本研究では、ガラクタンエキソ多糖（EPS）をシスタンケKR780676 は、酸化ストレスを軽減するインビトロアッセイとインビボ研究を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（野生型）とその抗酸化物質(sod14、sod24、tsa14、cta2、ctt12)抗アポトーシス(pep4 および fs14) および老化防止(sod24、tsa1、および ctt12)) 同質遺伝子欠失変異体。 ガラクタンは強力な DPPH を示し、一酸化窒素除去活性lCso値はそれぞれ450および138μg/mLであった。 酵母変異体モデルでは、スポットアッセイとその後の蛍光 DCF-DA 染色および顕微鏡研究を使用して確認されたように、H,0.によって生成された酸化ストレスは培地中のガラクタンによって広範囲に除去されました。 ガラクタン処理により、蛍光強度の低下によって実証されるように、酵母変異体細胞で生成される ROS が減少しました。 さらに、ガラクタンは、酵母変異株 (pep4 および fs1) において H,O, 誘導性アポトーシス阻害を通じて酸化損傷に対する保護を示し、酸化ストレスを中和することで生存率の増加につながりました。 経時的寿命アッセイでは、ガラクタンEPSで処理したWT細胞は生存率の8パーセント増加を示しましたが、sod2変異体は10-15パーセントの増加を示し、顕著な老化効果を示しました。 W. confuse KR780676 由来のガラクタンは、栄養補助食品、医薬品、食品技術用途の天然抗酸化物質として使用できる計り知れない可能性を秘めています。 私たちの知る限り、これは酵母欠失モデル系における非細菌性 EPS の生体内抗酸化特性の詳細な評価に関する最初の報告です。

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酸化は生物学的プロセスを維持するために、またすべての生物におけるエネルギーの生産にも不可欠なプロセスです。 活性酸素種 (ROS) ラジカルと活性窒素種 (RNS) ラジカルは、それぞれ酸素分子と窒素分子の通常の異化作用から生成されます。 重度の酸化ストレスは、DNA損傷、細胞変性、発がんなどのさまざまな変性状態を引き起こします。 これらは、次のような多くの健康障害を引き起こす可能性があります。エージング, 心血管疾患, 癌、 肝硬変, アテローム性動脈硬化症, 糖尿病抗酸化物質は、食品や生体システムで生成されるフリーラジカルを除去し、酸化損傷に関連する健康状態の予防につながる分子です2-6。 多くの合成抗酸化物質が強力なラジカルスカベンジャーとして利用可能ですが、それらの中には望ましくない副作用と関連しているものもあります。 これを考慮して、食品および製薬業界での天然抗酸化物質への関心と需要が高まっています。 植物およびキノコベースの多糖類のほとんどは、ROS11 ～ 21 に対する重要な保護剤として報告されています。 乳酸菌 (LAB) に由来するものを含むさまざまな微生物外多糖類 (EPS) も、その実質的な抗酸化特性について報告されています。 これらは合成のものよりも安全な代替品であると考えられています。 近年、LAB の多くの EPS の抗酸化能力と酸化損傷の予防が研究されています 22,23。 ワイセラ EPS の抗酸化能力と保護的役割は、Cistanche EPSWWC、W. confusa OF126、W. cibaria GA44、W. cibaria YB-1、W. confusa W4 などの多くの株から単離されたさまざまな EPS からも報告されています。および W. シバリア SJ1424–29。 in vivo の抗酸化特性は、細胞株 30、C. elegans31、酵母 32、マウス 33 などのさまざまなモデル系を使用して研究できます。 これまでに、Saccharomyces cerevisiae 酵母遺伝子欠失変異体モデル系を使用して、さまざまな化合物の潜在的な抗酸化特性がスクリーニングされてきました 32,34-37。

この研究は次のことに焦点を当てています。ガラクタン EPS の抗酸化力インドの伝統的な発酵食品（イドリバッター）からプロバイオティクス株Cistanche KR780676によって生成されます38,39。 この論文では、DPPH、一酸化窒素、ヒドロキシルラジカル消去アッセイと生体内抗酸化物質を使用して、ガラクタン EPS の in vitro 抗酸化能についてスクリーニングしています。抗アポトーシスと老化防止特性酵母遺伝子欠失変異体モデルシステムを使用。

材料および方法

培地サプリメントを含むすべての化学薬品は、Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd. から調達されました。 Ltd.、インド、および Sigma の DCF-DA (2,7 ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート)。

微生物の培養。シスタンケガラクタン EPS を生成すると報告されているインドの酸性発酵食品 (イドゥリ バッター) から単離された KR780676 が、この研究で使用されました 38。

EPS 生成の検出。 W.コンフューサのEPS産生はコロニーレベルから観察された。 簡単に言えば、株をMRS寒天(2パーセントのスクロースを補充)上で培養した。 30℃で48時間後、ぬるぬるした/粘液性のコロニーの出現が観察されました。 ガラクタン EPS の生成は、走査型電子顕微鏡 (SEM) 分析によってさらに検証されました。

EPSの抽出。 EPS 抽出プロセスは、Kavitake et al.38 に記載されている方法に従って実行されました。 W. confusa の新鮮な接種材料 (10 パーセント) を 2 パーセントのスクロース強化 MRS 培地に 30 度で静的条件下で 48 時間添加しました。 このようにして懸濁液を遠心分離（１２、｛｛７｝｝×ｇで１５分間）してバイオマスを単離し、さらにトリクロロ酸で処理してタンパク質部分を除去した。 ガラクタン-EPSを氷冷エタノール(体積の3倍)を使用して沈殿させ、遠心分離(19,200×gで15分間)し、得られたEPSをMilli-Q水に溶解した。 粗製 EPS を 12 ～ 14 kDa (48 時間、4 度) で透析し、48 時間の凍結乾燥によって凍結乾燥しました。

ガラクタン EPS の in vitro 抗酸化特性。 Ye et al.9 による以前の報告に従って、ガラクタンの DPPH アッセイを実行し、消去活性パーセント (パーセント) を次の式で計算しました。

ここで、Ao と As はそれぞれコントロール (ブランク、EPS なし) とサンプルの吸光度です。 ガラクタンの一酸化窒素 (NO) ラジカル消去アッセイは、Sreejayan ら 40 に従って実行され、次の式で計算されました。

ここで、Ao はコントロール (ブランク、EPS なし) の吸光度、As は EPS 存在下での吸光度です。 Ye et al.9 によって報告されているように、ガラクタン EPS の還元力活性が測定されました。 吸光度は 700 nm で読み取られ、還元電位は反応混合物の高い吸光度によって示されます。 アスコルビン酸 (Vc) をポジティブコントロールとして使用しました。 ガラクタン EPS のヒドロキシルラジカル消去活性は、Yang et al.41 の記載に従って評価されました。 吸光度は 536 nm で読み取られ、捕捉パーセンテージは次のように計算されました。

ここで、A サンプルはサンプルの吸光度、A ブランクはサンプルと H2O2 溶液が存在しない場合の吸光度、A コントロールはサンプルが存在しない場合の吸光度です。

酵母変異株におけるガラクタン EPS の in vivo 抗酸化特性。

酵母、S. cerevisiae、BY4741 野生型 (WT) (MATa his3Δ:leu2Δ:met15Δ:ura3Δ)、および遺伝子欠失変異株は、Thermo Fisher Scientific, USA から入手しました。 突然変異体の選択のために、200 μg/mL のジェネティシン (G418 硫酸塩) を添加または添加しない酵母ペプトン デキストロース (YPD) 培地で酵母株を増殖させました。 YPD 固体培地は、YPD 液体培地に 2 パーセントの Bacto 寒天を添加することによって調製されました 42。

酵母の増殖に対する EPS の効果。 指数関数的に増殖する酵母野生型 (WT) 培養物 (約 1×104 細胞) をマイクロウェル プレート内のさまざまな濃度 (0 ～ 400 ug/mL) の EPS で処理し、最終体積を 200 μg にしました。 YPDブロスを含むμL。 培養物を 30 度で 18 時間インキュベートし、その後段階希釈して YPD 寒天プレート上に広げました。 プレートを 30 度で 2 日間インキュベートし、コロニー形成単位 (CFU) をカウントし、生存率を CFU43 パーセントとして表しました。

酸化ストレスのバイオマーカーの測定。 指数関数的に増殖する酵母WT細胞を、300μg/mlのEPSの存在下または非存在下で2時間前処理した。 10 個の細胞をシェーカーインキュベーター内で 30 度で 1 mM H2O2 に 1 時間曝露し、以前のレポートに記載されている方法に従って SOD 活性と脂質過酸化レベルの測定のために処理しました 44-46

S. cerevisiae遺伝子欠失変異体におけるEPSの抗酸化特性。

指数関数的に増殖する酵母 WT および抗酸化物質欠損変異株 (sod1Δ、sod2Δ、tsa1Δ、cta1Δ、ctt1Δ、glr1Δ、および yhb1Δ) の培養物を 300 ug/mL EPS で 2 時間処理した後、 1 mM H2O2 で 1 時間。 段階希釈した細胞を YPD 寒天プレートに広げ、30 度で 2 日間インキュベートし、生​​存率を計算しました。 スポットアッセイでは、培養物を {{16} 倍に連続希釈し、その 4 μL を YPD 寒天プレートにスポットし、30 度で 2 日間インキュベートし、写真を撮影しました 43,47。 ROS の検出と測定。 指数関数的に増殖する WT 株および抗酸化物質欠損変異株 (sod1Δ、sod2Δ、tsa1Δ、cta1Δ、および ctt1Δ) を EPS の有無にかかわらず 2 時間前処理し、30 度で 1 mM H2O2 に 1 時間曝露しました。 5000 rpmで5分間遠心分離した後の細胞ペレットをPBS緩衝液で2回洗浄し、200μLのPBSに再懸濁し、20μM DCF-DAとともに暗所、室温で15〜20分間インキュベートした。 インキュベーションの直後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、スライド上にマウントし、青色フィルターを使用して４０倍の対物レンズの下でオリンパスＩｘ７１蛍光顕微鏡下で観察した。 ROS の定量化のために、DCF DA 染色細胞を洗浄後に 200 μL の PBS に再懸濁し、分光蛍光光度計を使用して励起極大および発光波長 495/529 nm で DCF 蛍光の強度を測定しました。 蛍光単位を処理および未処理の各培養物に対してプロットし、比較しました 48,49。

ガラクタンの抗アポトーシス活性。

スポットアッセイおよび CFU アッセイ。 指数関数的に増殖させた WT 細胞および抗アポトーシス欠損変異体 (pep4Δ および fs1Δ) 細胞を EPS で前処理し、それぞれの未処理のコントロールとともに 2 時間インキュベートしました。 CFU カウントについては、培養物を EPS で 2 時間処理または未処理にし、0.5 mM H2O2 で 1 時間インキュベートしました。 段階的に希釈した各培養物を YPD 寒天プレート上に広げ、30 度で 2 日間インキュベートし、細胞生存率をパーセント CFU として表しました。 スポットアッセイでは、培養物を段階希釈し、続いて 1 mM H2O2 の存在下または非存在下で YPD 寒天プレート上にスポットしました。 プレートを 30 度で 2 日間インキュベートし、写真を撮影しました 47。

EPS の抗アポトーシス マーカーの検出

酵母の変異株を使用。 酵母における過酸化水素によって誘導されるアポトーシス細胞死から酵母細胞に対するEPSのレスキュー作用をさらに確認するために、WTおよび抗アポトーシス欠損変異株(pep4Δおよびfs1Δ)のアポトーシスマーカーを調べた。 指数関数的に増殖する WT、pep4Δ、および fs1Δ 細胞を 300 µg/mL EPS で 2 時間処理または未処理にし、その後 1 mM H2O2 に 1 時間曝露しました。 処理細胞と未処理細胞の両方をアクリジン オレンジと臭化エチジウム (AO/EB) で染色し、蛍光顕微鏡でクロマチン凝縮を観察しました 50,51。 DAPI 染色では、処理細胞と未処理細胞を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、1 ug/mL DAPI とともに暗所、室温で 5 ～ 10 分間インキュベートしました。 PBS で洗浄した後、細胞をスライド上にマウントし、オリンパス IX71 蛍光顕微鏡 (UV フィルター、対物レンズ 40 倍) で核の断片化を観察しました 52,53。

経時的寿命アッセイによる EPS の老化防止効果。

酵母野生型および抗酸化物質欠損変異体 (sod2Δ、tsa1Δ、および ctt1Δ) 培養物を定常期に達するまで増殖させ、経時寿命 (CLS) アッセイのために EPS の存在下または非存在下でインキュベートしました。 すべての株の生存可能性は、0 から 30 日までのさまざまな時間間隔で計算されました。 細胞生存率は、処理した培養物と未処理の培養物の両方の CFU パーセントとして表しました 54,55。 統計分析。 すべての実験は 3 回繰り返して (±SD) 実行され、IBM SPSS 20 ソフトウェアを使用して一元配置 ANOVA モデルで統計的に分析されました。 Tukey の HSD 比較テスト (p<0.05) was used to measure the significance level. 

結果と考察 発酵食品から分離された乳酸菌 (LAB) は、プロバイオティクス特性が証明されているため、ここ数年食品技術者の大きな注目を集めています。 インドの発酵食品から分離された細菌には、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属などがあります。 そしてあまり調査されていないWeisella spp. 他の有益なLABと同様に、私たちの研究室で発酵させたidliバッターから分離されたCistanche株KR780676は、潜在的なプロバイオティクス候補として機能することが報告されています39。 以前の報告では、このガラクタンは線状ホモ多糖として特徴付けられており、その物理化学的、機能的、乳化特性についてもスクリーニングされています 38,56-58。 我々はまた、W. confusa KR780676 の細胞および細胞上清が強力な抗酸化活性を示したことも報告しました 39。 W. confusa KR780676 からの EPS 産生は、48 時間インキュベートした 2% ショ糖を豊富に含む MRS 寒天プレート上で観察され (図 1A-i)、これにより Weissella のぬるぬるしたコロニーが明らかになり、(Weissella コロニーの) SEM 画像でもさらに確認されました。細胞とともにガラクタン EPS が存在することを示しています (図 1A-ii)。 段階的な EPS 製造の概要を図 1B の図で示します。

ガラクタン EPS の in vitro 抗酸化特性。 図２Ａに示すように、ＤＰＰＨ捕捉活性は濃度依存性であることが観察され、捕捉活性はガラクタン濃度とともに増加した。 アスコルビン酸の半最大有効濃度 (IC50) は 8.8 μg/mL でしたが、ガラクタン EPS は 450 μg/mL でした。 1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル (DPPH) は、分子全体に対して不対電子を非局在化する安定なフリーラジカルであり、その結果、分子の二量体化が防止され、深い紫色が得られます59。 DPPH 溶液をさまざまな濃度 (50 ～ 500 μg/mL) のガラクタンに添加すると、濃度が増加するにつれて紫色が減少します。 抗酸化物質が DPPH の電子と反応すると、DPPH の濃い紫色が明るい紫色に変わります。 そして色の強さは基質の抗酸化活性に依存します60。 ガラクタンは、内生細菌パエニバチルス ポリミクサ EJS-3 の EPS よりも高い 60% の DPPH 除去能力を示しました (<45.40%)33.

一酸化窒素は、pH 7.2の水溶液中でニトロプルシドナトリウムが分解すると生成されます。 硝酸塩と亜硝酸塩は、好気条件下で一酸化窒素が酸素と結合すると生成されます61。 図 2B に示すように、標準アスコルビン酸が 11 μg/mL であるのに対し、ガラクタンは最大半値有効濃度 (IC50) が 138 μg/mL であるため、ニトロプルシドナトリウムからの一酸化窒素の生成を減らす可能性があります。 図２Ｃに示すように、ＥＰＳの還元力活性は、増加する順にその濃度と正の相関がある。 標準（アスコルビン酸）は、ガラクタン EPS よりも高い還元能力を示し、これは Ye らの意見と一致しました 9 。 ガラクタンの還元力活性は、潜在的な抗酸化活性を示します。 フェリシアン化カリウム [K3Fe(CN)6] をガラクタン EPS に添加すると、それに含まれる抗酸化物質がフェリシアン化カリウム [K4Fe(CN)6] に還元されます。

図 2. ガラクタンの in vitro 抗酸化特性。 (A) DPPH ラジカル消去活性、(B) 一酸化窒素アッセイ、(C) 還元力アッセイ、および (D) ガラクタン EPS のヒドロキシルラジカル消去活性。

ガラクタンのヒドロキシルラジカル消去活性を図 2D に示します。 ガラクタンは最高の活性として 41.93 パーセントを示しましたが、同じ濃度 (1 mg/mL) の標準では 58.10 パーセントでした。 結果の傾向は、Lactobacillus plantarum C88 (EPS 濃度 4 mg/mL で 85.21 パーセント)62 および Paenibacillus Polymyxa EJS-3 (EPS 濃度 1 mg/mL で 68.55 パーセント)63 からの EPS に関する以前の報告と一致しています。 標準と比較すると、ガラクタンは 72.16 パーセントの効率を示しましたが、ラクトバチルス プランタルム C8862 およびパエニバチルス ポリミクサ EJS-363 からの EPS はそれぞれ 95.19 パーセントと 68.55 パーセントの効率を示しました。

酵母モデルにおけるガラクタン EPS の in vivo 抗酸化特性。 以前の報告では、LAB64 由来の EPS の抗増殖、抗潰瘍、コレステロール低下、抗酸化、抗炎症、免疫調節活性など、健康を増進するさまざまな生物学的特性が示されています。 この観点から、主に酸化ストレスを軽減することで腸の恒常性を維持するために、プレバイオティクスおよび/またはプロバイオティクスの可能性をサポートできるEPSによる抗酸化作用を詳細に評価することが重要になります。 細胞の抗酸化機構は、重要な細胞代謝経路を通じて生成される避けられない ROS を軽減する上で重要な役割を果たします。 細胞本来の抗酸化防御と生成される ROS との間の不均衡は、細胞にとって非常に有害となる可能性があります。 重度の酸化ストレスは、細胞の重要な成分、タンパク質、核酸、脂質分子に潜在的な損傷を引き起こし、その結果、多くの重要なシグナル伝達経路に影響を与え、アポトーシスを誘発します。 食事による抗酸化物質の摂取は、ROS レベル、ROS 媒介 DNA 損傷、アポトーシス、細胞形質転換などの細胞損傷マーカーの頻度を低下させることが示されており、その結果、加齢に関連する疾患の発生率がさらに低下します 65 キサンタンやレバンスのような微生物 EPS In vitro アッセイ (DPPH およびヒドロキシル ラジカル アッセイ) 5 およびヒト胃癌細胞 BGC-823 に対して、それぞれ抗酸化活性を実証しました 66。 以前、この研究では、モデル生物として酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4741 を使用して、W. confusa KR780676 から単離されたガラクタン EPS によって発揮される抗酸化作用、抗アポトーシス作用、および老化防止作用を評価しました。

酵母の増殖に対する EPS の効果。 異なる濃度の EPS で処理した野生型酵母細胞は増殖欠陥を示さず、ガラクタンが 0 ～ 400 ug/mL の範囲の濃度のいずれでも細胞毒性や増殖欠陥を誘発しないことが確認されました (図 3A) ）。 300μg/mL以上の濃度のガラクタンで処理した細胞は、著しく高い増殖を示し、ガラクタンが酵母増殖刺激活性を有することを示した。

300 ug/mL のガラクタン濃度は、酵母菌株を用いたその後の実験に使用されます。 ガラクタンはSOD酵素活性を低下させます。 ガラクタン EPS によって示される強力な in vitro 抗酸化活性に続いて、酵母 WT 細胞における SOD 活性に対するその効果をさらにチェックしました。 我々の結果（図3B）は、H2O2処理によって誘発された酸化ストレスが、未処理細胞と比較してH2O2-処理WT細胞のSOD活性の急激な増加を引き起こしたことを示しています。 対照的に、WT細胞をガラクタンで前処理した後にH2O2に曝露すると、H2O2単独で処理した細胞と比較してSOD活性が約2倍減少し、ガラクタンが酵母細胞のスーパーオキシドラジカル誘導酸化活性の管理に役立っていることが示された。ストレス47,67。

酸化ストレス過酸化物処理によって誘導される過酸化物酵素はスーパーオキシド酵素を活性化し、SOD 活性レベルの変化は細胞の酸化ストレスのレベルの直接的な尺度になります。 この研究では、NBT 還元法が使用されました。NBT はスーパーオキシドラジカル生成の指標です。 NBT の減少の阻害は、SOD の直接的な尺度です。 SOD は、酸素と電子供与体であるメチオニンの存在下でリボフラビンを可視光にさらすことによって生成されるスーパーオキシドラジカルを求めて NBT と競合するためです。 スーパーオキシドは NBT を青色生成物、つまり 560 nm で比色測定できるホルマザンに還元します。

以前の報告では、LAB EPS が in vitro アッセイ、結腸癌細胞株および in vivo モデルにおいて濃度依存的に抗酸化効果を発揮したことが示されています。 ROS を除去する EPS の能力は、EPS の多様な化学基に起因する可能性があります 68。 Bacillus amyl liquefacient 由来の他の EPS (500 μg/ml) は、SOD 活性に大きな影響を与え、H2O2 68 によって誘発される酸化ストレスから HepG2 細胞を保護することが示されています。 同様に、L. plantarum 由来の EPS は、H2O2- 誘発酸化ストレスに対する Caco2 細胞の SOD 活性に対して濃度依存的な効果を示しました 69。 これらの報告と一致する我々の結果は、ガラクタン EPS 前処理が酵母 WT 細胞における H2O2 処理によって誘導されたスーパーオキシドラジカルを除去することを示しています。

EPS は細胞の脂質過酸化を減少させます。 マロンジアルデヒド (MDA) は、酸化ストレスのレベルを示す細胞脂質過酸化バイオマーカーとして最も研究されています。 MDA は化学的に安定で反応性の高いジアルデヒドであり、タンパク質、核酸、リポタンパク質に容易に結合します。 これは変異原性が高く、これらの生体分子の生化学的特性に大きな影響を与える可能性があり、さまざまなシグナル伝達経路に有害です70。 MDA レベルの増加は ROS 誘発性の組織損傷の指標であり、そのレベルの増加はいくつかのヒトの病態で検出されます 46。 この研究では、EPS 前処理が酵母 WT 細胞の H2O2 によって誘発される脂質過酸化にどのような影響を与えるかを調べるために、MDA レベルを推定しました。 結果は、図3Cに示すように、H2O2単独に曝露した細胞と比較して、EPS前処理細胞におけるMDAレベルの約1.5-倍の減少を示しました。

これまでに、L. plantarum C88 由来の EPS は、Caco2 細胞において H2O2 処理によって誘導される MDA レベルを用量依存的に (50 ～ 200 μg/ml) 低下させることが示されており、これは過酸化物によって誘導される腸細胞の膜損傷が影響していることを示しています。 EPS69 を補給することで軽減できます (zhang 2013)。 さらに、B. アミロリケファシエンス由来の 500 ug/mL の EPS は、HepG2 細胞における H2O2- 誘発 MDA を有意に減少させました 71。 酵母細胞における H2O2- 誘発 MDA レベルと、ガラクタン EPS による細胞の前処理後のその大幅な減少に関する我々の結果は、ガラクタン EPS による処理が細胞の ROS 誘発脂質過酸化を減少させ、ひいては細胞の保護を可能にする可能性があることを示しています。過酸化ラジカルによって引き起こされる組織損傷から細胞を保護し、細胞の完全性を維持するのに役立ちます

実験。 *はPを表します<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

ガラクタンは、酸化ストレス下で酵母の抗酸化遺伝子変異体を保護します。 ガラクタンの抗酸化能力を評価するために、さまざまな抗酸化遺伝子欠損酵母変異体（さまざまな酸化ストレス応答遺伝子を欠く）をガラクタンで処理し、致死量未満のH2O2 42に曝露しました。 H2O2 で処理した場合の SOD (sod1Δ および sod2Δ)、カタラーゼ (cta1Δ および ctt1Δ)、チオレドキシン ペルオキシダーゼ (tsa1Δ)、グルタチオン レダクターゼ (glr1Δ)、および一酸化窒素オキシドレダクターゼ (yhb1Δ) 変異体。 WT に対して低い生存率 (sod1Δ 10.8 パーセント、sod2Δ 13.17 パーセント、tsa1Δ 13.55 パーセント、cta1Δ 15.34 パーセント、ctt1Δ 17.06 パーセント、glr1Δ 27.37 パーセント、および yhb1Δ 33.87 パーセント) を示しました。 対照的に、ガラクタン前処理では、すべての抗酸化遺伝子欠損変異体で酸化ストレスに対する耐性が増加し、生存率が大幅に増加しました（sod1Δ 78.43パーセント、sod2Δ 59.96パーセント、cta1Δ 87パーセント、ctt1Δ 87パーセント、tsa1）。図 4A に示すように、Δ 72.73 パーセント、glr1Δ 75.26 パーセント、および yhb1Δ 82.41 パーセント）。 これらの結果は、ガラクタンが特定の酸化ストレス応答遺伝子を欠く変異体においてH2O2によって誘発されるフリーラジカルを効果的に除去し、酸化ストレスから細胞を保護できることを示唆している。 同様の保護がスポットアッセイでも観察され、図4Bに示すように、ガラクタンは変異体を酸化ストレスから救い出し、生存率を高めました。

細胞は、さまざまな生理学的反応を通じて生成される ROS によって引き起こされる内因性酸化ストレスに耐えるために、酵素による抗酸化防御システムを備えて進化しています。これがなければ細胞の健康に悪影響を及ぼします。 以前の報告とこの研究での我々の結果は、EPS が ROS を除去し、細胞生存率を向上させることができることを示唆しています。 酵母の酸化ストレス応答変異株を用いた我々の結果は、酵母 sod1Δ および sod2Δ 変異株の生存率の増加によってそれぞれ証明されるように、ガラクタン EPS 処理が H2O2 処理によって誘導されたサイトゾルおよびミトコンドリアのスーパーオキシドラジカルの両方を除去することを示唆しています。 SOD は、内因性および外因性の酸化ストレスに対する細胞内の主要な酵素的抗酸化防御防御であり、これらの遺伝子の変異は癌や変性疾患に関与しています。 同様に、EPS 処理による cta1Δ および ctt1Δ (カタラーゼ変異体) の抗酸化レスキューは、ガラクタン EPS による処理が、H2O2 によって誘発されるペルオキシソームおよびサイトゾルの酸化ストレスに対する保護を提供することを示しています。 カタラーゼは過酸化水素の細胞解毒を担っており、その欠乏は加齢に伴う疾患の発症と関連しています。 TSA1、チオレドキシンペルオキシダーゼは、細胞を過酸化水素ストレスから解放するリボソーム関連タンパク質と遊離細胞質タンパク質の両方です。 報告によると、TSA1 は酸化的 DNA 損傷修復にも役割を果たしています。 我々の結果は、EPS処理が酵母tsa1∆細胞を過酸化物誘発ストレスから救出することを示唆しています。 哺乳類のペルオキシレドキシンは、細胞の成長、代謝、免疫機能にプラスの効果をもたらします。 グルタチオンの欠乏により、細胞の酸化ストレスが上昇し、重要なシグナル伝達経路に影響を及ぼし、神経変性疾患、悪性腫瘍、炎症性疾患に関与するとされています 72。グルタチオン抗酸化メカニズムは、酸化ストレスを克服するために細胞内に存在するもう 1 つの第一選択の酵素的抗酸化防御システムです。 GLR1 は哺乳動物のグルタチオン還元酵素の酵母ホモログであり、サイトゾルとミトコンドリアの両方に局在します 73。 Glr は酸化型グルタチオン (GSSH) を還元型グルタチオン (GSH) に還元し、細胞内の GSH レベルを維持する役割を果たします。これにより、スーパーオキシドラジカルとヒドロキシドラジカルが解毒され、細胞が酸化ストレスから保護されます 74。 我々の結果は、酵母 glr1Δ の H2O2 に対する高い感受性を示しており、これはガラクタン EPS での前処理により軽減され、ガラクタン EPS が GLR1 欠損細胞を酸化ストレスから保護する可能性があることを示唆しています。 興味深いことに、グルタチオンレダクターゼ欠損は、老化および加齢に関連した代謝障害、変性障害、心臓血管障害に関係しているとされています75,76。 図4Aに示すように、yhb1ΔもガラクタンEPSによってH2O2ストレスから保護されており、これはガラクタンEPSがYHB1欠損細胞を酸化ストレスから保護していることを示唆している。 酵母 YHB1 は、一酸化窒素ストレス 77 および酸化ストレス 78 から細胞を保護することが報告されているお気に入りのヘモグロビンです。 YHB1 のヒト相同体が、パーキンソン病のバイオマーカーである α-シヌクレイン毒性から細胞を救うようであることを示す証拠が示されています 79。 これらの以前の発見と我々の結果は、EPS が変性疾患の発症に対して細胞の生存を促進する可能性があることを示唆しています。

H2O2 ストレス下でガラクタンの有無による酵母変異体の ROS レベルを評価するために、酵母細胞を蛍光顕微鏡で観察し、細胞内の酸化レベルを蛍光分光計で計算しました 47,48。 H2O2 のみで処理した酵母変異体は、ガラクタンで前処理したものと比較して、より多くの緑色蛍光細胞を示しました。 (図4C)。 DCF 蛍光強度は約 60% 増加しましたが、ガラクタン前処理では、WT およびそれぞれのコントロールと比較して、H2O2- 処理酵母変異体では約 30% に減少しました (図 4D)。 顕微鏡結果と分光測光結果はどちらも、それぞれの対照と比較して、特定の抗酸化遺伝子を欠く細胞内の ROS レベルが増加していることを示しています。 ガラクタンで前処理し、その後 H2O2 に曝露した培養物は、ガラクタンで前処理していない培養物と比較して蛍光の減少を示しました。これは、ガラクタンが酵母変異体細胞における ROS 誘導 H2O2 曝露を減少させ、細胞の生存を促進することを示唆しています。 上記のすべての実験において、H2O2 を添加する前に細胞を洗浄した場合、有意な回復は見られませんでした（補足データ）。これは、ガラクタンによる ROS 除去が細胞内作用ではなく培地中での直接的な除去によるものであることを示しています。