パート1：抑制されたNF-κBシグナル伝達経路とAMPKを介したミトコンドリア機能回復を介したアクテオシド抑制ミクログリアM1分極
Mar 06, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
概要：
バックグラウンド：アルツハイマー病（AD）最も頻繁なタイプの認知症です。 その間cistancheハーブからのacteoside（ACT）、から単離された化合物 Cistancheカンカニクジュヨウ、神経保護特性を持っています。 ただし、ミクログリアの分極を調節する根本的なメカニズムは未定義のままです。方法：ここでは、シマウマの幼虫のAlCl 3-誘発ADモデルを適用して、ACTの治療効果を明らかにしました。 BV -2細胞は、ミクログリア分極に対するACTの役割を実証するために使用されました。 RNAシーケンス、HPLC-Q-TOF-MS、ウエスタンブロット、および分子ドッキングを組み合わせて、そのメカニズムを確認しました。結果：ACTは、シマウマの実験的ジスキネジアと神経系障害を大幅に改善しました。 その後、それはM1分極を抑制し、LPS誘導BV-2細胞でM2表現型に促進されました。 我々は最初に、ACTが、ミトコンドリア機能と相関する、炎症、アルギニン生合成、およびパントテン酸とCoA生合成における重要なシグナル伝達経路の調節を含む、深刻なトランスクリプトミクスの影響を及ぼしたことを示しました。 行為（cistancheハーブからのacteoside）治療は、NF-κBシグナル伝達経路を阻害することによりミクログリアM1分極を減少させました。 そして、代謝経路は、HPLC-Q-TOF-MSによってさらに確認されました。 さらに、ACTは過剰なROSを抑制し、AMPKを介したPGC-1およびUCP-2のアップレギュレーションを通じてミトコンドリア機能を回復させ、代謝の変化と一致させました。 興味深いことに、ACTは、分子ドッキングによって証明されるように、NF-κBとAMPKの両方に直接結合する可能性があります。結論：この研究は、ACTの注入メカニズムを提供し、ミトコンドリア機能障害に基づく新しい視点を示して、代謝とミクログリア分極との関係を明らかにしました。
バックグラウンド：
アルツハイマーの病気（AD）は、認知障害とジスキネジアを伴う一般的な神経変性疾患です[1]。 それは、重度の神経細胞の喪失、老人斑、および神経の毛細血管のもつれを特徴とします[2]。 ADの病因は多次元的であり、神経炎症に関連しています。 Neuroin§ammationは、ADの発症と密接に関連するグリア細胞の活性化によって促進されます[3、4]。 神経炎症の進行と悪化の間、ミクログリアは重要な要因と考えられています。 ミクログリアは中枢神経系の主要な免疫細胞です。 それは、脳の発達を含み、中立的な環境を維持し、傷害や修復に反応する一連のプロセスと密接に関連しています[1]。 さらに、ミクログリアはM1表現型に刺激される可能性があり、ADなどの神経炎症関連疾患が発生すると炎症誘発性サイトカインの発現が増加します[5]。 研究はまた、M1表現型への分極化がしばしば代謝障害を伴い[6]、エネルギー代謝の不均衡とミトコンドリア機能障害を引き起こすことを示しています[7]。 これらの有害な変化は、ADでさえ神経変性に由来します。
cistancheハーブからのacteoside（ACT）、フェニルエタノイド配糖体は、主に Cistancheカンカニクジュヨウ。 増加する証拠は、ACTが神経保護[8]、抗炎症[9]、および抗酸化[10]効果を含む多くの薬理学的活性を持っていることを示唆しています。 特に、ACTは、ストレプトゾトシン誘発ラットの学習と記憶障害を改善し、エネルギー代謝をアップレギュレートすることが報告されています[11]。 実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスでは、神経細胞のアポトーシス細胞死とミトコンドリアの損傷を抑制することも示唆されています[12]。 ただし、ミクログリアM1/M2分極に対するACTの効果に焦点を当てた研究はほとんどありません。 特に、ミトコンドリア機能の修復や細胞代謝の調節など、さまざまなメカニズムが実行されていません。 さらに、ミクログリアM1/M2分極に寄与するACTのメカニズムは未踏のままです。
本報告は、ACTの治療効果とADにおけるACTの根本的な分子メカニズムを調査することを目的とした。 ここで、ACTは、AlCl3-によって誘発されたADシマウマの幼虫に有意な神経保護効果を示しました。 さらに、ACTはM1分極を効果的に抑制し、LPS誘導BV-2細胞のM2表現型を促進しました。 メタボロミクス法と統合されたRNA-Sequencing（RNA-Seq）は、ミクログリア分極の調節におけるACTの根本的なメカニズムをよりよく理解します。 ミトコンドリア機能の観点から代謝とミクログリア分極の間のクロストークを調べた。 この研究は、ADを治療するための潜在的な治療薬としてのACTのさらなる調査に対する新たな敬意を提供します。
方法：
動物とモデルのグループ化：
この研究では、野生型シマウマ（AB株、生後4か月）を選択しました（Nanjing Qi Wu Biotechnology Co.、Ltd.）。 それらは、以前の方法[13]に従って、28度で14/10時間の明/暗サイクルの下で維持されました。 天然肥料と通常発生した胚を生成し、照明インキュベーターで受精後3日（dpf）まで培養しました。 すべてのシマウマの実験は、中国薬科大学の動物倫理委員会の監督の下で実施されました。
シマウマの幼虫は6つのグループに分けられ、3dpfから7dpfまで処理されました：コントロールグループ、モデルグループ、モデルとドネペジル塩酸塩（DPZ）グループ、モデルとACTグループ。 対照群は0.2パーセントDMSOを含む培地で維持され、モデル群は150μMのAlCl3（pH 5.8）で処理されました。 モデルとDPZグループをAlCl3と8μMのDPZで同時処理しました。 モデルとACTグループは、AlCl3とさまざまな濃度のACT（200、100、50μM）で同時処理されました。 行為（シスタンチェハーブからのアクテオシド）（HPLC純度98％以上）はBaoji Herbest Bio-Tech Co.、Ltd.（Baoji、China）から入手しました。 AlCl3・6H2OおよびDPZは、Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.、LTDから購入しました。 （中国、上海）。
行動分析
Zebra¦shの幼虫の動きは、ViewPoint行動アナライザー（Zebralab 2018、ViewPoint Life Sciences Co.、Ltd.）を使用して28度で記録されました。 Brie§y、行動パラメータ、および結果処理は、以前に確立した方法と一致していました[13]。 ここでは、平均速度（AS）、速度変化（ΔS）、ジスキネジア回復率（DRR）、および応答効率（RE、パーセント）を選択して、シマウマのジスキネジア回復を評価しました。
3dpfから7dpfまで処理した後、シマウマの幼虫を収集してAChEおよびChATの活性を測定しました。 メーカーのプロトコルに基づいて、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キット（MLBIO biotechnology Co. Ltd.、Shanghai、China）によって活性が検出されました。 そして、異なるサンプルのタンパク質濃度は、BCA法によって決定されました。
BV -2細胞を6-ウェルディッシュに別々に播種しました（n =6 /グループ）。 処理後、培地を除去し、細胞を冷PBSで3回洗浄した。 次に、細胞の代謝を抑制するために、すぐに液体窒素にさらされます。 細胞を冷80％メタノール（1mL /ウェル）で回収し、懸濁液を2mLエッペンドルフチューブに移しました。 タンパク質の沈殿を促進するために、1分間激しくボルテックスし、13、000 rpmで15分間、4度で遠心分離しました。 細胞懸濁液を新しい2mLエッペンドルフチューブに移し、窒素気流下で乾燥させ、分析まで-80度で保存しました。 乾燥した残留物を、150μLの予冷した25パーセントアセトニトリルで再構成しました。 シーケンス分析の安定性と精度を確保するために、各セルサンプルの等量（10μL）を品質管理（QC）サンプルとして組み合わせました。 代謝物の検出中、これらのサンプルは、安定性を確認するために6つの細胞サンプルごとに注入されました。 1μLのアリコートをHPLC-Q-TOF-MS用に注入しました。
HPLC-Q-TOF-MS分析は、Agilent 6530四重極飛行時間型（Q-TOF）質量分析計（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）に接続されたAgilent 1290HPLCシステムで実行されました。 分離は、ACQUITY UPLC BEH C18カラム（2.1×100 mm、1.7μm）で行いました。 移動相は、0.1％ギ酸-水（v / v; A）とアセトニトリル（B）で構成されていました。
§流量は{{0}}。4mL/ minに設定され、次の最適なグラジエント溶出条件が使用されました。0から2分、5パーセントB。 2〜20分、5〜95パーセントB（陽イオンモード）。 0〜2分、5パーセントB; 2〜20分、5〜95パーセントB（負イオンモード）。 質量分析計の動作パラメータは次のように設定されました。ガス温度、320度。 乾燥ガス、10 L / min; ネブライザー、35 psi; VCap、4000 V; フラグメント、120V。
生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンB.07。00（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）で運用されました。 生データはXCMSプラットフォームによって前処理されました。 正規化されたデータの主成分分析（PCA）と部分最小二乗判別分析（PLS-DA）は、MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）を使用して実行されました。 文献と組み合わせると、代謝物の差異（VIP> 1、T検定P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">
