ラジカルスカベンジングおよびアンチエイジング特性のためのNMRベースのメタボロミクスプロファイリングパート2
Jun 06, 2022
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2.5。 主成分分析によるハーブ抽出物の分類
テストされたハーブの葉の間の代謝物の変動は、多変量データ分析（MVDA）を使用してさらに分析されました。 パターン認識手法である主成分分析（PCA）は、教師なしMVDAであり、サンプル間の関連性を大いに理解します。 PCAスコアプロットはハーブのクラスターへの分離を示しましたが、ローディングプロットは分離を提供する代謝物を強調しました[85、86]。 PCAモデルは、良好な適合性（R2X =0 .997）と高い予測可能性（Q 2=0。993）を示し、R2X（cum）とQ2（cum）の間の変動は0未満でした。 .3したがって、各ハーブ抽出物が観察されたグループ分離に等しく均等に寄与したことを示しています。 この観察は、Wheelockらと一致していました。 [87]。
主成分分析のスコアプロットは、図4Aに示すように、選択したハーブが2つのクラスターに分離されており、顕著な外れ値がないことを示しています。 主成分（PC）1が最大のサンプル変動を示し、次にPC2が続きました。 PC1とPC2は、それぞれ29.7パーセントと24.9パーセントの分散のパーセンテージに寄与しました。 したがって、約54.6パーセントの合計分散がこれらのPCによって説明されました。 ローディングカラムプロットの結果は、ハーブがPC1の正の側（V.negundoおよびC.longa）とPC1の負の側（P.マイナス、P。インディカ、O.javanicaおよびC. caudatus）（図4B）。
PC1のローディングカラムプロットからのデータは、フェノール化合物、主にフラボノイド基とフェノール酸が、選択されたハーブの分離に関与していることを発見しました。 ケルセチン（1）、ケルセチン-3- O-ラムノシド（2）、ケルセチン-3- O-グルコシド（3）、ケルセチン-3- O-グルクロニド（4）、ケルセチン-3- O-アラビノフラノシド（5）、ルチン（6）、ムブリセチン誘導体（7）、カテチン（8）、エピカテキン（9）、イソラムネチン（10）、アストラガリン（11）、クロロゲン酸（12）、没食子酸（13）、クマル酸（14）、アスコルビン酸（15）、ギ酸（21）、フマル酸（22）、3-メチルキサンチン（26）およびアピゲニン（28）の含有量は、P。マイナス、P。インディカでほとんど高かった。 、C。caudatusとO.javanicaは、プロットの負の側に位置していたため。 対照的に、V.negundoとC.longaは、抽出物にセロトニン（27）とD-リモネン（29）が含まれていることで、他のハーブと区別されていました。
2.6。 部分最小二乗分析（PLS）を使用した生体活性と代謝物の相関
測定された生物活性と試験されたハーブに見られる代謝物との関連を理解するために、監視されたMVDA方法論としてPLSを実装し、独立変数データ（代謝物のNMR化学シフト）を従属変数のデータに相関させました。 DPPH、ABTS、ORACアッセイの阻害、および抗エラスターゼと抗コラゲナーゼ活性でした。 この方法論が適用されたのは、PLSがテストされた生物活性を代謝物と関連付けるために大きな成果を上げており、予測のモデルを提供できるためです[88]。 PLS分析を通じて、ラジカル捕捉活性などの生物活性と、サンプル中の代謝物によるアンチエイジング特性との関係を確立することができます。 したがって、生物活性マーカーとしての役割を果たした代謝物を提案することができます。
Mediani et al。によって報告されているように、バイプロットはPLS分析から得られたスコアとローディングプロットの混合物です。 [80]。 ラジカル捕捉活性（図5A）とアンチエイジング特性（図5B）の部分最小二乗バイプロットは、すべてのサンプルが十分に分離され、顕著な外れ値なしでクラスター化されていることを示しました。 PC1は、P。minus、C.caudatus、およびP.indicaの葉をV.negundo、O.jaoanica、およびC.longaから分離しました。 バイプロットのラジカル捕捉活性とアンチエイジング特性に基づいて、モデルはそれぞれ{{1 0}}。988と0。966の良好な適合性（R'Y）値を示しました。 一方、ラジカル消去活性とアンチエイジング特性の予測可能性（Q4）は、それぞれ0.984と0.951でした。
ラジカル捕捉活性のPLSバイプロット（図5A）からわかるように、生物活性（DPPH、ABTS、およびORACassay）は、最も活性の高い領域であり、P.minus、Pに最も近いバイプロットの正の側に向けられました。インディカとC.caudatus。 対照的に、V。negundo、O.javanica、およびC. longaは、最も活性の低い領域と見なされ、DPPH、ABTS、およびORACアッセイから離れた、バイプロットの負の側に向けられ、負の相関を示しました。生物活性を持ちます。 この状況では、P。mimus、P。indica、およびC.caudatusは、最も活性の低いハーブとは別にクラスター化しており、これらのハーブがより強力なラジカル除去効果を示したことを示しています。化合物。 3つの最も活性の高いハーブの中で、P。マイナスは、DPPHおよびABTSアッセイ、続いてORACアッセイとより強く相関していることがわかりました。
この発見は、実行されたラジカル捕捉活性のインビトロ結果と一致していた。 結果は、P。マイナスが他のハーブと比較して強力なフリーラジカル除去効果を示したことを示しました。 したがって、結果は、P。マイナスが活性酸素種根絶剤にとって最も活性の高いハーブであることを明らかにした。 P.マイナスのラジカル捕捉活性に寄与する重要な二次代謝産物は、ケルセチン、ケルセチン-3- O-ラムノシド、カテキン、イソラムネチン、アストラガリン、およびアピゲニンとして同定されました。オテフラボノイドこれらの代謝物はすべて、P。マイナスおよびDPPHandABTSラジカルスカベンジングアッセイの近くに位置していました。 Medianiらによる以前の研究[80] また、植物の凍結乾燥サンプルが、より大量の-グルコース、-グルコース、カテキン、およびクロロゲン酸を示したことを発見しました。これは、ハーブの強力なDPPHラジカル捕捉能力に寄与した可能性があります。 ただし、P.minusの高いラジカル除去効果は、抽出物中の未確認の代謝物によっても寄与している可能性があります。
アンチエイジング特性についても同様の結果が見られました。 図5Bは、アンチエイジング特性のPLSから得られたバイプロットを示しています。 生物活性（抗エラスターゼおよび抗コラゲナーゼ活性）は、最も活性の高い領域であり、P.minus、P。indica、およびC.caudatusに近いバイプロットの正の側に投影されました。 対照的に、V.negundo、O.javanica、およびC.longaは、最も活性の低い領域と見なされ、抗エラスターゼおよび抗コラゲナーゼ活性からさらに離れたバイプロットの負の側に向けられました。 これは、生物活性との負の相関または弱い相関を示しました。 この状況では、P.mimus、P.indica、およびC. caudatusは、最も活性の低いハーブとは別にクラスター化されており、これらのハーブ抽出物がより大きなエラスターゼおよびコラゲナーゼ阻害を示したことを示しています。 3つの最も活発なハーブの中で、P。マイナスは他のハーブと比較してこれらのアンチエイジング特性と強い相関関係があることがわかりました。
この発見は、以前に行われたアンチエイジング特性のinvitroの結果と一致していました。 結果は、P.minusがエラスターゼおよびコラゲナーゼ酵素を阻害するための最も活性なハーブであることを明らかにしました。 P.マイナスの老化防止特性に寄与する重要な二次代謝産物は、ケルセチン、ケルセチン-3- O-ラムノシド、ミリセチン誘導体、カテキン、イソラムネチン、アストラガリン、およびアピゲニンとして同定されました。 -グルコース、-グルコース、フマル酸、および脂肪酸などの他の代謝物も、生物活性に関与している可能性があります。 これらの代謝物はすべて、P。マイナス、および抗エラスターゼおよび抗コラゲナーゼ活性の近くに位置していました。
Cistancheはアンチエイジングができます
これらの選択されたハーブの識別は、特に高ラジカル捕捉活性サンプルと一致していました。 マイナス、P.IndiaおよびC.caudatusは、二次代謝産物、特にフラボノイドの濃度が高いために他と区別されることが期待されていました。これらのフェノール化合物の存在は、エラスターゼおよびコラゲナーゼ阻害活性の向上にも寄与すると考えられています。これらのハーブ[67-79、89-92]。
フリーラジカル捕捉能と老化防止活性に対する植物抽出物の生物活性化合物の寄与は、さまざまな研究によって実証されています[66,72,75,79、92-101]。 さらに、フラボノイド（ケルセチン、ケンペロール、ミリセチン、エピカテキン、カテキン）などの代謝物や、レスベラトロールやプロシアニジンB2などの他のフェノールは、エラスターゼやコラゲナーゼを大幅に阻害することが証明されています[69-71、79]。
本研究では、予測（VIP）値の重要度が変動する代謝物シグナルを特定およびレビューして、テストされた生物活性と相関する最も重要な代謝物を取得しました。 これは、同定された代謝物の識別可能性を調べた、ここに提示された結果の完全性を高めるために行われました。ピューリタンビタミンCGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}。5は、差別にとって重要であると考慮されました[102]。 この研究では、ラジカル除去活性とアンチエイジング特性に寄与するすべての代謝物は、VIP値が1.0を超えていたため、重要な識別代謝物として分類できました（表2）。 2つのPLSbiplotsモデルは、100のランダム順列を使用して検証され、適合度と比較して、いくつかのモデルで元のモデルの有効性（R2）および予測（Q2）能力を確認しました。 R2は、モデルの適合性が重要であることを示し、モデル内のY変数のグレードを説明しましたが、Q2は、Erikssonetalによって報告されたものと同様のモデル予測品質を提供しました。 [103]。
Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0。8）。 結果は、RのすべてのY軸切片が< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheR2とQ2の切片値はそれぞれ0。0367-0.0872と-0。444から-0。492の範囲であり、両方のPLSモデルが有効であることを示しています。過剰適合は見られませんでした。 したがって、これら2つのPLSモデルは、優れたパフォーマンスモデルとして分類でき、これらの調査結果により、モデルの信頼性が向上しました。
2.7。 二次代謝産物の相対的定量化
選択したハーブから特定されたいくつかの二次代謝産物の相対的な定量化を図6に示します。これらの代謝物は、P。マイナスなどの最も活性の高いハーブでほとんどが高く、バイプロットの正の側に位置していました。そして、テストされたほとんどすべての生物活性に近かった。cistancheとは何ですかこれらの結果は、特にP.マイナスに大量に存在する化合物のフラボノイドグループからの二次代謝産物が、このハーブのフリーラジカル根絶および老化防止特性に寄与した可能性があることを明らかにしました。
それらの有効性に寄与した可能性のあるフラボノイドの異なる構造と比較すると、Bリングのヒドロキシル化パターンが老化酵素活性に対する代謝物の阻害効果の重要な要因の1つである可能性があることが注目されました[80]。 。 Simetal。[104] また、タンパク質レベルとmRNAレベルの両方で、これらのフラボノイドの阻害効果がBリングのグループ数の増加とともに強力になることを明らかにし、MMPでのいくつかのフラボノイドの構造と活性の関連を調べました-1 UV照射されたヒト皮膚線維芽細胞における遺伝子発現。
3.材料と方法
3.1。 化学薬品および試薬
重水素化メタノール-d4（CH3OH-d4）、非重水素化KH2PO4、酸化重水素ナトリウム（NaOD）、トリメチルシリルプロピオン酸-d4ナトリウム塩（TSP）、エタノール、およびメタノールは、Merck Millipore International（ダルムシュタット、ドイツ）から供給されました。 ケルセチン、リン酸緩衝液、2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）、2、2-アジノビス（3-エチル-ベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）[ABTS ]、トロロックス、過硫酸カリウム、2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）[AAPH、エピガロカテキンガレート（EGCG）、HEPESバッファー、エラスターゼ酵素、N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Chloro、N -メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリドおよび重水（D2O）は、Sigma（Aldrich、ドイツ）から供給されました。
3.2。 植物材料とサンプリング
O.jacanica、P。minus、およびC.longaの新鮮な葉は、Felda Sungai Koyan Satu、Raub、およびPahangから収集されました。 V.negundoの葉は、マレーシアプトラ大学の生物科学研究所から入手しました。 P. indicaの新鮮な葉は、マレーシアプトラ大学のUniversity Agriculture Parkで収穫され、C。caudatusの葉の新鮮な葉は、SelangorのSerdangにあるAgriculturalInstituteで収集されました。 これらのハーブのバウチャー標本は、マレーシアプトラ大学の生物科学研究所の植物標本室に置かれ、各標本は植物学者によって検証されました。アンチエイジングシスタンシュ代謝物含有量の信頼性を確保するために、すべての葉は朝、晴れた日に一貫して収穫されました。 各ハーブのオープンフィールドでのプロットは6つの部分に分けられ、各サンプルは6つの複製として各セグメントから収集されました。
3.3。サンプル準備
収穫後、新鮮な葉を水道水で洗浄してすべての残留物を除去し、実験用ティッシュペーパーで乾燥させ、液体窒素で即座に凍結してすべての酵素反応を停止し、凍結乾燥前に代謝物を保存しました。 次に、サンプルをLABCONCO（米国ミズーリ州カンザスシティ）凍結乾燥機で、一定の重量と水分含有量が10％未満に達するまで乾燥させました。 乾燥したサンプルはすべて、実験室用ブレンダーを使用して微粉末に粉砕し、300 umのサイズの実験室用試験ふるい（ENDECOTTS LTD.London、England）を使用してふるいにかけ、均一なサイズにしました。 粉末サンプルは、露光と湿度からサンプルを保護するためにアルミニウムパッケージに真空パックされ、分析前に-80度で保管されました。
3.4。 抽出
Medianiらによって記述された抽出手順。 [105]の後にいくつかの変更が加えられました。 簡単に説明すると、各粉末サンプル10gを琥珀色の三角フラスコ内の60％エタノール100 mLに浸し、超音波バスソニケーター（WiseClean、モデルWUC-D10H、ソウル、韓国）を使用して制御温度（40度未満）で1時間超音波処理しました。 。 サンプルをワットマン濾紙No.1で濾過し、残りを2回再抽出し、最初の抽出が完了した後に濾過しました。 次に、抽出物をプールし、40度の真空下でロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。 次に、得られた粘性物質をLABCONCO凍結乾燥機を使用して凍結乾燥し、水分を完全に除去し、さらに使用するまで-80度で保管しました。 最後に、乾燥した粗抽出物を、実施したすべての調査に必要な濃度に希釈しました。
3.5。 DPPHラジカルスカベンジングアクティビティ
サンプルのラジカル捕捉活性は、Kongetal。[106]によって開発された技術に従って決定されました。これは、Brand-Williamsetal。の修正された方法から開発されました。 [107]わずかな変更あり。 簡単に説明すると、さまざまな濃度（0〜500 ug / mL）のメタノール中の50uLサンプル抽出物に195uLの新たに調製した0.2mMメタノール2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）溶液を加えて保存しました。 すべてのテストサンプルは96ウェルプレートで準備されました。 脱色プロセスは、暗所で60分間インキュベートした後、分光光度計（Biotek EL 800マイクロプレートリーダー、Bio-Tek、Winooski、VT、USA）を使用して515 nmで記録し、ポジティブコントロールおよびブランクサンプルと比較しました。 ラジカル捕捉活性のパーセンテージは、次の式に従って測定されました。
ここで、コントロールは植物抽出物を含まないコントロールの吸光度であり、シンプルは植物抽出物の吸光度です。
安定したフリーラジカルDPPHの50％を除去した植物抽出物または陽性対照濃度は、ラジカル捕捉活性のパーセンテージの線形グラフを使用してICとして計算されました。
植物抽出物/ポジティブコントロール濃度。 ICsoが低いほど、抗酸化活性が高いことを示しています。 すべての実験は、陽性対照としてTroloxとケルセチンを使用して6回繰り返して実行されました。
3.6.ABTSラジカルスカベンジングアッセイ
ABTSラジカルスカベンジングアッセイの場合、分析はArnaoetal。[108]によって記述された手順に従っていくつかの修正を加えて実施されました。 調製したストック溶液は、7mMABTSプラス溶液と2.45mM過硫酸カリウム溶液でした。 作業溶液を調製するために、2つのストック溶液を同じ量で混合し、暗所で室温で16時間反応させました。 次に、作業溶液を蒸留水で希釈し、分光光度計（UV -1650 PC分光光度計、島津製作所、京都、日本）を使用して734nmで0。700±0.005単位の吸光度を取得しました。 ABTSプラスソリューション。 ABTS plus溶液は、すべてのアッセイ用に新たに調製しました。 このABTSplus溶液（900μL）を100μLのハーブ抽出物と2分間反応させました。 次に、分光光度計を使用して734nmで吸光度を読み取った。 3.1 ug / mL〜および50 ug / mL Troloxを含む標準曲線を作成し、結果をmgTrolox等価抗酸化能/gサンプル（mg TEAC / gサンプル）として表した。
3.7。 ORACラジカルスカベンジングアッセイ
ペルオキシルラジカル捕捉効果を測定するためのORACアッセイは、Huangetal。 [109] FLUOstar OPTIMAマイクロプレート蛍光リーダー（BMG LABTECH、オルテンベルク、ドイツ）を使用。 各ハーブ抽出物とトロロックス（標準）は、75 mMリン酸緩衝液（PBS）pH7.4で調製しました。 96-ウェルブラックマイクロプレートに、合計150μLのフルオレセイン（10 nMをPBSに溶解）を加え、続いて25μLのトロロックス、植物抽出物、またはブランクとしてPBSを加えました。 これらの溶液は、3つのウェルにピペットで移しました。 マイクロプレートを37度で15分間インキュベートし、蓋をした。 蛍光は、458nmの励起波長と520nmの発光波長で測定されました。 バックグラウンドシグナルは、90秒ごとに測定を行うことによって決定されました。
その後、25μLの新たに調製した2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）（AAPH、PBS中240 mM）をオンボードインジェクターで導入しました。 次に、同じ励起波長と発光波長を使用して、蛍光の減衰を最大90分まで測定しました。 サンプルの曲線下面積（蛍光対時間）からブランクの曲線下面積を差し引いて評価を行い、標準曲線（25-400μMTrolox）と比較しました。 Troloxに関連するORAC値は、次の式を使用して計算されました。
3.8。エラスターゼ阻害アッセイ
エラスターゼ阻害活性は、Krause etal。[110]によって記述された技術に従って決定されましたが、Ndlovuetal。によってわずかな変更が加えられました。 [75]。 サンプルウェルには、25μLの0.1 M HEPESバッファー（pH7.5）、25μLのハーブ抽出物（100 ug / mL）、および25μLのエラスターゼ酵素（1 ug / mL）が含まれていました。 ブランクウェルには75μLのHEPESバッファーのみが含まれ、ネガティブコントロールウェルには50μLのHEPESバッファーと25μLのエラスターゼ酵素が含まれていました。 ポジティブコントロールウェルには、25μLのHEPESバッファー、25μLのN-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Chloro（10 ug / mL）、および25μLのエラスターゼ酵素が含まれていました。 溶媒コントロールウェルには、25μLのHEPESバッファー、25μLの10％メタノール、および25μLのエラスターゼ酵素が含まれていました。 ハーブ抽出物のブランクコントロール（テストしたすべての抽出物のカラーコントロール用）には、150μLのHEPESバッファーと25uLのハーブ抽出物が含まれていました。 次に、マイクロウェルプレートを室温で20分間インキュベートした。 これに続いて、100μLの基質（N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリン、1mM）を加えた。 次に、プレートを25度でさらに40分間インキュベートした。 インキュベーション後、405 nmで分光光度計（Biotek EL800マイクロプレートリーダー）を使用して吸光度を読み取った。 ハーブ抽出物の阻害率は、次の式を使用して計算されました。
ここで、Aコントロールはエラスターゼと溶媒を含むバッファーの吸光度であり、Atestはバッファー、エラスターゼ、ハーブ抽出物またはN-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Chloroの吸光度です。
3.9。 コラゲナーゼ阻害アッセイ
コラゲナーゼ阻害活性は、Van-Wart and Steinbrink [111]（1981）の方法に従い、Madroneetal。 [92]。 テストは、5 0 mM TESバッファー（0。36 mM CaCl2を含むpH7.4）で実施されました。 Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼ酵素（ChC-EC.3.4.23.3）は、0。8 units / mLの濃度で調製されました（TESバッファーストック溶液に溶解）。 合成基質N-[3-（2-フリル）アクリロイル] -Leu-Gly-Pro-Ala（FALGPA）は、TESバッファーストック溶液中で2mMの濃度で調製しました。 最終反応混合物の総量150μLには、46.3μLのTESバッファー、60μLのFALGPA（0.8 mM FALGPA最終濃度）、18.7μLのコラゲナーゼ酵素（0.1単位/ mLの最終濃度）、および25μLのハーブ抽出物が含まれていました（ 100 ug / mL）。 TESバッファー中のハーブ抽出物と酵素を室温で15分間インキュベートした後、基質を添加して化学反応を開始しました。 ネガティブコントロールはTESバッファーを使用して実行されました。 基質を加えた後、96ウェルマイクロタイタープレートで分光光度計（Benchmark Plus Microplate、Bio-Rad 170-6930、Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して、340 nmで吸光度を直ちに読み取り、別のプレートを継続的に測定しました。 20分 没食子酸エピガロカテキン（EGCG）を12.5ug/mLで使用して陽性対照を行った。 サンプルの阻害率は、次の式を使用して計算されました。
ここで、AコントロールはTESバッファーの吸光度であり、AtestはTESバッファー、コラゲナーゼ酵素、および植物抽出物またはFALGPAの吸光度です。
3.10.H-NMR測定を使用した代謝物プロファイリング
選択されたハーブのH-NMRを使用した代謝物プロファイリングは、Kimetal。によって記述されたプロトコルに基づいて実行されました。 [47]わずかな変更。 粗ハーブ抽出物（25mg）をmLマイクロ遠心チューブに移しました。 0。1パーセントのトリメチルシリプロピオン酸ナトリウム塩（TSP）を含むDao（pH 6。0）中のメタノール-d4とKHPO4バッファーの混合物を、総量{ {1 0}}。7mL（（1：1）比）。 次に、ハーブ抽出物を含むマイクロ遠心チューブを室温で1分間ボルテックスした後、15分間超音波処理しました。 次に、混合物を5678gで1 0分間遠心分離し、上澄みを溶解できない物質から分離しました。 次に、0.6mLの透明な上澄みをNMRチューブに組み込み、H-NMR分析にかけた。 H-NMRの分析は、499.887MHzの周波数で動作する500MHz Varian INOVA NMR分光計（Varian Inc.、Palo Alto、CA、USA）を介して達成され、スペクトルは26度で記録されました。 すべての単一スペクトルは、3.53分の取得時間と20ppmの幅で64回のスキャンで構成されていました。 Chenomxソフトウェア（v.6.2）（Clhenomx Inc、Edmonton、AB、Canada）を使用してデータを分析し、一貫した設定でフェーズとベースライン補正を実行しました。 多変量データ分析は、SIMCAソフトウェア（バージョン13.0、Umetrics、Umea、スウェーデン）を使用して実施されました。 3.11。 'H-NMRスペクトルのバケッティング
H-NMRスペクトルのバケット化は、Chenomxsoftware（v.6.2、Edmonton、AB、Canada）を使用して実装されました。 すべてのスペクトルは、同じパラメータを使用して0。5-10。0pprn領域からビニングされました。 パラメータには§0。04のスペクトル幅が含まれ、NMRスペクトルごとに合計245の積分領域が得られました。 それぞれδ4。70-4。90およびδ3。27-3。35での水および残留メタノール-dの化学シフトは排除されました。 次に、均一にビニングされたデータを多変量データ分析（MVDA）にかけました。
3.12。 代謝物の相対的定量化
同定された代謝物は、LH-NMRスペクトルのビニング後のシグナルの平均ピーク面積に基づいて計算された相対定量について調べられました。
3.13。 統計分析
6回の繰り返しのすべての結果は、平均値±標準偏差として表されました。 ラジカルスカベンジング活性、エラスターゼおよびコラゲナーゼ活性の阻害、および代謝物の相対的定量化の測定のために、統計分析をMinitab 16（バージョン16、Minitab Inc.、米国ペンシルバニア州ステートカレッジ）を使用して実施しました。 分散分析（ANOVA）を適用して、pを使用した平均間の有意差を調べました。<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">
4.結論
MVDAと組み合わせたH-NMR分析の適用は、選択したハーブの代謝物の変動を調査することに成功しました。 PCAスコアプロットは、クラスターに応じてハーブが明確に分離されていることを示しています。 この研究は、P。マイナスがDPPHおよびABTSアッセイを通じて最高のラジカル除去効果を有し、最高のアンチエイジング活性を示したことを明らかにしました。 PLS分析の2つのバイプロットは、P。マイナスで同定された代謝物とテストされた生物活性の間に強い関連が見られたため、この結果をさらに検証しました。 P.minusのラジカル除去活性と老化防止特性に寄与すると考えられている活性代謝物には、ケルセチン、ケルセチン-3- O-ラムノシド、ミリセチン誘導体、カテキン、イソラムネチン、アストラガリン、およびアピゲニンが含まれています。 したがって、これらの代謝物は、P。マイナスの強力なラジカル除去効果と高いアンチエイジング特性の原因であると推測できます。 これらの代謝物は、主にフラボノイドグループ、特にフラボノールからのものでした。 したがって、P。マイナスからの代謝物は、老化症状の遅延および加齢関連慢性疾患の治療に使用できる有望なフリーラジカル根絶剤および老化酵素阻害剤である可能性があることが示唆され得る。 これらの発見は、アンチエイジング剤の潜在的な天然源として、および天然のフリーラジカル根絶剤としてのP.マイナスの効力を確立するのに役立ちます。
この記事は、Molecules 2019、24、3208から抜粋したものです。 doi：10.3390 /molecules24173208www.mdpi.com/journal/molecules