthfd2Th17細胞と、程度は低いもののTreg細胞は、有意に低かった（図2H）。 さらに、CD25の発現はTh17細胞とTreg細胞で減少し、Th1細胞では低下する傾向がありました（図2I）。 最後に、CD4^ΔMthfd2Th1細胞とTh17細胞は、それぞれT-betとRORtの発現が低かった。 ただし、Treg細胞のFoxP3は変化していません（図2J）。 TF発現の変化にもかかわらず、分化したTeff細胞は正常な量のサイトカインを産生しました（図2K）。 薬理学的アプローチと遺伝的アプローチの結果の違いは、発生中の酵素機能喪失のタイミングと完全性、および潜在的な代償メカニズムに起因する可能性があります。

MTHFD2iはTh17細胞でFoxP3の発現を誘導し、Treg細胞の分化を促進します

Teff細胞がMTHFD2に依存していることを考慮して、FoxP3およびTreg細胞のMTHFD2i調節をテストしました。 特に、MTHFD2i治療は、Th1およびTh17細胞で用量依存的にFoxP3の異常なアップレギュレーションを誘発しました（図3A）。 これは、活性化後24時間まで治療を遅らせた場合にも発生しました（図3B）。 同様の傾向がCD4DMthfd2Th17細胞でも観察されました（図3C）。 このFoxP3のアップレギュレーションは、MTHFD2iで処理したTh17細胞がCD8と共培養すると抑制能力を獲得したため、機能的でした。^プラスT細胞（図3D）。 したがって、MTHFD2iは、Th17細胞でFoxP3およびTreg細胞のような表現型を促進することができます。 MTHFD2iは、誘導されたTreg細胞の分化も促進しました。 Treg細胞は、MTHFD2iの存在下で、さまざまなトランスフォーミング増殖因子b（TGF-b）濃度で分化しました。 最高濃度を除いてテストしたすべての濃度で、FoxP3の発現はMTHFD2i処理で増加しました（図3Eおよび3F）。 この表現型は、遅延MTHFD2i治療でも維持されました（図3G）。

図3.MTHFD2の欠損は、FoxP3の発現を誘導し、酸化的リン酸化への移行を促進します

（A）活性化72時間後のMTHFD2i処理Th1およびTh17細胞におけるFoxP3発現（平均±SD、一元配置分散分析、データは、合計9回の生物学的複製による3回の独立した実験の代表です）。

（B）Th1およびTh17細胞でのFoxP3発現は、24時間活性化され、その後、ビヒクルまたは500 nM MTHFD2iで48時間処理されました（平均±SD、対応のないt検定、データは、合計9回の生物学的複製による3つの独立した実験を表しています）。

（C）WTおよびCD4DMthfd2同腹子からのTh1およびTh17細胞におけるFoxP3発現は、活性化の72時間後です（平均±SD、対応のないt検定、データは9つの合計生物学的複製による3つの独立した実験の代表です）。

（D）MTHFD2iで処理したTh17細胞の異常な抑制能力を測定する抑制アッセイ。 前処理したTh17細胞をCTV染色したCD8プラスT細胞と共培養して、抗CD3および抗CD28抗体で活性化したときの増殖を測定しました（平均±SD、一元配置分散分析、n=3生物学的複製） 。

（E）Treg細胞におけるFoxP3発現は、TGF-b濃度の範囲で分化し、MTHFD2iで処理されました（平均±SD、対応のないt検定、データは9つの合計生物学的複製による3つの独立した実験の代表です）。

（F）（E）で表にしたデータのフローサイトメトリープロット。

（G）低濃度のTGF-bで24時間活性化および分化した後、MTHFD2iで48時間処理したTreg細胞でのFoxP3発現（平均±SD、対応のないt検定、データは合計9回の生物学的複製による3つの独立した実験の代表）。

（H）MTHFD2iで処理したTh17およびTreg細胞で実施したSeahorse XF Cell Mitoストレステスト（平均±SD、n=3生物学的複製）（I）基礎ECAR、基礎OCR、最大OCR、および基礎OCR / ECAR （H）で測定された比率（平均±SD、対応のないt検定、データは6つの生物学的複製を含む2つの独立した実験を表す）統計的に有意な結果にはラベルが付けられます（* p<0。05、 ** p<0。01、*** p <0.001、**** pパーセント0.001）。

Treg細胞は、Th17細胞よりもミトコンドリアの代謝が高い（Michalek et al。、2011）。 MTHFD2i治療の代謝結果を決定するために、Th17細胞とTreg細胞を細胞外フラックス分析によって評価しました。 MTHFD2iは、Th17細胞の基礎および最大酸素消費率（OCR）を増加させ、ミトコンドリア呼吸へのシフトを示しています（図3H）。 逆に、Th17細胞とTreg細胞では、MTHFD2i処理により基底細胞外酸性化率（ECAR）が低下し、解糖系の低下が示唆されました（図3I）。 MTHFD2iが代謝プログラムを解糖から酸化的リン酸化にシフトしたため、ECARに対するOCRの基礎比はTh17細胞とTreg細胞で有意に増加しました。 これらのデータは、MTHFD2iがTh17細胞および低TGF-b条件下で分化したTreg細胞におけるFoxP3発現を増強し、Th17細胞をよりTreg細胞様の代謝にシフトさせることを示しています。

ヒトCD4プラスT細胞におけるMTHFD2欠損は、Th17細胞の増殖と生存率を低下させ、FOXP3の発現を増加させ、mTORC1活性を抑制します。

上記の所見のヒト細胞への翻訳可能性をテストするために、CD4^プラス健康なドナーの末梢血から分離されたT細胞は、in vitroでTh1、Th17、およびTreg細胞に分化し、活性化の時点からビヒクルまたはMTHFD2iで処理されました。 MTHFD2iで処理したTh17およびTreg細胞では増殖が大幅に減少し（図4A）、Th17細胞でもアポトーシスの増加が見られました（図4B）。 Th17細胞の増殖の低下は、低分子干渉RNA（siRNA）を使用した遺伝的アプローチで再現されました（図4CおよびS2G）。 マウス細胞と同様に、FOXP3の発現はMTHFD2iで処理したヒトTh17細胞で高く、MTHFD2iで処理したヒトTreg細胞で高くなる傾向がありました（図4DおよびS2H）。 mTORC 1- AMPK軸がTh17およびTreg細胞の分化に重要であることを考えると、mTORC1ターゲットリボソームタンパク質S6（ホスホ-S6）のリン酸化も測定されました。 これは、MTHFD2iまたはsiMTHFD2を含むTh17細胞でmTORC1活性の低下を示しました（図4E）。 したがって、Th17およびTreg細胞における増殖能の喪失およびFOXP3発現の誘導は、初代ヒトCD4で再現することができます。^プラスT細胞。

図4.MTHFD2欠損症は、増殖を阻害し、ヒトTh17細胞でFOXP3発現を誘導します

（A）抗CD3および抗CD28抗体で活性化した後72時間ビヒクルまたは2 mM MTHFD2iで処理したヒトCD4プラスT細胞サブセットのCTV希釈によって測定された増殖（対応のあるt検定、データは5での3つの独立した実験の代表–6人の健康なドナー）。

（B）MTHFD2iで72時間処理したヒトCD4プラスT細胞でアネキシンVによって測定されたアポトーシス（対応のあるt検定、データは5〜6人の健康なドナーを用いた3つの独立した実験の代表です）。

（C）NTCまたはsiMTHFD2で形質導入されたヒトCD4プラスT細胞におけるKi -67発現（対応のあるt検定、データは4人の健康な患者ドナーによる3つの独立した実験の代表です）。

（D）MTHFD2iで72時間処理したヒトCD4プラスT細胞におけるFOXP3発現（対応のあるt検定、データは6〜10人の健康なドナーを用いた3つの独立した実験の代表です）。

（E）MTHFD2iで72時間処理した、またはsiMTHFD2で形質導入したヒトCD4とT細胞のリン酸化S6発現の変化（平均±SD、1サンプルt検定、4〜6人の健康なドナーによる3回の独立した実験を表すデータ）。 統計的に有意な結果にはラベルが付けられます（*p<0。{{10}}5、** p=""><0。01、*** p=""><0.001、****>

T細胞はMTHFD2酵素機能に依存しており、表現型は製品によって救済することができます

MTHFD2は、プリン合成のためのミトコンドリアギ酸塩プールの維持に必要ですが（Ma et al。、2017）、非酵素的役割も果たしている可能性があります。 必須の酵素活性をサポートするMTHFD2i処理により、CD4とT細胞サブセットの培地からギ酸塩が代償的に取り込まれました（図5A）。 ギ酸塩合成に使用される1Cユニットは、セリンからグリシンへの変換によって提供され、細胞内セリンが蓄積しますが、グリシンはすべてのサブセットでMTHFD2i処理によって枯渇しました（図5B）。 メチオニン濃度もわずかに増加し、メチオニンサイクルの阻害を示唆しています。 予想通り、セリン-グリシン変換ステップがMTHFD2の上流にあることを考えると、これらの変化は、培地にギ酸塩を供給することによって救済されませんでした。

図5.T細胞サブセットに対するMTHFD2iの影響は、外因性ギ酸塩によって救済されます

（A）活性化後72時間ビヒクルまたは500 nM MTHFD2iで処理されたCD4プラスT細胞サブセットで1H磁気共鳴分光法（MRS）によって測定されたフォーマット取り込み（平均±SD、対応のないt検定、データは2つの独立した実験の代表合計6つの生物学的複製）。

（B）質量分析（平均±SD、n {平均±SD、n { {8}}生物学的複製）。

（C）活性化後72時間、1mMホルメートまたは60mMアデニンおよびグアニンプリン溶液でレスキューされたMTHFD2i処理CD4プラスT細胞における生細胞数、生存率、およびCD25発現（平均±SD、一元配置分散分析、データは合計9つの生物学的複製による3つの独立した実験の代表）。

（D）WTまたはCD4DMthfd2同腹仔からのCD4プラスT細胞における生細胞数、生存率、およびCD25発現は、活性化後72時間ギ酸塩またはプリンで救出されました（平均±SD、一元配置分散分析、n= 3生物学的複製）。

次に、ギ酸塩またはアデニンとグアニンのプリン溶液の添加が、不十分な酵素機能を救出し、MTHFD2欠乏の下流効果を逆転させることができるかどうかをテストしました。 実際、1 mMギ酸塩は、MTHFD2iで処理した細胞の増殖、生存率、および活性化を回復させました（図5C）。 プリン補給は、すべてのサブセットでの増殖とTh1およびTh17細胞での活性化を救済しましたが、すべてのサブセットでの生存率とTreg細胞での活性化は救済しませんでした。 ギ酸塩はまた、CD4の増殖、生存率、および活性化を救済しました^ΔMthfd2T細胞（図5D）。 MTHFD2iで処理されたTh1およびTh17細胞におけるサイトカイン産生の障害は、ギ酸塩またはプリンの添加によりビヒクル量に逆転しました（図5E）。 特に、Th17細胞におけるFoxP3の異常なアップレギュレーションは、プリンの添加によって救済されましたが、ホルメートでは救済されませんでしたが、ホルメートとプリンの添加により、低濃度のTGF-bで分化したTreg細胞ではFoxP3の発現がベースラインまで減少しました（図5F）。 MTHFD2iの表現型は、ミトコンドリアのギ酸塩またはプリンプールのMTHFD2の維持に依存しているようです。

MTHFD2は、CD4のmTORC1活性とDNAおよびヒストンのメチル化を調節します^プラスT細胞

不死化した癌細胞では、MTHFD2の欠損により、10-ホルミルTHFを介したホルミル化ステップの上流にあるプリン合成中間体GAR、SAICAR、およびAICARが蓄積する可能性があります（Ducker et al。、2016）。 CD4^プラスT細胞サブセットを72時間培養した後、MTHFD2iに4〜6時間曝露しました。 この短い時間枠は、代償的な変更を含む二次的影響を回避するために選択されました。 一過性のMTHFD2i治療により、すべてのサブセットでGAR、SAICAR、およびAICARが蓄積しました（図6A）。 この効果は、MTHFD2の酵素的役割をサポートする、1mMギ酸塩の添加によって完全に救済されました。 グアニンを含むヌクレオチドおよび核酸塩基もまた、MTHFD2iによって枯渇し、Th17およびTreg細胞においてギ酸塩によって救出されました（図6B）。

図6.MTHFD2iは、プリン合成中間体の蓄積をもたらし、mTORC1活性を弱め、DNAとヒストンのメチル化を変化させます

（A）質量分析（平均±SD、1〜一元配置分散分析、n=3生物学的複製）。

（B）質量分析（n=3生物学的複製）で測定した、ギ酸塩を含むまたは含まないMTHFD2iでビヒクルと比較して4〜6時間処理したTh17およびTreg細胞のヌクレオチド代謝種の変化。

（C）活性化後72時間、ギ酸塩の有無にかかわらずMTHFD2iで処理されたCD4プラスT細胞におけるホスホ-S6、S6、Rheb、ホスホ-ACC、ACC、HIF -1 a、およびb-アクチンのイムノブロット（データn個の= 3生物学的複製を用いた3つの独立した実験の代表）。

（D）質量分析（平均±SD、一元配置分散分析、n=3生物学的複製）によって測定された、ビヒクルと比較して6時間ホルメートの有無にかかわらずMTHFD2iで処理されたTh17細胞のTCA回路代謝物の変化。

（E）CUT＆RUN（3つの生物学的複製からプールされたデータ）によって測定された、MTHFD2iで処理されたTh17およびTreg細胞のUCSC既知遺伝子のプロモーター周辺の±10-kb領域におけるH3K27me3対IgG制御比のヒートマップ。

（F）ビヒクルまたは500 nM MTHFD2iで処理されたTh1およびTh17細胞、およびWTまたはCD4DMthfd2同腹仔からのnTreg細胞におけるCpG部位によるFoxp3遺伝子座のDNAメチル化頻度の中央値のヒートマップ（ムードテスト、n=3生物学的複製）。

（G）近位プロモーター、遠位プロモーター、およびTSDR（対応のあるt検定）による（F）の表。 図S3およびS4も参照してください。 統計的に有意な結果にはラベルが付けられます（* p<0。05、**><0。01、*** p=""><0.001、****>

AICARとヌクレオチドは、mTORC 1- AMPK軸の確立された調節因子です（Emmanuel et al。、2017; Kim et al。、2016）。 実際、ホスホ-S6の発現は、すべてのサブセットでMTHFD2i処理により減少し、ギ酸塩の添加により完全に回復しました（図6CおよびS3A）。 mTORC1の必須の活性化因子であるGTP結合タンパク質Rhebは、細胞内グアニンの利用可能性に敏感である可能性があり（Emmanuel et al。、2017）、Rhebの発現はMTHFD2i処理によって抑制されました（図6CおよびS3B）。 AICARは、アデノシン類似体およびAMPK活性化因子です（Rae and Mairs、2019; Su et al。、2019）。 ただし、活性化の72時間後、AMPKまたはそのターゲット、アセチル補酵素A（CoA）カルボキシラーゼ（ホスホ-ACC）およびUnc -51-のようなオートファジー活性化キナーゼ（ホスホ-ULK1）のリン酸化は、MTHFD2i処理で変化しませんでした（図6C、S3C、およびS3D）。 mTORC1活性は、Th17を促進し、HIF -1 a依存性解糖代謝の誘導を部分的に介してTreg細胞の分化を抑制します（Shi et al。、2011）。 これと一致して、HIF -1 aの発現は、MTHFD2i処理およびCD4DMthfd2 Th17細胞で減少しました（図6C、S3E、およびS3F）。 mTORC1活性のこれらの変化は、再刺激の有無にかかわらずNur77発現によって測定されるように、TCRシグナル伝達の欠損とは関連していませんでした（図S3G）。 Th17細胞の発達に重要なシグナル伝達兼転写活性化因子3（STAT3）活性は、MTHFD2i処理によって変化しないか、適度に増加しました（図S3H）。 mTORC1活性の低下と、MTHFD2i処理による解糖から酸化的リン酸化へのシフトは、トリカルボン酸（TCA）回路代謝物の相対量の変化を示唆しました。 コハク酸塩とフマル酸塩の濃度は、MTHFD2iによって大幅に減少しましたが、ギ酸塩によって救済されました（図6D）。

TCA代謝物は、DNAおよびヒストンデメチラーゼの既知の阻害剤であり（Su et al。、2016）、コハク酸およびフマル酸プールの枯渇は、低メチル化状態をサポートする可能性があります。 ゲノム全体のH3K27トリメチル化（H3K27me3）は、CUT＆RUN（ターゲット下での切断とヌクレアーゼを使用した放出）シーケンシングによって測定されました（Skene and Henikoff、2017）。 実際、MTHFD2iで処理されたTh17細胞は、ビヒクルと比較してH3K27me3が減少していました（図6EおよびS4A）。 Foxp3遺伝子座でのDNAメチル化は、重硫酸塩シーケンシングによっても測定され、メチル化の差異がMTHFD2iによって誘導されるFoxP3のアップレギュレーションに寄与するかどうかを判断しました。 いくつかのCpG遺伝子座は、ビヒクル条件とMTHFD2i条件の間でメチル化頻度が異なりましたが、Treg細胞特異的脱メチル化領域（TSDR）には識別可能なパターンはありませんでした。 また、WTマウスとCD4DMthfd2マウスから分離されたnTreg細胞（CD4 + CD25 plus）の間に違いはありませんでした（図6F）が、濃縮された各集団の純度は低かった（図S4B）。 ただし、MTHFD2iで処理したTh17細胞では、ビヒクルと比較してFoxp3近位プロモーター領域でDNAメチル化頻度が大幅に減少し（図6G）、MTHFD2iによる転写の増強の可能性を示しています。

細胞内ギ酸塩プールを維持することに加えて、MTHFD2活性は、NADの変換を通じて細胞の酸化還元バランスに貢献します^プラスNADHとNADPへ^プラスNADPH（Shin et al。、2017）に加え、硫酸転移経路とそれに続くグルタチオン合成をサポートします。 MTHFD2iで処理されたTh17細胞はNADの濃度が低下していました^プラス、NADH、NADP^プラス、およびギ酸塩で救出されたNADPH（図S4C）。 ただし、NAD^プラス/NADHおよびNADP^プラス/NADPH比は条件を超えて変化しませんでした。 これは、細胞の活性酸素種（ROS）とミトコンドリアのスーパーオキシドに変化がないことと相まって（図S4D）、酸化還元状態の変化がMTHFD2i表現型の主な原因である可能性が低いことを示唆しています。

インビボでのMTHFD2欠損は、複数の炎症性疾患の重症度を軽減します

次に、治療標的としてのMTHFD2の有効性を、in vivo T細胞依存性遅延型過敏症（DTH）モデルでテストしました。 マウスを免疫し、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）で耳にチャレンジして局所炎症を誘発し、経口ビヒクルまたはMTHFD2iで治療しました。 動物が体重を維持したため、治療は明白な毒性を示さなかった（図S5A）。 重要なことに、耳の厚さと重量は対照のDTHマウスでは増加しましたが、阻害剤で治療した動物では増加しませんでした。 KLH特異的免疫グロブリンG（IgG）も阻害剤の最高用量で減少し、B細胞機能にまで及ぶ潜在的な影響を示しています（図7C）。

図7.MTHFD2をinvivoで標的化すると、DTH、EAE、およびIBDモデルの疾患の重症度が軽減されます

（AおよびB）耳（A）相対厚および（B）生検重量CFA免疫を伴うKLHの1 0日後、およびDTH（一元配置分散分析）を誘導するためのKLHチャレンジの3日後。 マウスを1日2回、0、100、または300 mg / kgのMTHFD2iを経口投与しました（平均±SEM、n=8生物学的複製）。

（C）KLH誘導DTHの10日目のKLH特異的IgG濃度（平均±SEM、クラスカル・ウォリス検定、n=8生物学的複製）。

（D）EAEを誘発するためにCFAおよびPTXを用いてMOGで免疫したWTおよびCD4DMthfd2同腹仔の経時的な平均臨床スコア（平均±SEM、複数のマンホイットニー検定、データはそれぞれ5つの生物学的複製を伴う2つの独立した実験を表す）。

（E）疾患の重症度がピークに達したEAEマウスの脊髄におけるCD4とT細胞の細胞数と頻度（平均±SEM、対応のないt検定、データは合計9回の生物学的複製による2つの独立した実験の代表です）。

（F）EAEマウスの脊髄からのCD4プラスT細胞におけるCD25およびCD44の発現（平均±SEM、対応のないt検定、n=4生物学的複製）。

（GおよびH）（G）T-bet plus、RORgt plus、FoxP3 plus、FoxP3 plus / T-bet plus ratio、FoxP3 plus / RORgt plus ratioおよび（H）IL -17 plus、IFNgの細胞数プラス、およびIL -17プラスIFNgプラスCD4プラスEAEマウスの脊髄からのT細胞（平均±SEM、対になっていないtテスト、データは9つの合計生物学的複製による2つの独立した実験の代表です）。

（I）免疫化のないWTマウスの脊髄におけるミエリンのH＆E、抗CD3 IHC、およびルクソールファストブルー（LFB）染色、およびWTおよびCD4DMthfd2は、ピーク疾患でEAEと同腹仔（2003年の倍率、5つの生物学的複製を表す） ）。

（J）Rag1の経時的な体重の変化^__/__マウスにWTまたはCD4DMthfd2ナイーブCD4プラスT細胞を腹腔内注射してIBD大腸炎を誘発しました（平均±SEM、複数のt検定、n=8生物学的複製）。

（KおよびL）IBDマウスのMLNからの（K）総CD4 + T細胞および（L）T-bet +、RORgt +、およびFoxP3 + CD4 + T細胞の細胞数（平均±SEM、対応のないt検定n { {4}}生物学的複製）。 図S5およびS6も参照してください。 統計的に有意な結果にはラベルが付けられます（* p<0。05、**><0。01、*** p=""><0.001、****>

同様に、デュアルMTHFD1 / 2阻害剤LY345899（Gustafsson et al。、2017）は、EAEモデルの疾患の改善に有効でした。 EAEはMOGおよびPTXで誘発され、マウスはDMSOまたはLY345899の腹腔内（ip）注射で毎日治療されました。 阻害剤治療により、ビヒクルと比較して、疾患の重症度と累積臨床スコアが大幅に低下しました（図S5CおよびS5D）。 26日目にマウスを犠牲にし、免疫プロファイリングのために脊髄浸潤細胞を収集した。 特に、CD45が大幅に少なくなっています^プラス、CD4^プラス、およびCD8^プラス細胞はLY345899-処理マウスの脊髄に浸潤しました（図S5E–S5G）。 RORtの頻度に変化はありませんでした^プラスまたはFoxP3^プラス浸潤性CD4の中の細胞^プラスT細胞（図S5H）。 ただし、IFNg + IL -17 +細胞の頻度が減少し、IL -17 +細胞が増加し（図S5I）、病原性の低い表現型への切り替えの可能性が示唆されました。

インビボでのMTHFD2へのT細胞固有の依存性を直接試験するために、WTおよびCD4DMthfd2同腹子を3つの異なるモデルに供した：EAE、炎症性腸疾患（IBD）、およびアレルギー性気道疾患。 EAEはMOGとPTXで再び誘発され、阻害剤実験と同様に、CD4DMthfd2マウスは26日間で疾患の重症度を大幅に軽減しました（図7D）。 別のコホートは、T細胞表現型の誘導後15日目のピーク疾患で安楽死させました（図S6AおよびS6B）。 CD4ですが^プラスまたはCD8^プラス脾臓ではT細胞数に変化はなく（図S6C）、脊髄へのCD4とT細胞の浸潤が大幅に減少しました（図7E）。 CD4DMthfd2マウスの脊髄浸潤CD4プラスT細胞は、WTと同様のCD25発現を示しましたが、CD44の発現が低下しており、活性化が部分的に損なわれていることを示しています（図7F）。 Tベットの数^プラス、ROR t plus、およびFoxP3 plus細胞（図7G）、ならびにIL -17plusおよびIFNgplus細胞（図7H）も、WTと比較してCD4DMthfd2マウスの脊髄で減少しました。 特に、FoxP3plusとT-betplusおよびRORgtplus細胞の比率は、ピーク時のWTと比較してCD4DMthfd2マウスで上昇し、MTHFD2欠損を伴うFoxP3発現の増加というin vitroの所見を反映しています（図7G）。 浸潤細胞の中でTF発現細胞の頻度は全体的に高くなる傾向がありましたが、サイトカイン発現の頻度は変化しませんでした（図S6DおよびS6E）。 EAEおよびWTおよびCD4を含まない対照マウスの脊髄の組織学^ΔMthfd2EAEのマウスは、Luxol Fast Blue染色で示されるように、脱髄に関連するWTマウスの脊髄の細胞性とCD3陽性の増加を示しました（図7I）。 これらの変化は、非EAEコントロールとCD4には見られませんでした。^ΔMthfd2マウス。

MTHFD2の役割は、次にIBDおよびアレルギー性気道疾患モデルでテストされました。 WTおよびCD4DMthfd2ナイーブCD4プラスT細胞をRag1/レシピエントに移してIBDを開始しました。 WT細胞を投与されたマウスはIBDが進行するにつれて体重が減少し始めましたが、CD4DMthfd2 T細胞のレシピエントは体重が増加し続けました（図7J）。 脾臓（図S6F）および結腸を排出する腸間膜リンパ節（MLN）（図7KおよびS6G）では、CD4DMthfd2T細胞の数と頻度が大幅に減少しました。 T-bet plus、ROR t plus、およびFoxP3 plus CD4DMthfd2 T細胞の数もMLNで減少しましたが、FoxP3 plus細胞の頻度は増加しました（図7LおよびS6H）。 ただし、この後期段階の時点では、MLNのFoxP3/T-betおよびFoxP3/RORgtの細胞数比に違いはありませんでした（図S6I）。 インビボ気道炎症CRISPRスクリーンにおける中程度のヒットとしてのMTHFD2の所見（図1C）と同様に、アルテルナリア誘発性アレルギー性気道疾患にさらされたCD4DMthfd2マウスは、気管支肺胞洗浄液（BALF）における好中球の存在量が減少する傾向がありました。 BALFリンパ球、好酸球、およびマクロファージの数に変化が観察されました（図S7A）。

最後に、MTHFD2iの効果が一般的な免疫活性でテストされました。 OVA固有のOT-IICD45.2^プラスCD4^プラスT細胞は養子的にCD45.1に移されました^プラス次に、完全フロイントアジュバント（CFA）を含むOVAのエマルジョンで皮下免疫し、経口ビヒクルまたはMTHFD2iで毎日治療したマウス。 体重はすべての条件下で変化しませんでした（図S7B）。 転送されたOT-IICD45.2の拡張^プラス免疫化されたMTHFD2i処理マウスでは細胞がわずかに遅延しましたが、7日目までにビヒクル数に達しました（図S7C–S7E）。 ただし、IFNgと細胞の頻度は、LNの排出で減少しました（図S7F）。 これらのデータは、in vivo MTHFD2i治療により、炎症性サイトカインの産生が抑制されているものの、急性刺激後の抗原特異的T細胞の増殖が可能であることを示しています。

討論

T細胞の活性化、分化、および機能には、エネルギー、生合成ビルディングブロック、およびシグナル伝達分子に対する細胞の増大する要求を満たすために、適切な代謝の再プログラミングが必要です。 この研究では、初代CD4プラスT細胞における1C代謝の機能を調査しました。 インビボでの初代T細胞CRISPRベースのスクリーニングと遺伝子発現データの組み合わせを使用して、MTHFD2は抗炎症療法の潜在的な標的として同定されました。 MTHFD2の阻害または欠損は、一般的にCD4とT細胞の増殖の低下をもたらしました。 特に、これは、Th17細胞におけるFoxP3発現と抑制機能の誘導、およびTreg細胞の分化の増強に関連していました。 これらのデータは、MTHFD2がTh 17- Treg細胞軸の代謝チェックポイントとして機能し、MTHFD2i治療が病原性からより抗炎症性の表現型へのバランスをとっていることを示唆しています。 確かに、MTHFD2阻害または遺伝的欠損は、自己免疫および過敏症の複数のinvivoモデルにおける疾患の重症度を改善しました。

1C代謝は、セリン-グリシン代謝、葉酸サイクル、およびメチオニンサイクルで構成され、de novoプリン合成、メチルドナー生成、酸化還元調節などのいくつかのプロセスの中心です（Yang and Vousden、2016）。 1C代謝はTCR刺激に強く関与し（Tan et al。、2017）、T細胞の増殖をサポートする必要があります（Ma et al。、2017）。 葉酸サイクルは、細胞質ゾルとミトコンドリアの成分に区画化されています。 細胞質ゾルでは、MTHFD1は5、10-メチレンTHF、10-ホルミルTHF、およびギ酸塩を相互変換します。 ミトコンドリアでは、同じ反応がMTHFD2とMTHFD1Lによって達成されます。 これらの結果として生じる中間体は、denovoプリン合成におけるホルミル化ステップをサポートするために使用されます。 MTHFD1およびMTHFD2は、NAD（H）およびNADP（H）の生成を通じて酸化還元状態を調節することもできます（Ducker and Rabinowitz、2017）。 一部の細胞タイプは、ミトコンドリア経路の機能不全の設定下で細胞質ゾル源に切り替える際の柔軟性を示しますが（Ducker et al。、2016）、T細胞は主にミトコンドリア経路に依存して1Cユニットと還元種を提供することが以前に提案されています（Ron- Harel et al。、2016）。 T細胞はセリンの取り込みに依存することも示されており、invivoの免疫応答は食事中のセリンの量によって調節することができます。 セリン飢餓の影響は、無傷のサルベージ経路が存在する場合でもプリン生合成を制限することによって媒介され、グリシンとギ酸塩の供給によって回避することができます（Ma et al。、2017）。 私たちのデータはこれらの発見に追加され、CD4に影響を与える重要な調節因子としてMTHFD2を示しています^プラスT細胞の増殖と分化。

エカニコシド

1C代謝は細胞代謝において幅広い役割を果たしますが、T細胞サブセットを選択するためにいくつかの機能が異なることがわかりました。 すべてのヒトおよびマウスのT細胞は、MTHFD2欠損症でより少ない程度で増殖しました。これは、MTHFD2がT細胞の成長と分裂をサポートするための共有機能を示しています。 ただし、T細胞の分化とエフェクター機能に対するMTHFD2欠損の影響は、テストしたサブセットごとに異なりました。 Th1細胞は、T-betの誘導が減少し、サイトカイン産生が減少した分化障害を示しました。 Th17細胞はまた、分化が変化し、サイトカイン産生が減少しました。 ROR tは変化しませんでしたが、MTHFD 2-欠損Th17細胞はTreg細胞TFFoxP3をアップレギュレーションし、活性化CD8とT細胞の増殖を抑制する能力を獲得しました。 Treg細胞は、低TGF-b条件下で分化の増強を示しました。 現在、これらのサブセットのそれぞれが異なる代謝要件を持つことができることが十分に確立されています（Bantug et al。、2018; Buck et al。、2015）。 私たちのデータは、MTHFD2がTreg細胞の運命と機能を促進しながら、Teff細胞にも選択的に必要であることを示しています。 これらの結果は、Treg細胞の分化またはTh17からTreg細胞への分化転換を直接促進する適度な効果を持ちながら、Teff細胞の分化を損なうまたは変更するGLUT1、GLS、またはASCT2の欠陥とは異なることに注意してください（Johnson et al。、2018; Macintyre et al 。、2014; Nakaya et al。、2014）。

MTHFD2欠損の影響はギ酸塩またはプリン核酸塩基で救済されたため、これらの異なるT細胞の運命はMTHFD2の酵素活性に依存しているようです。 MTHFD2欠損症による酸化還元バランスの変化による有意な影響は見られませんでしたが、denovoプリン合成の変化が重要であるように思われます。 MTHFD2i処理により、プリン合成中間体GAR、SAICAR、およびAICARの蓄積を誘導しながら、プリン濃度、特にグアニンが減少しました。 これらの中間体は、さらなる生合成のためにホルミル化を必要とし、MTHFD 2-由来のギ酸代謝物を培地に添加すると、効果が回復し、MTHFD2iのオンターゲット生化学的メカニズムがサポートされます。 DNAおよびRNA合成をサポートするためのdenovoヌクレオチド合成は、T細胞の増殖に不可欠です（Que´ me´neur et al。、2003,2004）。 したがって、MTHFD2iがT細胞の増殖を損なうメカニズムの構成要素は、ヌクレオチドの生成が不十分であるように思われます。

フラボノイド

適切なヌクレオチドの合成に失敗すると、複数のメカニズムを通じてエフェクターT細胞が抑制される可能性があります。 AMPKとmTORC1は、Teff細胞とTreg細胞で一般的に反対の役割を持つ代謝リプログラミングの主要な推進力です（Bantug et al。、2018; Buck et al。、2015）。 T細胞でのMTHFD2i処理が、アデノシン類似体およびAMPK活性化因子として注目に値する代謝物であるAICARの急性蓄積をもたらしたことを示します（Rae and Mairs、2019; Su et al。、2019）。 ただし、選択した時点でAMPK活性が増加したという証拠はありませんでした。 これはAMPKの追加規制を反映している可能性がありますが、AICARはAMPKに依存しない効果も持つ可能性があります（Dembitz et al。、2019）。 グアニンの利用可能性が低下すると、mTORC1活性化因子Rhebの活性が抑制されるため、mTORC1はプリン濃度にも敏感です（Emmanuel et al。、2017; Hoxhaj et al。、2017）。 したがって、AICARの蓄積とmTORC1活性の低下は、MTHFD2iで処理されたTh1およびTh17細胞の生成の障害、およびTreg細胞の生成の増強に寄与する可能性があります。 mTORC1シグナル伝達の抑制は、解糖系からミトコンドリア呼吸への代謝プログラムのシフト、およびMTHFD2iで処理されたTh17細胞におけるTCA代謝物の存在量の変化にも寄与する可能性があります。 mTORC1経路は、同化代謝を促進する上で中心的な役割を果たし、TF ATF4の蓄積を促進し、それがMTHFD2の発現を誘導する可能性があります（Ben-Sahra et al。、2016）。

代謝フラックスは、タンパク質およびDNAメチル化のためのユニバーサルメチルドナーS-アデノシルメチオニン（SAM）を生成する1C代謝を含む、多くのエピジェネティック修飾に寄与するため、エピジェネティック調節に関連しています（Sharma and Rando、2017）。 しかし、活性化T細胞での炭素追跡実験は、グルコース由来および外因性セリンに由来する1Cユニットがメチオニンサイクルおよびメチル化に有意に寄与しないことを示唆しています（Ma et al。、2017）。 代謝フラックスは、α-ケトグルタル酸、フマル酸、コハク酸などのTCA代謝物の量の変化を通じてメチル化パターンにも影響を与える可能性があります。 具体的には、フマル酸塩とコハク酸塩はDNAとヒストンデメチラーゼを阻害します（Su et al。、2016）。 MTHFD2iで処理したTh17細胞におけるこれらの代謝物の枯渇と一致して、H3K27me3はゲノム全体で広く減少し、DNAメチル化はFoxp3近位プロモーターで特異的に減少しました。これは分化転換表現型に寄与している可能性があります。 Th17細胞の分化転換表現型は、ギ酸塩の補給によって救済されなかった。これは、他のヌクレオチド濃度感知メカニズムの活性などを通じて、追加の経路がFoxP3調節に寄与している可能性が高いことを示している。

アクテオシド（Verbascoside）

MTHFD2は、この酵素の炎症誘発作用に寄与する可能性のある非酵素的役割を果たすことも報告されています。 癌細胞では、MTHFD2は核機能を持ち、DNA複製部位と共局在して、細胞周期の進行を促進します（Gustafsson Sheppard et al。、2015）。 マウス幹細胞では、MTHFD2がDNA修復を調節して、ゲノムの安定性を維持することが示されています（Yue et al。、2020）。 腎細胞癌では、MTHFD2がmRNAメチル化を介した代謝の再プログラミングに重要であることがわかっています（Green et al。、2019）。 MTHFD2のこれらの役割は、我々の発見と相互に排他的ではありませんが、T細胞におけるMTHFD2欠損の表現型の多くを救済するギ酸塩の能力は、MTHFD2酵素活性がT細胞増殖と運命の主要な推進力であることを示唆しています。

MTHFD2は、主に抗がん剤の設定における創薬ターゲットと見なされてきました。 それはまた、有望な抗炎症標的であり、ほとんどの成人組織での発現が低いことを考えると、現在利用可能な葉酸拮抗薬と比較して副作用が少ない可能性があります。 たとえば、MTXの1つの標的であるDHFRは、成人組織で広く発現しています（Nilsson et al。、2014）。 したがって、MTXは、胃腸毒性を含むさまざまな副作用と関連している可能性があります。 さらに、MTXの作用機序は、その広範な歴史にもかかわらず、十分に理解されていないままです（Cronstein and Aune、2020）。 MTHFD2の高度に調節された発現と、細胞質ゾルのMTHFD1経路との冗長性の可能性により、特定の細胞集団がMTHFD2に選択的に依存する可能性があります。 私たちの調査結果は、MTHFD2がCD4の重要な代謝チェックポイントであることを示しています^プラスT細胞。 癌細胞の生物学と急速に増殖するT細胞の生物学の間には広い重複がありますが、CD4とT細胞のサブセットは細胞の分化と機能の調節を通じて追加の感度を示すことがわかります。 癌治療でMTHFD2を標的とすることは、抗腫瘍免疫を抑制する可能性があります。 ただし、Th17細胞を介した炎症が疾患に寄与する結腸直腸癌などの設定は、MTHFD2isに適している可能性があります。 MTHFD2isに対するT細胞の感受性は、CD4の設定における免疫療法の効果的な形態である可能性があります^プラス癌を超えたT細胞による炎症であり、現在利用可能な治療薬よりも副作用が少ない。

研究の限界

この研究で使用されたMTHFD2iのIC50値は、MTHFD2の場合は0。0063 mM、MTHFD1の場合は0.57mMです。 したがって、MTHFD2とMTHFD1の二重阻害によるマイナーなオフターゲット効果を排除することはできません。 Th17細胞における異常なFoxP3のアップレギュレーションはギ酸塩の供給によって救済されなかったが、mTORC1活性は救済されたことを考えると、この表現型の根底にあるメカニズムはさらなる調査が必要です。 さらに、すべてのin vivoモデルは、MTHFD2i治療または疾患誘発時からの遺伝子除去を使用して実行され、T細胞表現型は単一の時点で実行されました。 疾患の病因に対するMTHFD2欠損の影響をよりよく特徴付けるために、さらなる研究には、CD4とT細胞サブセットがinvivoで異なって影響を受けるかどうかをより明確に決定するためのT細胞集団の連続的特徴付けによる経時的実験を含める必要があります。 最後に、この研究と臨床応用との関連性を改善するために、発病後に開始されたMTHFD2i治療の有効性をテストする必要があります。

STAR★METHODS

詳細な方法は、このペーパーのオンラインバージョンで提供されており、次のものが含まれます。

• 主なリソース表

• リソースの可用性

• Bリードコンタクト

• B材料の入手可能性

• Bデータとコードの可用性

  
  

• 実験モデルと主題の詳細

• BマウスBヒトT細胞

• B細胞株

  
  

• メソッドの詳細

• BinvitroマウスCD4^プラスT細胞の活性化と分化

• BTh17細胞抑制アッセイ

• BinvitroヒトCD4^プラスT細胞培養条件

• BCRISPRスクリーニングB質量分析メタボロミクス

• Bプロトン核磁気共鳴分光法（1H-MRS）

• Bイムノブロッティング

• B CUT＆RUNBEpigenDxターゲットのNextGenビスルファイトシーケンス

• BIHCおよびフローサイトメトリーのinvivoEAEモデル

• BEAEモデルにおけるinvivoLY345899治療

• BDTHモデルでのinvivoDS18561882治療BWTおよびCD4を使用したInvivoIBDモデル^ΔMthfd2同腹子

• BWTおよびCD4を使用したinvivoアレルギー性気道疾患モデル^ΔMthfd2同腹子

• BOVA免疫化モデルにおけるinvivoDS18561882治療

  
  

• 定量化と統計分析

補足情報

補足情報は、https：//doi.org/10.1016/jでオンラインで見つけることができます。 immuni.2021.10.011。

謝辞

このプロジェクトに貢献してくれたRathmellラボのメンバーに感謝します。 RNA-seqデータを提供してくれたThomasAuneと、pMx-U 6-gRNA-GFPコンストラクトを提供してくれたJ.Cools（VIB）に感謝します。 MTHFD2qPCRプライマーを設計してくれたMaxR.VanBelkumに感謝します。 調査結果を裏付けるために使用されたRaze1459化合物を提供してくれた、Raze Therapeutics、Inc.（マサチューセッツ州ボストン）のNello Mainolfifi、Vipin Suri、Adam Friedman、およびMarkManfrediに感謝します（データは示していません）。 ダイアグラムはBioRenderで作成されました。 NCI / NIHCancerCenterサポート助成金5P30CA68485-19および共有機器助成金S10OD023475-01 A1によってサポートされている、ライカボンドRXのトランスレーショナルパソロジー共有リソースに感謝します。 この作品は、Lupus Research Alliance（JCRへ）、R01s DK105550（JCRへ）、HL136664（JCRおよびDCNへ）、CA217987（JCRへ）、AI153167（JCRへ）のWilliam E. Paul DistinguishedInnovatorAwardによってサポートされました。 AI137075（AKMへ）、T32 DK101003（KV）、​​およびT32 GM007347（ASへ）。

著者の貢献

AS、GA、およびJCRが調査を設計しました。 AS、GA、KV、DRH、XX、MZM、XY、KLB、NC、MMW、ACY、DLG、AES、SKS、SNF、AMC、PF、TB、およびJCG-C。 研究を行った。 AS、GA、XY、JK、DCN、AKM、JDR、およびJCRの分析データ。 ASとJCRは、他の著者からの寄稿で論文を書きました。

利益の宣言

JCRは、Sitryx Therapeuticsの創設者、科学諮問委員会メンバー、および株主です。 科学諮問委員会のメンバーであり、CaribouBiosciencesの株主です。 NirogyTherapeuticsの科学諮問委員会のメンバー。 過去3年以内にメルク、ファイザー、ミトブリッジのコンサルティングを行ってきました。 Incyte Corp.、CalitheraBiosciences、TempestTherapeuticsから研究支援を受けています。 JDRは、Raze Therapeutics、Toran、Serien Therapeutics、およびFarber Partnersの共同設立者および株主であり、Agios Pharmaceuticals、Kadmon Pharmaceuticals、Bantam Pharmaceuticals、Colorado Research Partners、RafaelHoldings、Barer Institute、およびLEAFPharmaceuticalsの顧問および株主です。 彼はファイザーとラファエルからコンサルティング料と研究資金を受け取り、プリンストン大学が保有する特許の発明者です。 AMC、PF、およびTBは、SitryxTherapeuticsの従業員です。

包含と多様性

私たちは、人間以外の被験者の選択において性的バランスを確保するよう努めました。 この論文の著者の1人以上は、科学において過小評価されている少数民族であると自己認識しています。 この研究に科学的に関連する参考文献を引用する一方で、参考文献リストで男女共同参画の促進にも積極的に取り組みました。 この論文の著者リストには、データ収集、設計、分析、および/または作業の解釈に参加した、調査が実施された場所からの寄稿者が含まれています。

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STAR★METHODS

主なリソース表

リソースの可用性

リードコンタクト

リソースと試薬に関する詳細情報と要求は、リードコンタクトのジェフリーラトメル博士（jeff.rathmell@vumc.org）が適切なMTAを完了すると、送信され、実行されます。

材料の入手可能性

この研究で生成されたプラスミドとマウス系統は、要求に応じて適切なMTAが完了すると利用できるようになります。

データとコードの可用性

CUT＆RUNシーケンスデータはGEOに寄託されており、発行日（GSE180356）の時点で公開されています。 この論文で報告された顕微鏡データと元のウエスタンブロット画像は、要求に応じて主任連絡先によって共有されます。 このペーパーで報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求に応じて主任連絡先から入手できます。

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