Nrf2/ARE経路を介したPC12細胞のH2O2-誘導アポトーシスに対する4つのフェニルエタノイド配糖体の神経保護効果
Mar 04, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Maiquan Li 1、Tao Xu 1、Fei Zhou 1、Mengmeng Wang 1、Huaxin Song 1、Xing Xiao、Baiyi Lu 1、*
1.はじめに
抗酸化ホメオスタシスの不均衡である酸化ストレスは、脂質過酸化、タンパク質とDNAの損傷、細胞の老化、および細胞死を誘発します。 このプロセスは、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、虚血/再灌流などのいくつかの神経変性疾患の一因となる可能性があります[1]。 主要な活性酸素種（ROS）の1つである過酸化水素（H2O2）は、脂質過酸化とDNA損傷を引き起こすことが知られています[2]。 さらに、H2O2は、細胞の酸化ストレスのバックグラウンドレベルに寄与するヒドロキシルフリーラジカルの内因性源です[3,4]。 したがって、酸化ストレス誘発性アポトーシスを予防するための治療戦略は、神経変性疾患の治療に可能性を秘めている可能性があります。
核因子赤血球2-関連因子2（Nrf2）は、酸化ストレスと強く関連している転写因子です。 Nrf2の活性化は、ヘムオキシゲナーゼ-1（HO -1）、NAD（P）Hキノンオキシドレダクターゼ1、抗炎症[13]、免疫調節[14]など、多数の抗酸化および解毒遺伝子の転写を誘導します。 ]生物活性。 Osmanthusfragransはいくつかのアジアの食品の一般的な成分であり、長い間消費されてきました。 我々は以前、O.fragrans花抽出物が空間学習と記憶を強化し、酸化的損傷を抑制し、ICRマウスモデルのd-ガラクトース誘発性老化において神経保護活性を示すことを示しました[15]。 サリドロシド、アクテオシド、およびイソアクテオシドは、O.fragrans花抽出物の抗酸化活性に対する主要なPhG応答です[16]。
PhGの神経保護効果に関する研究は望ましい結果を得ています。 サリドロシドは、MPPプラスに曝露されたPC12細胞の細胞アポトーシスを有意に減少させました[17,18]。 アクテオシドはまた、PC12細胞におけるMPPプラス誘導アポトーシスおよび酸化ストレス[19]およびAp25-35-誘導SH-SY5Y細胞損傷[20]を軽減しました。 エキナコシドは、SH-SY5Y細胞における腫瘍壊死因子-α（TNFa）誘発性アポトーシス[21]、マウスにおけるMPTP誘発性ドーパミン作動性毒性[22]、ラット皮質細胞のグルタミン酸損傷初代培養[23]、および{ {19}}PC12細胞におけるOHDA誘発性損傷[24]。 結果は、PhGが細胞保護効果を示し、神経変性疾患を治療するための潜在的な薬剤であることを示した。 研究によると、PhGの抗酸化特性は、これらの化合物に対する他の多くの生物活性の根底にあります[25]。 ただし、酸化毒性に対するPhGの分子メカニズムを調査した研究はほとんどありません。
私たちの研究では、次の4つの典型的なPhGを選択しました：サリドロシド（フェニルエタノイド単糖）、アクテオシド（フェニルエタノイド二糖）、イソアクテオシド（フェニルエタノイド二糖）、およびエキナコシド（フェニルエタノイド三糖）。 分化したPC12細胞を使用した神経細胞死のモデル[26]を使用して、H2O2-誘導PC12細胞モデルに対するPhGの保護効果と分子メカニズムを調査しました。 PhGがケルチ様ECH関連タンパク質1（Keap1）に結合することにより、Nrf2/ARE経路を活性化することを実証しました。 このプロセスは、抗酸化酵素をアップレギュレーションし、酸化ストレスに対するPC12細胞の耐性を高めました。
神経変性疾患の治療：ホンオニクからのPhG
2.結果
2.1。 PhGはPC12細胞でH2O2-誘導細胞毒性を抑制しました
PC12細胞に対するH2O2およびPhG（0 .1,1,5、および10卩g/ mL）の細胞毒性効果をテストしました。 結果は、H2O2が濃度依存的および時間依存的にPC12細胞の生存能力の喪失を誘発したことを示しました（図1A）。 PC12細胞を200 H2O2に2時間曝露すると、細胞生存率は57.4％になりました。 0。1、1、5、および10昭/ mLのPhGで細胞を前処理しても、細胞の生存率に影響はなく（図1B）、PC12細胞をH2O2-による損傷から著しく保護しました。細胞生存率は、それぞれ9。549-22。141パーセント、12。092-25。289パーセント、1。470-9。289パーセント、3。411-11。441パーセントです（図1C）。 ただし、サリドロシド（0.1 ^ g / mL）、イソアクテオシド（0.1、1、5、および10 ^ g / mL）、エキナコシド（0.1、1、および5 ^ g / mL）の前処理では、HzOz誘導細胞に有意差は見られませんでした。けが。 細胞をPhGで前処理すると、H2O2によって誘発される形態学的特徴も改善されました（図1D）。
図1。PhGは、PC12細胞におけるH2O2-誘発細胞毒性を抑制しました。 細胞生存率はMTTアッセイによって検出されました。 PC12細胞に対する異なる濃度のH2O2（A）およびPhG（B）の細胞毒性効果。 （C）PhGは、H2O2-による細胞生存率の低下を抑制しました。 PC12細胞をPhG（0。1、および1 0 mg / mL）と24時間インキュベートした後、2 0 0pMH2O2とさらに2時間インキュベートしました。 PhGが除去されてからh。 （D）形態学的観察。 治療後の細胞を位相差顕微鏡（×100）で観察した。CK：正常群、H2O2：H2O2治療群、HL：サリドロシド低用量治療群、HH：サリドロシド高用量治療群、ML：アクテオシド低用量治療群、 MH：アクテオシド高用量治療群、IL：イソアクテオシド低用量治療群、IH：イソアクテオシド高用量治療群、SL：エキナコシド低用量治療群、SH：エキナコシド高用量治療群。 **未処理グループに対してp<0.01; ＃p=""><0.05、対h2o2処理グループ; ##="" p=""><>
2.2。 PhGはH2Oを抑制しました2-PC12細胞におけるROSの細胞内蓄積、脂質過酸化（MDA）、およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性の増加
PC12細胞を200 pM H2O2に2時間曝露すると、ROSレベル、MDA含有量が増加し、SOD活性が低下しました（図2）。 PhGs前処理は、ROSレベル、サリドロシド、およびアクテオシドを減衰させ、イソアクテオシドおよびエキナコシド前処理の高用量は、ROSレベルを大幅に減衰させました（p <0.01）。 サリドロシド前処理はmda含有量に影響を与えませんでしたが、アクテオシド前処理はmda含有量を大幅に減衰させました（p=""><0.05）。>
図2。PhGはROSとMDAの蓄積をブロックし、PC12細胞のSODの活性を高めました。 PC12細胞をPhG（0 .1、および10 4 g / mL）と24時間インキュベートした後、2 0 0|^MH2O2とさらにインキュベートしました。 PhGが除去されてから2時間後。 （A）PhGはROSとMDAの蓄積をブロックしました。 （B）PhGはMDAの蓄積をブロックしました。 （C）PhGはSODの活動を増加させました。 CK：正常群、モデル：H2O2治療群、サリドロシド：サリドロシド治療群、アクテオシド：アクテオシド治療群、イソアクテオシド：イソアクテオシド治療群、エキナコシド：エキナコシド治療群。 **p<0。01対未処理グループ; ＃p=""><0.05、対h2o2処理グループ、## p=""><>
2.3.PhGsはPC12細胞でH2O2-誘導アポトーシスを逆転させた
2時間のH2O2処理（2 0 0|1M）は、PC12細胞のアポトーシスを有意に増加させ、総アポトーシス率は最大16.02パーセントでした（図3）。 ただし、PhG（0.1および10卩g / mL）で24時間前処理すると、濃度依存的にアポトーシス率が低下しました（p <0.01）。>
図3。 PhGは、PC12細胞のH2O2-誘導アポトーシスを逆転させました。 PC12細胞をPhG（0。1、および10卩g/ mL）と24時間インキュベートし、次に2 0 0pMH2O2とさらに2時間インキュベートしました。 PhGは削除されました。 次に、PI/FITC蛍光プローブを使用したフローサイトメトリーによってアポトーシスを測定しました。 CK：正常群、モデル：H2O2治療群、サリドロシド：サリドロシド治療群、アクテオシド：アクテオシド治療群、イソアクテオシド：イソアクテオシド治療群、エキナコシド：エキナコシド治療群。 **未処理グループに対してp<0.01; ##="" p=""><>
2.4。 PhGはH2Oを逆転させた2-HO-1、NQO1、GCLC、およびGCLMのタンパク質発現のダウンレギュレーションを誘発
HO {{0}}、NQO1、およびグルタミン酸-システインリガーゼ（GCL）は重要な細胞抗酸化酵素であり、HO -1、NQO1、およびGCLの触媒または修飾サブユニット（GCLCまたはGCLM）はNrf2-は下流の遺伝子を調節しました[27]。 HO -1、NQO1、GCLC、およびGCLMのタンパク質発現が処理後に観察されました。 H2O2の有無にかかわらずHO-1とNQO1のタンパク質発現の間に明らかな違いが見つかりました（図6A-C）（p<0。01）。 phg（0。1および1="" 0="" p="" ^="" g="" ml）は、h2o2-によるho-1のタンパク質発現のダウンレギュレーションを逆転させました（{{32}のサリドロシドを除く）="" }="" .1="" pg="" ml）、nqo1（0。1="" pg="" mlのアクテオシドを除く）（p=""><{{40}}。01）。><0。05）（図6a、d、e）。 phg（0。1および1="" 0="" pg="" ml）は、gclc（0.1="" pg="" mlのエキナコシドを除く）（p=""><0.01）およびgclmのタンパク質発現のh2o2-誘発性ダウンレギュレーションを逆転させました。 （0.1="" pg="" mlのサリドロシドを除く）（p=""><0.01）。 次に、ho="" -1の化学的阻害剤を使用して、h2o2-によって誘発される細胞毒性に対するphgの保護を調節する抗酸化酵素の役割をさらに評価しました。="" phg（0.1および10="" pg="" ml）は、h2o="" 2-による細胞毒性を防止しましたが、このような保護効果は、20pmのho-1阻害剤znpp（p=""><0.01）によって逆転しました（図6f、p><0.01）>
2.5。 Keap1の発現と分子ドッキング分析
生理学的条件下で、Keap1はNrf2のNeh2ドメインに結合し、Nrf2をCul 3-ベースのE3ユビキチンリガーゼにターゲティングしてユビキチン化とそれに続く26Sプロテアソームによる分解を行うことにより、Nrf2のリプレッサータンパク質として機能します[28]。 PhGのKeap1への結合能力は、分子ドッキング分析によって評価され、抗酸化作用下のメカニズムを調査しました。
抗酸化作用：CistanchePhG
3.ディスカッション
PC12細胞におけるH2O2誘導細胞毒性に対するPhGの神経保護を調査しました。 結果は、PhGs前処理がHzOz誘発細胞毒性を有意に抑制し、細胞内ROSレベルを減衰させ、細胞内抗酸化酵素のレベルを改善し、最終的にPC12細胞におけるH2O2-誘発細胞毒性を逆転させたことを示しています。 さらに、PhGはNrf2の転写活性化を増加させ、HO -1、NQO1、GCLC、およびGCLMのタンパク質発現のHzOzによるダウンレギュレーションを逆転させました。 さらに、PhGはKeap1タンパク質のNrf2結合部位との潜在的な相互作用を示しました。
H2O 2-によって誘発されるPC12細胞傷害では、脂質の酸化分解を指す脂質過酸化が膜の透過性を高め、細胞の損傷を引き起こしました[29]。 MDA形成は脂質過酸化の指標として広く使用されています[30]。 H2O2は、ROS生成を強化し、SOD、カタラーゼ、GPxなどの抗酸化防御酵素を使い果たしました。 このプロセスは酸化ストレスにつながり[31]、これは神経変性疾患の大部分の原因と進行に重要な役割を果たします。 以前の研究と一致して、H2O2処理後、ROSのレベルの上昇、細胞内抗酸化酵素の減少、PC12細胞のアポトーシスの増強が観察されました。 PhGsの前処理は、細胞内ROSのHzOz誘発性の増加を大幅に減衰させ、細胞内抗酸化酵素を改善し、最終的にPC12細胞におけるHzOz誘発性の細胞毒性を逆転させました。
Kuangetal。 [32]は、エキナコシドがミトコンドリアのアポトーシス経路を介してPC12細胞のH2O2-誘導細胞毒性に対して有意な神経保護効果を示したことを報告しました。 この研究では、エキナコシド、サリドロシド、アクテオシド、およびイソアクテオシドが、Nrf2の転写活性化を増加させ、HO -1、NQO1の下流タンパク質発現をアップレギュレートしたため、PC12細胞の抗酸化活性を増強することによって神経保護効果を示すことを発見しました。 GCLC、およびGCLM。 多くの研究は、星状細胞とニューロンにおけるNrf2標的遺伝子、特にHO -1の活性化が、炎症、酸化的損傷、および細胞死から強力に保護することを明確に示しています。 HO -1システムは中枢神経系で非常に活発であると報告されており、その調節は明らかに神経変性疾患の病因において重要な役割を果たしています[33]。 最近の研究では、PDの進行とリスクにおけるNrf2の役割[9]と、ADにおけるNrf2の再活性化の効率的な標的としてのKeap1[34]も明らかにされています。 結果は、神経変性疾患の治療標的としてのNrf2の新しい証拠を裏付けています。
分子ドッキング分析は、PhGが次の結合能力でKeap1に結合できることを示しました：エキナコシド>イソアクテオシド>アクテオシド>サリドロシド。 これらの結果と一致して、PhGsの前処理は、核内で次のNrf2発現を伴う、Nrf2核転座をもたらしました：エキナコシド>イソアクテオシド*アクテオシド>サリドロシド。 配糖体の数がPhGとKeap1の可能な結合モードに影響を与え、結合モードがさらにKeap1からのNrf2の放出を引き起こしたと仮定しました。 このプロセスにより、Nrf2と下流の遺伝子が活性化され、最終的にPC12細胞がH2O2 -によって誘発される酸化ストレスから保護されます。
ホンオニクの神経保護効果PhG
4.材料と方法
4.1。 化合物および試薬
サリドロシド（CAS番号{{0}}）、アクテオシド（CAS番号61276-17-3）、イソアクテオシド（CAS番号61303-13-7）、およびエキナコシド（CAS番号{{3} }）YYuanye Biotechnology Company（上海、中国）から購入しました。 PhGをPBSに溶解して10mg/ mLのストック溶液を生成し、-20度で保存しました。 H2O2はAladdin®（上海、中国）から購入しました。 RPMI -1640培地およびウシ胎児血清は、Hyclone（Logan、UT、USA）から購入し、0.5％トリプシンEDTA、ペニシリン、およびストレプトマイシンはKeyi（Hangzhou、China）から購入しました。 MDA、SOD診断キット、MTT、およびDCFH-DAは、Beyotime Institute of Biotechnology（Nanjing、Jiangsu、China）から購入しました。 アネキシンV-FITC/PI二重染色キットは、Solarbio Life Sciences（北京、中国）から購入しました。 Nrf2、Histone H3、Keap1、HO -1、NQO1、GCLC、GCLM、およびp-アクチンに対する抗体、抗マウス西洋ワサビペルオキシド（HRP）IgG、および抗ウサギHRP-IgGはAbcamから購入しました。 （ロンドン、英国）。 HO -1およびZnPPの阻害剤は、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 RNAiso Plus、gDNA消しゴムを備えたPrimeScript™RT試薬キット、およびSYBR®PremixExTaq™IIは、Takara（滋賀、日本）から購入しました。 Lipofectamine®RNAiMAXトランスフェクション試薬はThermoFisherScientific（Waltham、UK）から購入しました。 Nrf2 siRNA配列は次のとおりです。フォワード、CCGAAUUACAGUGUCUUAA; 逆に、UUAAGACACUGUAAUUCGG。 一方、対照siRNA配列は以下の通りであった：フォワード、UUCUCCGAACGUGUCACGU; 逆に、ACGUGACACGUUCGGAGAA。
4.2。 細胞培養
マウス副腎褐色細胞腫株（PC12細胞）は、生化学および細胞生物学研究所、SIBS（CAS、上海、中国）から入手しました。 細胞は、1 0パーセントのウシ胎児血清（Hyclone）、100 U / mLのペニシリン、および0.1 mg / mLのストレプトマイシンを含むRPMI-1640（Hyclone）で、37度で5％のCO2で維持されました。 培地は一日おきに交換されました。
4.3。 Cell ViabilityAssay
PC12細胞を96-ウェルプレートに2x104細胞/ウェルで播種しました。 付着後、細胞を阻害剤の有無にかかわらず20分間プレインキュベートし、PhGの有無にかかわらず24時間インキュベートし、PhGを除去した後さらに2時間H2O2とインキュベートしました。 インキュベーション後、細胞を5 mg / mL MTTで37度で4時間処理し、培地を注意深く除去しました。 生き残った細胞によって形成されたホルマザン結晶を150rLのDMSOに溶解して青色を生成し[35]、プレートリーダーで570nmの吸光度を測定しました。 対照は、DMSOのみを含む同じ濃度の培地を利用した。 細胞生存率は、コントロールのパーセンテージとして正規化されました。
PhGの濃度（0 .1,1,5、および10 Rg / mL）は、PhGの細胞毒性分析および報告されているエキナコシドの細胞保護効果に応じて選択されました[32]。 報告によると、10 Rg / mL未満で示される細胞毒性効果はなく、エキナコシドはHzOz損傷細胞モデルで細胞保護効果を示すことが報告されました。
4.4。 アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、アネキシンV-FITC / PI二重染色キット（Solarbio）で検出されました。 PC12細胞を6-ウェルプレートに2x105細胞/ウェルで播種しました。 付着後、細胞をPhG（0.1および10 Rg / mL）で24時間処理し、PhGを除去した後、H2O2でさらに2時間インキュベートしました。 インキュベーション後、細胞を冷PBSで洗浄し、1500 rpmで10分間2回遠心分離し、500rLの結合バッファーに再懸濁しました。 FITC標識アネキシンV（5 rL）およびヨウ化プロピジウム。
略語
GCLCグルタミン酸-システインリガーゼ-触媒サブユニット
GCLMグルタミン酸-システインリガーゼ-触媒修飾サブユニット
H2O2過酸化水素
HO-1ヘムオキシゲナーゼ1
Keap1ケルチECH関連タンパク質1
NQO1 NAD（P）Hキノンオキシドレダクターゼ1
Nrf2核因子赤血球2-関連因子2
PhGsサリドロシド、アクテオシド、イソアクテオシド、およびエキナコシド
ROS活性酸素種
ZnPP亜鉛プロトポルフィリン
ニクジュヨウ抽出物：ホンオニクのPHG
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