多成分のプライムブーストクラミジア・トラコマチスワクチン接種は、非ヒト霊長類モデルにおいて抗体およびT細胞反応を誘導し、感染の排除を加速する

性感染症に対するワクチンの開発は国際的な優先事項であるクラミジア・トラコマチス感染症続く世界的な感染拡大と闘うため。 の最適な予防接種戦略はまだ完全には解明されていない。 この研究の目的は、予防接種戦略非ヒト霊長類 (NHP) モデルで。 カニクイザル (Macaqua fascicularis) は、さまざまな多成分に従って免疫化されました。プライムブースト予防接種スケジュールを設定し、その後、下部生殖管に C. trachomatis SvD を投与しました。 免疫化抗原には、CAF01 または水酸化アルミニウムでアジュバントを添加した組換えタンパク質抗原 CTH522、MOMP DNA 抗原、および MOMP ベクター抗原 (HuAd5 MOMP および MVA MOMP) が含まれました。

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すべての抗原構築物は免疫原性が高く、顕著な全身性クラミジア・トラコマチス特異的 IgG 応答を引き起こしました。 特に、CTH522タンパク質ワクチン接種グループは、血清中に迅速かつ強力な特異的IgGを上昇させた。 MOMP 内の特定の B 細胞エピトープのマッピングにより、すべてのワクチン接種グループが MOMP の可変ドメイン (VD) 付近または内部のエピトープを認識し、すべての動物で一貫した VD4 応答が示されたことが示されました。 さらに、すべてのワクチン接種グループの血清は、SvD、SvE、および SvF の両方を in vitro 中和することができました。 抗体反応は膣および眼の粘膜に反映され、検出可能なレベルの IgG が示されました。 末梢血単核球 (PBMC) の in vitro 刺激および細胞内サイトカイン染色によって示されるように、ワクチンは C. トラコマチス特異的細胞媒介性応答も誘導しました。 一般に、タンパク質 (CTH522) ワクチン接種グループは多機能 CD4 T 細胞応答を確立しましたが、DNA およびベクターワクチン接種グループは CD8 T 細胞応答も確立しました。 C. trachomatis SvD による膣攻撃の後、ワクチン接種グループのいくつかは次の症状を示しました。感染の排除の加速、しかし特に DNA グループは、CAF01 アジュバント添加 CTH522 でブーストされ、バランスCD4/CD8T 細胞応答と組み合わせIgG応答、示した感染の排除の加速.

キーワード ワクチン、感染症、免疫学、細菌、CD4/CD8 リンパ球、クラミジア・トラコマチス

序章

性器クラミジア・トラコマチス感染症は、世界中で毎年推定 1 億 3,100 万人の新規感染者を引き起こしており (1)、潜在的に感染を引き起こすことで世界的な重大な健康問題を構成しています。重度の合併症骨盤などの炎症性疾患, 子宮外妊娠、 と不妊(2、3)。 抗生物質は依然としてクラミジア・トラコマチス感染症の効果的な治療法を提供します。 ただし、感染の最大 75% は無症状であるため、感染症の大部分は未治療のまま放置されている、送信は中断されません (3)。 クラミジア感染症の継続的な蔓延に対する最も効果的な武器は予防ワクチンであるということは一般的に同意されています(4)。

数年間の研究にもかかわらず、ワクチンはまだ市場に出ていません。 これは部分的にはクラミジア・トラコマティスの複雑な二相性のライフスタイルによるものです。 細胞内段階と細胞外段階の両方を伴うクラミジア・トラコマティスの独特な二相生活環は、免疫系に課題をもたらします。 防御免疫は、血清型特異的抗体に加えて、細胞性免疫 (CMI) 応答から構成されるべきであると考えられています (5-13)。 さらに、生殖管で粘膜免疫を生成することは、ワクチンにとってさらなる課題となっています。

本研究では、NHP クラミジア感染モデルでさまざまなワクチン戦略をテストしました。 この戦略は、抗体、CD4 T 細胞、および/または CD8 T 細胞応答を誘導することを目的としていました。 さらに、ワクチンの中には粘膜反応を引き起こすことを目的としたものもあります。 この研究のために選択された抗原は、主要外膜タンパク質に基づいています。 まず、最も蔓延しているクラミジア・トラコマチス株に対して高いエピトープ範囲を提供するために、約 1500 の血清型 E ompA 配列に基づくコンセンサス MOMP 抗原 (Con E) が生成されました (14)。 次に、合成融合タンパク質である CTH522 を使用しました。 CTH522 は MOMP の組み換え操作バージョンであり、4 つの生殖器 Ct 血清型 (D、E、F、および G) の VD4 領域の異種免疫リピートを含んでいます (11)。 組換え融合タンパク質の背後にある戦略は、防御エピトープに対する増幅された応答を誘導し、血清型間防御を誘導することです (11)。

今回の実験のもう 1 つの重要な特徴は、鼻腔内ブースターと組み合わせた 2 つの著しく異なるアジュバント システム (AlOH および CAF01) における CTH522 の並行評価でした。 この組み合わせはマウスとミニブタでテストされており、高力価の中和抗体、IFN-γ 産生 CD4 プラス T 細胞を誘導し、生殖器クラミジア・トラコマティス感染症の除去を促進することにより、免疫原性が高いことが示されました (11-13)。 、15）。 さらに、この比較は、両方の製剤が免疫原性であることが証明され、中和血清抗体およびTh1細胞媒介性免疫応答の誘導においてCAF01が優れていた最近のファースト・イン・ヒト臨床試験を反映している(16)。 強力な細胞性免疫応答、特に CD4 T 細胞応答と組み合わせた CD8 T 細胞応答を誘導するために、一部の動物をアデノ ベクター pAL1112 (HuAd5-MOMP) で初回刺激した後、CT522/CAF01 免疫原で追加免疫しました。 MVA ポックス ベクター、または MOMP Con E 抗原を送達するプラスミド DNA pcDNA3.1 (14、17)。 3 つのベクターすべてが NHP で免疫原性があることが証明されており、最近、これら 3 つのワクチンとアジュバント添加タンパク質抗原による最終追加免疫ワクチン接種を組み合わせた免疫戦略が、マウス C. トラコマティスの膣内 C. trachomatis のクリアランスを一貫して強化することが示されました。トラコマティス感染モデル (14)。

本研究では、非ヒト霊長類 (NHP) モデルにおいて、タンパク質ワクチン、DNA ワクチン、および組換えウイルスベクターワクチンの両方を用いた多成分免疫戦略のさまざまな組み合わせが、異なる免疫応答を引き起こすことを実証します。 さらに、DNA プライミングとタンパク質 (CTH522/CAF01) を使用したレジメンにより、クラミジア・トラコマティスによる生殖器攻撃後の細菌クリアランスの加速が促進されたことを観察しました。

結果

すべてのワクチン接種計画が安全であることが証明され、重大な全身性抗体反応が誘発された

図1および補足図に示すように、タンパク質、DNA、およびベクターワクチンの両方と異なる投与経路を含む異なるプライム-ブーストワクチン接種計画に従って、合計30匹のカニクイザルにワクチン接種されました6-10)。 研究中、すべての動物は健康を維持し、予防接種に対して測定可能な副作用は発現しませんでした。 さらに、動物の体重や体温に大きな変動は観察されませんでした (補足図 1、2)。

免疫化後の一定の時点で、血清を収集し、血清中のCTH522特異的IgGのレベルをELISAによって評価した。 ワクチン接種を受けた 5 つのグループすべてで、有意な血清 CTH522 IgG 応答が確立されました (図 2)。 ただし、ワクチン接種した 5 つのグループでは動態がわずかに異なりました。 CTH522/AlOH プラス IN、CTH522/CAF01、および CTH522/CAF01 プラス IN グループのすべての動物は、わずか 1 回の筋肉内 (IM) 免疫化後に有意な IgG 力価を上昇させ、IgG 力価は最後のサンプリング時点まで有意なままでした (図 2A- C)。 血清ＩｇＧレベルは、ＤＮＡ＋ＣＴＨ５２２群およびベクター＋ＣＴＨ５２２群ではわずかにゆっくりと増加し、すべての動物がそれぞれ８週目および４週目に血清変換された（図２Ｄ、Ｅ）。

ＣＴＨ５２２／ＡｌＯＨ＋ＩＮ、ＣＴＨ５２２／ＣＡＦ０１＋ＩＮ、およびＣＴＨ５２２／ＣＡＦ０１群は、１６週目の３回目のＩＭ追加免疫ワクチン後に血清ＩｇＧを有意に増加させた（図２Ａ～Ｃ）。 ＤＮＡ＋ＣＴＨ５２２およびベクター＋ＣＴＨ５２２グループは、２０週目のタンパク質／ＣＴＨ５２２／ＣＡＦ０１ＩＭブースター後に血清ＩｇＧレベルを有意に増加させた（図２Ｄ、Ｅ）。 CAF01またはAlOHアジュバントのいずれかを配合したCTH522による3回のIMワクチン接種後の血清抗体反応（図2A、B）、およびCTH522/AlOHプラスINおよびCTH522/AlOHアジュバントを加えた鼻腔内（IN）非アジュバント追加ブースター免疫化では、有意差は見られませんでした。 CTH522/CAF01 + IN グループは、血清 IgG 抗体力価の有意な増加を誘導しませんでした (図 2A、B)。

血清 IgG 応答の動態は膣液中の動態/レベルを反映しており、膣表面で検出された抗体が循環に由来する可能性が高いことを示しています。 同様に、眼の IgG レベルも血清 IgG レベルに従い、血清で観察されたように、DNA/ベクター グループの IM ブースターが眼の IgG 力価を増加させることが示されました (補足図 3)。

血清抗体応答は、MOMP 配列の可変ドメイン 1、3、および 4 に対して向けられます。

次に、異なるワクチン接種計画後の血清抗体による特異的エピトープ認識のさらなる解明を評価した。 血清を24週目に、すなわちグループ1および2では鼻腔内ブースターワクチン後、DNAおよびベクターグループ(グループ4および5)ではIMブースターワクチン後に分析した。 これらの分析は、14 アミノ酸の重複を持つ 15 mer ペプチドからなる CTH522 をカバーするペプチド アレイを使用して実行されました。

図 1 研究デザイン。 図は、使用されたグループ、ワクチン、投与経路（筋肉内、IM、または鼻腔内、IN）を示しています。

図 2 (A ～ F) 血清 CTH522 IgG 抗体反応。 カニクイザルは、異なる初回追加免疫療法（グループ当たり n=5 人）に従って免疫され、血清は隔週ごとに収集されました。 血清中の特異的 CTH522 IgG 抗体は ELISA によって評価され、ここでは log10 スケールの力価として表されました。 灰色の矢印はワクチン接種を示します。 各線は 1 匹の動物を表します。 統計的有意性はアスタリスク *p < 0.05 および **p < 0.01 で示されます。

一般に、認識されたペプチドは MOMP の可変ドメイン (VD 1、3、4) の近くおよびその中に位置していました。 CTH522/AlOH グループは、VD2 領域の認識さえ示しました。 すべての動物は、保存された中和 VD4 エピトープを含む VD4 領域に対して強い反応を確立しました (11)。 DNA グループは VD 内で最も狭い認識を示しましたが (図 3)、ベクター グループはわずかに広い認識パターンを示しました。 CTH522/CAF01 および CTH522/AlOH グループは、特に SvF および SvG に対して最も広範な認識を示しました。

血清抗体は in vitro で SvD、SvE、SvF を中和することができました

ワクチン誘導抗体が C. trachomatis による標的細胞の感染を阻害する能力を評価するために、in vitro 中和アッセイを実施しました。 このアッセイを使用して、SvD、SvE、および SvF の両方の中和を調べました。 24週目からの血清をアッセイに使用し、ナイーブグループからの血清を対照として使用しました。 ワクチン接種を受けた 5 つのグループすべてが、3 つの血清型すべてを中和する能力を示しました (図 4)。 SvD に対しては、CTH522/AlOH プラス IN グループが最も高い 50% 中和力価を示しましたが、SvE に対しては DNA/CTH522 グループが最も高い中和力価を示し、それに僅差で CTH522/AlOH プラス IN グループが続きました。 すべてのグループが SvF を中和できたにもかかわらず、この血清型に対する 50 パーセント中和力価は、SvD および SvE と比較してすべてのグループでわずかに低かった。 ベクターと CTH522 グループは、すべてのワクチン接種グループの中で最も低い 50% 中和力価を示しました。

異なるワクチン接種計画により異なる T 細胞プロファイルが誘導される

ワクチン接種によって誘導される T 細胞応答を評価するために、研究期間中に PBMC を収集し、凍結保存しました。 0/ベースラインおよび 22 週目の PBMC をペプチドプール (MOMP) で再刺激し、細胞内サイトカイン染色 (ICS) および他のサイトメトリーによって細胞内サイトカインを評価しました。 PBMC は次の細胞マーカーで染色されました: CD3、CD4、CD8、CD154、CD137、およびサイトカイン: IFN-g、IL-2、TNF-a、IL-22、IL{{14} }A. ゲート戦略を補足図4、5に示します。MOMPペプチドプールによるPBMCの刺激は、顕著な応答を誘導しました。 IL2、IFN-g、およびTNF-αの組み合わせを発現する抗原特異的CD154+CD4+T細胞の割合は、すべてのワクチン接種グループにおいて最後の免疫化(W22)から2週間後に増加しました(図5)。 これらの T 細胞の大部分は、いくつかのサイトカインを発現するという意味で多機能でした。 サイトカインを産生する抗原特異的 CD137 プラス CD8 T 細胞の割合は、DNA およびベクター グループ (W22) でのみ増加しました (図 6、CD137 プラス CD8 プラス T 細胞の多機能性を示します)。 の

図 3 24 週目の血清エピトープ マッピング。カニクイザルを異なるプライムブースト法で免疫し (グループあたり n=5)、血清を 24 週目に収集しました。CTH522 15 mer の重複に対するペプチド アレイ IgG の応答ペプチドは各グループのシグナル中央値として表示され、SvD、E、F、および G (赤) の VD1 ペプチド (オレンジ)、VD2 (緑)、VD3 (青)、および VD4 ペプチド (赤) が色で強調表示されます。

図 4 C. トラコマチス SvD、SvE、および SvF のインビトロ血清中和。 カニクイザルは、異なる初回追加免疫療法（グループあたり n=5）に従って免疫され、免疫スケジュールの終了後（24 週目）に血清が収集されました。 C. trachomatis SvD、SvE、および SvF を各動物の血清とともにインキュベートし、抗体と細菌の混合物を HaK 細胞上でインキュベートし、封入体を染色することによって、感染を阻害する血清抗体の能力を評価しました。 黒色の線は SvD を示し、灰色の線は SvE を示し、濃い灰色の点線は SvF を示します。 赤い点線は、各血清型の逆数の 50 パーセント中和力価を示します。

図 5 CD4 T 細胞の応答。 多機能分析第 22 週。ICS によってアッセイされた CD4 プラス T 細胞によるサイトカイン産生。 MOMP からの重複ペプチドのプールによる刺激後の多機能応答が表示されます。 各パイのサイズは、IFN-g、TNF-α、IL-2 を含む少なくとも 1 つのサイトカインを発現する CD154 + CD4 + T 細胞の割合、および IFN-g と IL{8}} を発現する細胞の割合に比例します。 /またはTNF-aおよび/またはIL-2サイトカインが各円グラフに表示されます。

ワクチン接種による膣内クラミジア・トラコマチスSvD感染症のクリアランスの加速

ワクチン誘発免疫反応の防御効果を評価するために、動物に 5x107 IFU の C. trachomatis SvD による膣感染症を与えました。 接種後、膣のクラミジア量を膣スワブ中のクラミジア DNA の PCR 検出によって測定しました (図 7)。 DNA プラス CTH522/CAF01 グループおよびベクター プラス CTH522 グループでは 5 週目までに、CAF01/CTH522 グループでは 6 週目まで、CTH522/ミョウバンプラスグループでは 8 週目までに、すべての動物で感染が解消されました。 IN グループ (図 7)。 対照群では、8週目に80％の動物が感染を解消し、9週目でも1匹の動物がPCR陽性のままでした。CTH522/CAF01＋IN群のINブースターは防御力を増加させませんでした（図7）。 すべてのグループを比較したログランク (マンテル-コックス) 検定では、P 値 0.0994 が示され、各グループを対照グループと個別に比較すると、DNA-CTH522 グループのみが 0.05 未満の P 値を示しました (P値=0.0257)。

議論

本研究は、体液性免疫と組み合わせて細胞性免疫 (CD4 および CD8) を誘導し、MOMP ベースのクラミジア ワクチンで適応免疫の表現型を調整するように設計されました。 我々は、タンパク質ワクチン（CTH522、Con E）、DNAワクチンと組換えウイルスベクター（MVA MOMP）、およびアデノベクターベースのワクチンの両方を用いた多成分免疫戦略の組み合わせの免疫原性と防御効果を、ヒト以外の霊長類で評価します（ NHP）モデル。

データは、すべての免疫化計画が免疫原性であり、中和抗体からなる細胞応答と体液性応答の両方を誘導したことを示しました（図2-4）。 CAF01 または AlOH のいずれかを配合したタンパク質ワクチン CTH522 は、全身性の抗原特異的 IgG の迅速な誘導を示しました (図 2)。 AlOH および CAF01 アジュバント添加ワクチンによって誘発される反応の間に有意な差は観察されませんでしたが、これはこれらのアジュバントを使用したヒトで観察された反応と一致しています (16)。 DNA およびベクターワクチン接種計画も、抗原特異的全身性抗体の有意な力価を誘導し、タンパク質追加免疫後に顕著に増加しました (図 2)。 我々の結果と一致して、マウスを用いた以前の研究でも、タンパク質ワクチン接種計画がDNAワクチン抗原やベクターワクチン抗原と比較してより高い抗原特異的抗体レベルを誘導し、これらのグループの力価を効率的に高めることも示した(15)。

MOMP には、感染型 Ct の表面に露出した 4 つの VD が含まれています。これらの領域は、中和抗体と Fc 受容体媒介免疫の両方を介した、抗体依存性免疫の主な標的です (18)。 以前の研究では、ワクチン誘導性中和血清の養子移入により、C. trachomatis 感染後の初期の細菌排出が著しく減少することが示されています (6、11、19-21)。 したがって、抗体はおそらく細胞性免疫と協力して、最初の接種材料を中和/制御する役割を果たしていると考えられます。 詳細な B 細胞エピトープ マッピングにより、すべてのワクチン グループで VD 領域 1、3、4 が認識されることがわかりました。 DNA およびベクター グループは、VD1、3、および 4 領域も認識しました。 ただし、これらのグループは、CAF01 および AlOH グループと比較して、これらの VD 内でわずかに狭い認識を示しました。これは、おそらくベクター グループの Con E 抗原が SvF および G の VD4 領域を含まないことを反映しています (図 3)。 VD4 領域の認識は、SvD、SvE、および SvF に対する中和抗体を誘導するすべてのワクチン戦略の能力と相関していました。

CAF01のCTH522およびAlOHによる非経口免疫は、生殖管および眼に有意なレベルの粘膜抗体（IgG）を誘導し、そのレベルは血清力価と相関しました（補足図3、18週目）。 DNA およびベクター ワクチン単独では粘膜 IgG は誘導されず、これはタンパク質単独と比較して血清力価が低いことを反映しています。 しかし、CTH522/CAF01 IM ブースターの後、これらのグループでは血清 Ab が大幅に増加しました。 膣および眼の両方の IgG のレベルは、タンパク質単独の場合と同等です (補足図 3、18 週目)。 異なるプライミングアジュバントシステム（AlOHおよびCAF01）でのCTH522の並行評価とそれに続く抗原による2回の鼻腔内追加免疫では、粘膜抗体レベルに対するブースト効果はありませんでした（補足図3、22週目）。 したがって、全体的な血清 IgG レベルは、すべてのグループの粘膜に反映されます。 最近のヒト第 I 相試験では、AlOH と CAF01 における CTH522 の並行評価と、その後の 2 回の鼻腔内追加免疫も評価されました。 ここで、粘膜 IgG 力価も血清 IgG 濃度とよく相関していました (16)。 しかし、NHP モデルの結果とは対照的に、ヒト試験では CAF01 グループにおける IN 追加免疫の効果が示され、その結果 IgG と IgA の両方のレベルが上昇しました。 残念ながら、材料が限られていることと、アッセイで使用された交差反応する二次抗体から生じる偽陽性シグナルのため、現在の研究では IgA の評価はできませんでした。 どちらの研究でも、粘膜吸着のために鼻薬を霧化するように設計された VaxINator デバイスが使用されました。 しかし、ヒトの鼻腔はNHPよりもはるかに広く、これが均一な抗原分布と取り込みに影響を与える可能性があると推測できます。

ヒトとげっ歯類の両方を対象としたいくつかの研究で、Th1 T 細胞免疫とエフェクター サイトカイン IFN-g の重要性が実証されています (8、22-27)。 対照的に、CD8 T 細胞の保護的役割についてはあまり知られていません (28-33)。 すべてのワクチン グループが CD4 T 細胞を誘導しましたが、DNA グループとベクター グループのみが CD8 T 細胞応答を示しました (図 6 および 7)。 測定されたサイトカインに基づくと、CD8 T 細胞は CD4 T 細胞と比較して限られた数のサブセットで構成されており、6 つ以上のサブセットに分けることができ、そのほとんどがいくつかのサイトカインを産生していました (図 7)。 CD4 T 細胞は、CD8 T 細胞よりも多くの IL-2- 発現サブセットを示しましたが、主に IL-2- を発現するサブセットは 1 つだけ含まれており、そのサブセットは IFN-g および TNF-γ とともに IL-2 を発現していました。 a (図6)。 CD8 T 細胞は IFN-g のみを産生する大集団が優勢でしたが、他の優勢な CD8 T 細胞サブセットは IFN-g と TNF-α の両方を産生しました。 CD4 T 細胞と CD8 T 細胞の間のこのサイトカイン パターンは、CD4 T 細胞と CD8 T 細胞の両方を誘導できるワクチン戦略をテストする際にマウスで観察されたものと似ています (34)。

DNA ワクチン接種とそれに続く MOMP タンパク質の免疫刺激複合体 (ISCOM) による追加免疫を含む同様の戦略 (35) は、クラミジア ムリダルム肺感染に対する強力な防御を誘導しました。 その研究では、DNA MOMP (または MOMP/ISCOMS) が誘発する防御力は大幅に低下しました (35)。 別の研究では、サブユニットワクチンを使用せずにDNA MOMPプラスミドをマウスにワクチン接種した場合、生殖器クラミジア・トラコマチス感染を防御できなかったことが示され(36)、これはCD4 T細胞と抗体を誘導するサブユニットワクチンを補充することでDNA戦略が恩恵を受けることを示している。 DNA ワクチンはヒトの臨床試験で比較的低い免疫原性プロファイルを示しており、これは将来の研究で対処する必要がある可能性があることに注意する必要があります (37)。

この研究で使用された Ct 感染線量は、ヒトの自然感染で経験される線量よりも高いですが、すべての動物が確実に感染するように選択されました。これは、各グループの動物の数が少ないことを考慮すると重要です。 この用量は、106～108の範囲であった以前の研究で使用された用量と一致しています(38、39)。 私たちのモデルで用量を下げると、感染症の罹患に関する変動が増加しました（データは示されていません）。 より低用量の繰り返し投与も使用されています(40、41)。 ただし、ワクチンの防御効率をテストすることが目的の場合、特に感染プロトコルが完了する前に自然免疫が防御を媒介している場合、これは最適なプロトコルではありません。 高用量を使用すると、細菌の感染を減らすために、抗原特異的 CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、中和抗体などの免疫系のすべての部門を含む免疫応答が必要になる可能性があると推測できます。レベル。 これは、すべてのグループで誘導された中和抗体がすべてのグループで有意な防御につながらなかった理由も説明します（ただし、ほとんどのグループで早期に防御する傾向が見られ、抗体が役割を果たしていると考えられています（図 7）） 。 私たちは現在、より物理的に適切なモデルの開発を試みています。

総合すると、我々のデータは、アジュバント CAF01 または AlOH に配合された CTH522 抗原が、NHP において多機能性 T 細胞と中和抗体の両方を誘導できることを示しました。 さらに、我々の結果は、DNA ワクチンと CTH522/CAF01 サブユニット ワクチンからなる異種ワクチン戦略が、高レベルの中和抗体と強力な CD4 および CD8 T 細胞応答を組み合わせた多面的な免疫応答の誘導にとって有望なワクチン戦略であることを示唆しました。 C. trachomatis 感染の排除を大幅に加速する可能性があります。

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