アルキルラジカル生成の強化と強力な抗腫瘍療法のためのナノザイムヒドロゲル†

アルキルラジカル (Rc）、原因として酸素の生成に依存しません。細胞ストレスに適用されています。腫瘍治療しかし、腫瘍細胞内の大量のグルタチオン (GSH) がアルキルラジカルと反応し、それによって抗腫瘍効果を低下させる。 この研究では、近赤外線設計された。 アルキルラジカルトリガー 2,20 -アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]-二塩酸塩 (AIPH) と酵素黄鉄鉱 (FeS2) をアガロース ハイドロゲルにカプセル化し、AIPH を調製しました。–FeS2–ハイドロゲル（AFH）システム。 FeS2 は、近赤外線光エネルギーを熱エネルギーに変換し、ヒドロゲルの溶解を引き起こす光熱剤として使用できます。 AIPH は同時にアルキルラジカルの生成を誘導します。 FeS2 は、酸化ストレス増幅器細胞内のGSH含有量を減らし、それによってアルキルラジカルの治療効果を高めます。 最終的に、近赤外レーザー照射と光熱処理下で AFH システムによって生成される酸素非依存性フリーラジカルは、がん細胞を殺す相乗効果を通じて酸化/光熱効果。 本明細書で開発されたＡＦＨシステムは、アルキルラジカルの治療効果を高めるための新たな洞察を提供する。

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序章

近年、光線力学療法などのフリーラジカルに基づく治療法、非力学療法、および電気力学療法が乳がんの治療における一般的な選択肢となっています 1-3 外部刺激 (レーザー、超音波、電場) により、乳がんの生成が促進されます。重度の酸化損傷や細胞代謝機能障害を引き起こすことで細胞死を誘導する活性酸素種（ROS）の存在です4-6。残念ながら、低酸素腫瘍環境と急速な腫瘍細胞増殖により、特に腫瘍の場合、ROS産生に依存する治療の治療成績が低下します。アルキルラジカルは、細胞を殺すために酸素の発生に依存しない新しいタイプのフリーラジカルであり、正常酸素環境および低酸素環境での腫瘍の治療に効果的であることが示されています。11ラジカルは酸化ストレスを増加させることによってがん細胞のアポトーシスを誘導し、細胞の脂質や DNA の損傷を引き起こす可能性があります。 典型的なフリーラジカル開始剤として、2,20 -アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]-二塩酸塩 (AIPH) は高温でアルキルラジカルを生成します。 12 酸素が存在しない場合でも同様です。 生成されたフリーラジカルは細胞に対して有毒であり、すぐに細胞要素を酸化するか、酸素と相互作用して二次的な有毒物質を生成します13。低酸素の腫瘍微小環境においても、AIPHはアルキルラジカルを生成して細胞内脂質ヒドロペルオキシドを増加させ、さらに腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります14。これらすべては、Rc が有望な癌治療薬であることを示しています。

光熱療法では、光または熱が外部刺激として使用されます 15-17。近赤外線 (NIR) レーザー照射に基づく光熱療法 (PTT) は、腫瘍細胞の凝集を防ぐために使用されてきました。 局所的な熱効果に依存して腫瘍を除去します18-20。金ナノ結晶や二硫化モリブデンなどのいくつかの光熱剤（PTA）は、AIPHと組み合わせて使用​​され、赤外線レーザー照射に反応してアルキルラジカルを放出します19、21-23。固形腫瘍では通常、腫瘍微小環境（TME）で高レベルのグルタチオン（GSH）発現が見られます。これは、GSH が自発的反応または異種物質との GSH S トランスフェラーゼ触媒反応を通じて放射線療法に抵抗する上で重要な役割を果たしているためです。 GSH は還元剤としてアルキルラジカルを直接除去できます 21,26。これにより、アルキルラジカルに基づく治療の有効性が低下します。 黄鉄鉱 (FeS2) ナノ酵素は、新規な光熱ナノ材料であり、NIR 光下で優れた光熱効果を発揮するだけでなく、ナノ酵素活性も備えています 27。FeS2 ナナーゼは、グルタチオン オキシダーゼ (GSH OXD) と同様の活性を示し、酸化します。 GSH から酸化型グルタチオン (GSSG) への変換。28 TME では、GSH の欠乏が細胞の REDOX バランスを崩し、酸化ストレスを引き起こすことが判明しました。29 したがって、FeS2 は AIPH と良好な相乗効果を達成すると期待されています。

低侵襲性の光応答性ヒドロゲルは、薬物放出制御プラットフォームとして最近人気が高まっています 30-32。ヒドロゲルは腫瘍組織に注入されると凝固し、長期の貯蔵庫として機能します 33。注射。 さらに、レーザー出力や照射時間などのパラメーターを変更して薬物放出速度を変更できるため、この治療法の適用可能性が広がります 34,35。これらの利点を考慮すると、FeS2 の送達にヒドロゲルの使用が有効であるという仮説が立てられました。そして AIPH を TME に提供することで、フリーラジカルに基づく治療の有効性が向上するでしょう。

この研究では、FeS2 酵素とフリーラジカル開始剤 AIPH を含む注射可能なヒドロゲルの腫瘍内送達を使用する方法が設計されました。 まず、FeS2ナノ粒子とAIPHをアガロースヒドロゲルに充填することにより、AIPH-FeS2-ヒドロゲル(AFH)のハイブリッドシステムを調製した。 このヒドロゲルは室温では固体であり、FeS2 と AIPH はそのマトリックス内にカプセル化されています。 近赤外 (NIR) 光が照射されると、FeS2 は NIR 光エネルギーを熱エネルギーに変換し、これにより AFH システムが加熱され、ヒドロゲルが溶けて FeS2 と AIPH が放出されます。 高温では、AIPH が分解してアルキルラジカルを生成します。 続いて、GSH-OXD の活性を模倣する FeS2 酵素が細胞内の GSH 含有量を減少させます。 GSH の破壊により、アルキルラジカルの殺傷効果が促進されます。 AFH は腫瘍部位に長期間存在する可能性があるため、AFH システムではレーザー強度と照射時間を変更することでアルキルラジカルの放出を正確に制御できます。 最後に、NIR 照射および光熱治療下で AFH システムによって生成される酸素非依存性フリーラジカルは、酸化/光熱の相乗効果によって相乗的にがん細胞を死滅させることができ、治療サイクル中の腫瘍の増殖は良好に行われます。 つまり、本明細書で設計されたAFHシステムは、酸化還元ホメオスタシスを変化させることによってAIPHの治療効果をさらに増幅させる(スキーム1)。

結果と考察

低融点アガロースヒドロゲルを使用して、FeS2 と AIPH を含む複合ヒドロゲルを調製しました。 FeS2を60℃でアガロース水溶液と混合し、次にアルキルラジカルトリガーAIPHを負荷し、続いて室温まで急速に冷却した。 このようにして、ＡＦＨヒドロゲルマトリックスが形成された。 透過型電子顕微鏡法を使用して、FeS2 の形態を特徴付けました (図 1A)。 FeS2 ナノザイムは、平均粒径約 148 nm の球状の形態を示しました (図 S1†)。 FeS2 の紫外可視吸収スペクトル (図 1B) は、FeS2 が 808 nm の NIR 範囲で強く吸収されることを示しました。 この特性により、FeS2 は優れた PTA になります。 さまざまな濃度（0、25、50、および100 mg mL-1）でのFeS2酵素の光熱性能を、0.5 W cm 2 808 nmレーザーシステムで溶液を照射することによって研究しました（図1C）。 溶液の加熱効果は、FeS2 濃度に正比例しました。 100 mg mL 1 の FeS2 溶液の温度は、わずか 5 分間のレーザー照射で約 17.5 ℃ 上昇し、FeS2 の光熱性能が良好であることが実証されました。 走査型電子顕微鏡検査では、AFH ハイドロゲルが細孔構造と細孔サイズ分布の複雑なネットワークを有しており (図 1D)、このためハイドロゲルが薬物送達のための薬物充填に適していることが示されました。 光熱安定性も、PTA の品質を評価するための重要な基準です。36 200 mg mL 1 FeS2 溶液を 808 nm NIR レーザーで 5 分間加熱し、その後レーザーをオフにして、FeS2 溶液を冷却しました。自然に室温に戻します。 このプロセスを数回繰り返して、FeS2 の光熱安定性を評価しました (図 1E)。 各光熱サイクルの加熱曲線には明らかな変化はなく、5 分間の照射後に達成されるピーク温度にはわずかな差のみが観察され、FeS2 の光熱安定性が実証されました。 レオロジー分析により、室温で固体状態で調製されたヒドロゲルの高い貯蔵弾性率も明らかになりました（図1F）。 温度が上昇するにつれて、ヒドロゲルは徐々に上昇して溶解し、貯蔵弾性率は徐々に減少しました。 次に、FeS2 ハイドロゲルの光熱溶解実験を行いました。 固化したＡＦＨ（ヒドロゲル中に含まれるＦｅＳ２）を、脱イオン水を含むガラス皿に置いた。 室温では、調製したAFHヒドロゲルは固化した形状を維持していましたが、808 nmレーザーで10分間照射した後、ヒドロゲルはほぼ完全に溶解し、FeS2ナノ材料が放出されてガラス皿内の水に溶解しました（図） .1G）。 熱赤外線画像装置でも、照射中に AFH の温度が大幅に上昇することが確認されました (図 1H)。 ヒドロゲルとの反応後のFeS2のX線光電子分光法（XPS）スペクトルは、FeS2にFeおよびS元素が含まれていることを示しました（図S2†）。 図S3に示すように、† GSH含有量は、FeS2とGSHの共インキュベーション後に大幅に減少し、時間および濃度と正の相関曲線を示しています。 さらに、FeS2 の POD 様活性はサイズに依存していました。 サイズ 150 nm のナノザイムは、サイズ 280 および 687 nm のナノザイムよりも高い活性を示しました (図 S4†)。

AFH の高性能特性に基づいて、その抗腫瘍効果が評価されました。 最初に、二酢酸フルオレセイン/ヨウ化プロピジウム生細胞/死細胞染色キットを使用して、NIR 照射と組み合わせた調製された AFH ハイドロゲルの殺傷効果を調査しました。 PBS と NIR グループおよび AFH のみのグループは強い緑色蛍光を示しましたが、AIPH はほとんど殺傷効果を示さなかった (図 2A)。 相対的な実験結果を検証するために、FeS2 (FH) のみを含むハイドロゲルを調製しました。 FeS2 (FH) のみを含み、NIR と組み合わせて調製されたヒドロゲルは、中程度の殺傷効果を示しました。 注目すべきことに、AFHとNIR処理は最高の細胞毒性効果を示しました。

ジクロロフルオレセインジアセテートプローブを使用して、AIPH が ROS を産生する能力を検出しました。 AIPHはレーザー照射がない場合にはROSを誘導する能力が弱いことを示しましたが、FeS2を負荷したFHはNIR照射後に中程度のROS生成を示しました（図2B）。 AFH + NIR 治療グループで観察された明るい緑色の蛍光は、レーザー照射後の FeS2 と AIPH の放出に起因すると考えられます (図 2C)。 さらに、AIPH および AIPH と NIR のグループは、緑色蛍光をほとんど示さなかった (図 S5†)。 CCK-8 アッセイでも同じ結果が示されました。 AFH と NIR を併用したグループの細胞生存率は約 8.5% であり、他のグループの細胞生存率とは大きく異なりました (図 2D)。 高温により AIPH の分解が促進され、アルキルラジカルが生成されます。 同時に、FeS2 は GSH-OXD 活性を発揮して細胞内の GSH を減少させることができます。 GSH は遍在するチオール含有トリペプチドであり、多くの細胞内で構成アミノ酸 (グルタミン酸、システイン、グリシン) から合成されます。 GSHはさまざまな種類のがん細胞で豊富に産生されます。 細胞内の GSH は一般に還元型で存在し、酸化型グルタチオン ジスルフィド (GSSG) に酸化される間にアルキル基などの酸化性物質と反応する可能性があり、それによってフリーラジカルに基づく抗腫瘍効果が減少します。37 GSH の枯渇細胞の酸化還元バランスを崩し、酸化ストレスを引き起こし、最終的には細胞のアポトーシスを引き起こします38。各グループのGSH枯渇能力を試験するためにエルマン試薬が使用されました。 AFHとNIRを組み合わせたグループは、最高のGSH枯渇能力を示しました（図2E）。

スキーム 1 アルキルラジカル生成の強化と強力な抗腫瘍療法のためのナノザイムヒドロゲル

図1 (A) FeS2のTEM像。 (B) FeS2 溶液の UV-Vis-NIR 吸光度スペクトル。 (C) 808 nm (0.5 W cm 2 )で5分間レーザー照射したときの、異なる濃度のFeS2ナノ粒子溶液の加熱曲線。 (D) ハイドロゲルの SEM 画像。 (E) 周期的レーザー照射下での FeS2 溶液の温度変化。 (F) 0.5 W cm 2 808 nm レーザー照射に応答した、調製された AFH のレオロジー曲線と温度曲線 (それぞれ赤と黒)。 (G) 10 分間の 0.5 W cm 2 808 nm レーザー照射の前後の調製された AFH の形態、および (H) 照射後の調製された AFH の赤外線熱画像。

PTA および GSH OXD 模倣酵素としての優れた in vitro 性能を考慮して、NIR の光から熱への変換に対する AFH の効果を in vivo で研究しました。 BALB/c マウスに 4T1 細胞を皮下注射して腫瘍を形成させました。 図３Ａは、８｛｝｝８ｎｍのＮＩＲレーザー０．５Ｗｃｍ２を１０分間照射した後のＰＢＳ群とＡＦＨ群の温度変化曲線を示す。 AFH 群の温度は照射後に約 17.6℃上昇しましたが、PBS 群の温度はほとんど上昇しませんでした。 高温により腫瘍細胞膜の湿度が変化し、それによって細胞膜の透過性が増加し、タンパク質に熱損傷が引き起こされます 39,40。最終的には、がん細胞は増殖能力を失います。 次に、AFH 媒介抗腫瘍活性を 4T1 腫瘍担持マウスで評価しました。 腫瘍担持マウスをランダムに 5 つのグループに分けました。 ＰＢＳ＋ＮＩＲ群およびＡＩＰＨ群のマウスの腫瘍体積は、２週間の治療期間中に急速に増加し、ＡＦＨ群はわずかな腫瘍抑制効果を示した（図３Ｃ）。 これは、アガロースがゆっくりと代謝され、一部の薬物がゆっくりと放出されるためです。 AFH と NIR のグループは、腫瘍の増殖に対して最も強い効果を示しました。 治療中、マウスの腫瘍体積は大幅に抑制されました。 治療期間後、マウスを屠殺し、腫瘍を分離して重量を測定した。 腫瘍重量の結果は腫瘍体積の結果と一致しました (図 3D)。

重要なことに、研究全体を通じて、治療グループでは体重の変化は観察されませんでした。これは、治療がマウスに重大な全身毒性を引き起こさなかったことを示しています（図S6†）。 多くの材料が良好な実験結果を示しているにもかかわらず、臨床的見通しを大きく妨げる重大な副作用も引き起こしているため、この結果は非常に心強いものです。41、42 20、70 - ジクロロオレシン二酢酸塩は、体内の- 治療マウスにおける腫瘍 ROS の生成。 AFH と NIR の併用療法を受けた腫瘍では、染色が著しく増強されました (図 3E)。 フリーラジカル生成の増強により、動物モデルにおける治療効果の増強がもたらされました。 TUNEL および Ki-67 染色分析を使用して、細胞のアポトーシスと増殖を検証しました (図 3E)。 AFH と NIR を併用したグループの腫瘍組織は、顕著な増殖はなく大量に壊死していました。

図 3 (A) 表示された治療グループにおける 808 nm レーザー (0.5 W cm 2 ) で 10 分間照射した後の腫瘍の赤外線熱画像。 (B) 示された治療群における 808 nm レーザー照射 (0.5 W cm 2 ) 後の 4T1 腫瘍を移植されたマウスの体温上昇。 (C) 示されたとおりに治療されたグループにおける腫瘍体積の時間の経過に伴う変化。 (D) 示された治療に関連する平均腫瘍重量値。 (E) 示された治療グループからの ROS、Ki-67、および TUNEL で染色された腫瘍切片。 **P < 0.01、***P < 0.005; 学生の t 検定。

治療後、重要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）には炎症や損傷はありませんでした。 肝臓と腎臓の指数は正常でした (図 4A ～ D および S7†)。 包括的な in vivo 実験データは、AFH と PTT の相乗療法が優れた治療効果と生体適合性を有することを示しています。 将来的には臨床医療への応用が期待されています。

図4 in vivoでの安全性実験の結果。 腎機能マーカーを含む血液生化学データ: (A) 肝機能マーカー: CRE、(B) BUN、および (C) さまざまな治療後の ALT。 (D) 注射後 16 日目にさまざまな治療を受けたマウスの主要臓器、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓の組織病理学的分析結果 (H&E 染色画像)。 スケールバー: 100 mm。

結論

酵素FeS2とアルキルラジカル源AIPHをアガロースハイドロゲルに封入することで、フリーラジカル療法とPTTを同時に実現できる注射可能な光応答性ハイドロゲルを設計しました。 808 nm レーザー照射下では、PTA FeS2 が AFH システムの加熱を促進し、AIPH の放出とその分解によるアルキル ラジカルの生成を引き起こします。 同時に、FeS2 は細胞内の GSH 含有量を減少させ、それによって酸化還元ホメオスタシスをさらに破壊する可能性があります。 ハイドロゲルの溶解速度は、レーザー出力密度やスポット サイズなどのパラメーターによって変更できます。 in vivo と in vitro の両方の研究で、AFH と NIR 照射の組み合わせが、わずかな副作用で強力な腫瘍殺傷効果を達成できることが示されています。 この研究で設計されたヒドロゲル システムは、アルキル ラジカルに基づく治療システムを強化する戦略を提供します。

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