パート1：NF-κBおよびAP-1経路の活性化を介したヒトケラチノサイトおよびメラノーマ細胞におけるケルセチン3-O - - D-グルクロニドの抗炎症、抗酸化、保湿、および抗メラニン形成効果
Mar 21, 2022
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概要: ケルセチンケルセチンのグルクロニド抱合体である3-O- - D-グルクロニド（Q -3- G）は、抗炎症薬リポ多糖で刺激されたマクロファージの特性、ならびに抗癌および抗酸化特性。 皮膚保護効果を含む幅広い薬理活性を有すると広く記載されているケルセチンとは異なり、皮膚におけるQ-3-Gの薬理学的利点およびメカニズムはまだ解明されていません。 この研究は、Q -3-UVB誘発性またはH2O2-誘発性の酸化ストレス、水分補給効果、および抗腫瘍形成ヒトケラチノサイト（HaCaT）および黒色腫（B16F10）細胞を使用した活動。 Q -3- Gは、炎症性遺伝子と、シクロオキシゲナーゼ-2（COX -2）や腫瘍壊死因子（TNF）-などのサイトカインの発現をHOまたはUVB-でダウンレギュレートしました。照射されたHaCaT細胞。 また、O -3- Gexhibitsは、フリーラジカル捕捉アッセイ、フローサイトメトリー、および核因子赤血球2-関連因子2（Nrf2）の発現増加を使用して抗酸化作用があることを示しました。 Q -3- Gは、メラノサイト刺激ホルモン（-MSH）によって誘発されたB16F10細胞のメラニン生成を減少させました。 Q -3- Gの水和効果とメカニズムは、トランスグルタミナーゼ-1（TGM -1）、フィラグリン（FLG）、ヒアルロン酸合成酵素などの保湿因子関連遺伝子を評価することによって調べられました。 （HAS）-1。 さらに、Q -3- Gは、MAPK / APに関与するc-Jun、Jun N末端キナーゼ（JNK）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）キナーゼ4（MKK4）、およびTAK1のリン酸化を増加させました。 -1経路、およびNF-kB経路に関与するIkB、IkBキナーゼ（IKK）-、Akt、およびSrcのリン酸化。 まとめると、Q -3- Gは、NF-kBおよびAP -1経路を介して、ヒトのケラチノサイトおよびメラノーマ細胞において抗炎症、抗酸化、保湿、および抗メラニン形成の特性を発揮することを示しました。
キーワード：ケルセチン3- O- -D-グルクロニド;UV保護; 保湿; 抗腫瘍形成; AP -1; NF-kB
1.はじめに
体の最大の器官である皮膚は、外部環境や紫外線、感染性微生物、有害な化学物質などの有害な要因から体を保護する上で主要な役割を果たすバリアを提供します。 このバリアはまた、体の電解質バランスと温度を調節し、水分の損失を防ぎます[1,2]。 人間の皮膚は、表皮、付属肢のある真皮、皮下組織の3つの層で構成されています[3]。 表皮層は体温を維持する上で重要な役割を果たしています。
皮膚表皮に豊富に含まれる成分であるケラチノサイトは、効果的な物理化学的バリアを可能にするデスモソームとタイトジャンクションを介して他のケラチノサイトと緊密に相互作用します[4]。 皮膚は保護バリアとして機能しますが、紫外線（UV）放射は、皮膚の外層であるケラチノサイトを含むほとんどの細胞に大きな影響を及ぼします。 紫外線は、皮膚の老化、皮膚の損傷、しわ、色素沈着過剰を引き起こす可能性があります。これは、最も検閲のリスク要因の1つと考えられています[5]。UV光は、UVA（320-400 nm）、UVBの3つの波長範囲で構成されます。 （280-320 nm）、およびUVC（200-280 nm）。 酸化ストレスに寄与することが知られている過酸化水素（H2O2）に加えて、UVBはROS生成酵素の活性化を通じて活性酸素種（ROS）の生成につながる可能性があります[6]。 ケラチノサイトを含む細胞におけるROSの制御されない蓄積は、脂質、タンパク質、核酸、およびその他の細胞内分子に酸化的修飾を引き起こし、その後、細胞死、酸化ストレスなどのさまざまなタイプの皮膚損傷および老化関連プロセスを引き起こすことが報告されています。と炎症[7,8]。 さらに、酸化ストレス応答は、さまざまな細胞成分の損傷に影響を与えることが知られています[9]。 損傷した皮膚細胞はまた、炎症反応を引き起こし、慢性的に損傷した皮膚をもたらす可能性があります[10]。 生物学的プロセスを介したUVBまたはH2O2-を介した皮膚損傷の1つのタイプは、シクロオキシゲナーゼ-2（COX -2）や炎症性サイトカインなどの炎症性遺伝子の発現です[11]。 したがって、UVBまたはH2O2を介した皮膚の損傷に関連する疾患を予防および阻止するには、より安全で、より堅牢で、効率的な皮膚保護効果の開発が不可欠です。
皮膚の水分補給も、その正常な機能を維持する上で重要な役割を果たします。 特に、角質層（SC）は水分喪失に対する保護効果があります[12]。 角質層の水分含有量は皮膚の落屑と適切な成熟に関与しますが、SCの水分不足は角質細胞の蓄積と機能不全を促進します[12、13]。 ケラチノサイト分化の最終段階で、その原形質膜と細胞小器官が消失し、カルシウムの流入により、他のタンパク質と架橋するためのトランスグルタミナーゼ（TGM）が誘導されます。 TGM -1の欠損または喪失は、細胞包囲の架橋不良につながります。 層状魚鱗癬は、TGMの喪失によって引き起こされる病気の例です-1。 さらに、形成されたケラチンマトリックスであるフィラグリン（FLG）は、g-グルタミルリジン架橋反応、ATGM、および膜を触媒することにより、角質化エンベロープタンパク質および脂質[14]に結合する足場として機能するため、SC形成において役割を果たします。 SCに完全性を与える関連酵素[15]。 さらに、ヒアルロン酸（HA）は、皮膚の保湿に関与する天然水分因子（NMF）の一種であり、内因性の皮膚老化において明確なプロファイルを示し、薬物送達剤であり、細胞外マトリックスの重要な成分です。 [16,17]。 HAは、ヒアルロン酸合成酵素（HAS）遺伝子を調節することにより、皮膚の水分を増加させる役割を果たします。 さらに、レチノイン酸（ビタミンA）は表皮のHAを効果的に調節することができます[17]。 TGM -1、FLG、およびHAS -12、3は、NMF生成に関連する遺伝子です[18]。 さらに、アクチベータータンパク質-1（AP -1）や核因子（NF）-kBなどの転写因子の活性化は、皮膚のバリアと皮膚の水分補給を最適化する炎症誘発性物質の産生に関与していますAP-1およびNF-kB経路を介して[19]。 AP -1経路の上流シグナル伝達酵素には、c-Jun N末端キナーゼ（JNK）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、p38などのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）が含まれますが、Src、 Akt、IkBキナーゼ（IKKo /）、およびKBO（IkBa）はNF-KB経路に属します[20。 皮膚はまた、表皮層、特にメラニンの主要な供給源であるメラノサイトでメラニンを生成し、これが皮膚の色とメラニン形成の決定に寄与します[21]。 UVB照射とメラノサイト刺激ホルモン（o-MSH）はメラニン分泌を刺激し、それによってメラニン形成を誘発することができます[22。 メラニン形成中、-MSHはプロテインキナーゼA（PKA）、タンパク質微小眼球関連転写因子（MITF）、およびcAMP応答エレメント結合（CREB）を活性化します[23]。 メラニンの機能の一つは、日光を含む紫外線による皮膚の損傷を防ぐことであると考えられています。 しかし、老化、メラノサイト刺激ホルモン、およびUV曝露によって引き起こされるメラニンの過剰産生またはメラニン含有量の欠如は、そばかす、肝斑、老人性レンチギン、および外観と皮膚に悪影響を与える可能性のある他の色素脱失障害を促進します健康[24]。 したがって、メラニン形成を制御することは、人体の健康および美容上の外観の両方を維持するためにも望まれる。
ケルセチンは、野菜、果物、飲料、薬用植物に存在する主に割り当てられたフラボノールタイプのフラボノイドです[25]。 その結果、ケルセチンは、抗炎症、抗アテローム性動脈硬化症、酸化防止剤、抗癌、および皮膚保護特性であり、メラニン形成に関連しています[24、26-29]。 しかし、感度が高く信頼性の高い方法を使用したいくつかの研究では、ケルセチンは血漿では検出されておらず[30-33]、脳ではほとんど検出されていないことが示されています[34,35]。 一般に配糖体の形で現れるケルセチンは、よく吸収され、ほとんどが小腸、結腸、肝臓、腎臓で加水分解されて、抱合された代謝物に代謝されます[3 0、36-38]。 循環血液では、ケルセチンアグリコンまたはその配糖体ではなく、グルクロニドまたは硫酸塩（それぞれメチル化または非メチル化）などの抱合代謝物のみが検出されます。 3 /-メチル-ケルセチン-3-グルクロニド、ケルセチン-3-グルクロニド、およびケルセチン-3'-硫酸塩は、揚げタマネギの摂取から1.5時間後に主要な血漿代謝物として同定されました[30、 32]。 これらのケルセチン代謝物は、フェーズII代謝の結果として、UDP-グルクロニルトランスフェラーゼを含む生体内変化酵素によって小腸と肝臓で形成されます[29、39、40]。 また、タマネギを食事と一緒に1週間定期的に摂取した後、ケルセチンの抱合代謝物が10-'から10-度Mの濃度範囲でヒト血漿に蓄積することが報告されました[41]。 ケルセチン代謝物の半減期は非常に長く、約11〜28時間です[29]。 これらの化合物は共役ケルセチン代謝物の主な形態として観察されているため、これらの共役代謝物を使用したフラボノールの生物活性に焦点を当てた研究が不可欠であり、共役ケルセチン代謝物の1つの生物活性を研究するようになりました。 主に血漿および肝臓、腎臓、脳などの組織に見られる最も豊富なグルクロニド代謝物の1つは、ケルセチン3- O - - D-グルクロニド（Q -3- G）（図1）です。 [31,35,40,42,43]、これは、異なるモデルの親化合物と比較して、同様の、より強い、またはより弱い活性を生成する可能性があります。 Q -3- Gは血漿を介して標的組織に輸送され、その生物学的活性を発揮します[39]。 O -3- Gは、ケルセチンの経口投与後のラット血漿中の有効な代謝物であることが示されています[43]。 他の研究では、Q -3- G含有代謝物は、ケルセチンが豊富な食品の投与後に大動脈に蓄積することがわかり、0からの範囲のヒト血液で検出される有効成分として特定されました。{{48} }μM【44】。 さらに、Q -3- Gは、ワイン[45]や、オトギリソウ、オトギリソウ、マツヨイグサ、サヤインゲン[46-49]などの薬用植物に含まれています。Q-3- G LPS刺激条件下での抗炎症成分として説明されており、血漿中で抗酸化作用を示しました[50-52]。 ただし、ケルセチンの適用の長い歴史と幅広い研究と比較して、Q-3-Gの研究はまだ調査されていません。 したがって、Q -3- Gは、ケルセチンのアクティブなinvivoプレーヤーとしてケルセチン代謝物の代表として選択されました。 さらに、皮膚保護効果に対するQ-3-Gの役割もまだ完全には解明されていません。 この研究では、さまざまなin vitro評価を使用して、UVBor H2O2-によって誘発される酸化ストレスと炎症に対するQ-3-Gの皮膚保護効果、HaCaT（ヒトケラチノサイト細胞株）の皮膚水和を調査しました。細胞、およびB16F10（マウスメラノーマ細胞株）細胞における抗腫瘍形成活性。
2.結果
2.1.UVBまたはH2O2-で刺激されたHaCaT細胞に対するQ-3-Gの抗炎症および抗酸化効果
皮膚組織は紫外線によって損傷を受ける可能性があります。 紫外線は、酸化ストレス、アポトーシス細胞死、炎症、皮膚の老化など、いくつかの有害な要因を活性化します。 Q -3- GのUV保護活性を決定するために、最初に、Q-3-Gがヒトケラチノサイトの細胞生存率に何らかの影響を与えるかどうかを評価しました。 3-（4-5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニル-243臭化テトラゾリウム（MTT）アッセイを使用して、細胞毒性効果を調査しましたHaCa細胞におけるO-3-Gの分析。 図2aに示すように、Q-3-Gによる2.5-20uMの濃度では、細胞生存率に有意な干渉はありませんでした。これは、O-3-Gが最大で細胞毒性を示さなかったことを示しています。 20μMで、皮膚細胞の表層であるケラチノサイトに害を与えませんでした。 次に、UVBに曝露されたHaCaT細胞におけるQ-3-Gの皮膚保護効果を評価しました。 30mJ /cm²でのUVB照射後、Q -3- Gは濃度依存的にUVB誘発細胞死からHaCaT細胞を有意に保護しました（図2b）。 MTTアッセイと一致して、顕微鏡に接続されたカメラを使用してHaCaT細胞の形態をキャプチャし、Q -3- Gは10μMの濃度までUVB照射されたHaCaT細胞による細胞死から保護しました（図2c） 。 各条件下でのHaCaT細胞の数は、未処理グループで482、UVB 30 mJ / cmグループで91、UVB 30mJ/cm²プラス5μMO-3-Gグループで276、UVB30で320でした。 mJ/cm²プラス10μMQ-3-Gグループ（図2d）。 これらの結果は、Q -3- GがUVBによって誘発されるHaCaT損傷を抑制し、UVB照射から皮膚保護効果を救うことを確認しました。
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
体内の炎症の発生と悪化は、時折マクロファージを活性化し、いくつかのサイトカインを放出します。 炎症は酸化ストレスの特徴です。 UVBまたはHO2-によって誘発される炎症に対するQ-3-Gの抗炎症効果を調査しました。 UVBが皮膚細胞のDNA損傷や炎症を促進することはよく知られています【10】。 HaCaT細胞にUVB30mJ/cm²を照射し、HaCaT細胞をH2O2（500 uM）でインキュベートしました。 リアルタイムPCRアッセイを使用して、炎症性酵素COX-2および炎症性サイトカインTNF-のmRNA発現をチェックしました。 図2e、fの結果に示されているように、10μM濃度のO -3- Gは、COX-2およびTNF-のmRNA発現を有意に阻害しました。 その結果、Q -3- Gは、UVB照射またはH2O2への曝露後にHaCaT細胞に誘発される炎症反応を抑制しました。
2,2'-アジノビス-（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）および2、2-ジフェニル-リピクリルヒドラジル（DPPH）ラジカルスカベンジングアッセイを使用しました-広く使用されているモデルシステム天然化合物のinvitroでのスカベンジング活性を調査するため—さまざまな濃度でのQ-3-Gの抗酸化特性を評価するため。 HaCaT細胞は、DPPHの存在下で2。5-40μMから濃度依存的にQ -3- Gで処理され、その結果、2.5 uMを超える有意なスカベンジング活性が示されました（図2g）。 。 ABTSアッセイはまた、濃度依存的にフリーラジカル捕捉に対するQ -3- Gの効果を有意に示し、IC50値は1.75μMでした（図2h）。 ポジティブコントロールとしてのアスコルビン酸（AA）は、DPPHおよびABTSアッセイの両方で最大の抗酸化効果を示しました。 抗酸化応答エレメント（ARE）依存性遺伝子の1つである核因子赤芽球2-関連因子2（Nrf2）は、保護酸化還元酵素とその求核性基質を調節し、それによって抗酸化酵素を促進して損傷と修復を除去することが報告されていますシステム[53]。 次に、UVBを照射したHaCaT細胞におけるNrf2の発現レベルを調べました。 上記の発見を強化するために、O -3- Gは、UVB照射時のNrf2の発現レベルを、コントロールと比較して、濃度依存的に最大10 uMまで大幅に増強しました（図2i）。これは、Q -3- Gは、化学的および生物学的にフリーラジカル捕捉特性を備えた抗酸化作用を示し、それぞれNrf2-依存性AREシグナル伝達の保護作用を高めます。 さらに、UV条件でジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（DCFDA）を使用してROSフローサイトメトリーも実行しました。 抗酸化剤は、ROS産生を阻害することによって細胞ストレッサーを抑制することが広く知られています[54]。 結果は、5および10μMの濃度でQ -3- Gで処理すると、UVBによって誘発されるROSのレベルが低下することを示しました（図2j）。 まとめると、これらのデータは、Q -3-がH2Oに対する抗炎症作用や抗酸化作用、またはHaCaT細胞におけるUVB誘発性の酸化ストレスや炎症などの皮膚保護特性を発揮することを示唆しています。
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2.Q-3-GのB16F10における抗ラノジェネシス効果とHaCaT細胞における保湿効果
メラニン形成に対するO-3-Gの効果を調べるために、メラノーマ細胞を-MSHで48時間処理して、B16F10細胞にメラニンを分泌させました。 MTTアッセイを採用することにより、Q -3- Gが最大20μMの濃度で48時間B16F10細胞に細胞毒性を持たないことを最初に確認しました（図3a）。 この結果は、次の評価のために、B16F10におけるO-3-Gの影響が細胞死によるものではないことを示しました。 次に、Q -3- Gand -MSHを使用してB16F10を48時間評価し、メラニン形成に対するQ-3-Gの影響を調べました。 図3bに示すように、Q-3-Gはメラニン分泌を有意に抑制しました。 陽性対照のアルブチンはまた、メラニン分泌を有意に減少させた。
肌の水分に関連する分子はヒアルロン酸（HA）です。 前述のように、表皮と真皮全体に分布するHAは、皮膚の水分補給を促進するNMFです[55]。 逆転写PCR（RT-PCR）アッセイを使用して、最大30uMのQ-3-Gの濃度で12時間後のHAS-1の転写レベルを調べました。 HASはケラチノサイト内の中間サイズのHAの蓄積を促進します[12]。 図3cに示すように、HAS -1の発現は、Q -3- Gで10μMまで処理することで増加しました。保湿因子に加えて、FLGとTGM{{の発現も調べました。 13}}。 陽性対照群としてレチノールを使用しました。 FLGおよびTGM-1の転写レベルは、最大10μMの濃度のQ -3- Gで処理した後に著しく増加しました（図3d）。 これらの発見は、Q-3-GがHaCaT細胞で皮膚保湿活性を持っていることを示唆しています。 さらに、SB203580（p38阻害剤）、SP600125（JNK阻害剤）、UO126（ERK阻害剤）、およびBay 11-7082（NF-kB阻害剤）を使用して、保湿におけるMAPKおよびNF-kBシグナル伝達経路の関与を調べました。 Q-3-Gで処理されたHaCaT細胞の因子。 O -3- G誘導遺伝子発現に基づいて、TGM -1とFLGの両方のレベルがJNK阻害剤であるSP600125での処理によって減少し（図3e）、JNKが発現を増加させる必要があることを示唆していますO-3-Gの皮膚保湿効果の観点からTGM-1とFLGの比較。 さらに、FLGの発現はIKKとIkBの阻害剤であるBay 11-7082によっても減少し、Q-3-Gの薬剤メカニズムもNF-kBシグナル伝達経路に属する可能性があることを示唆しています。
2.3。AP-1とNF-kBの活性化を介したQ-3-Gの保湿関連シグナル伝達経路
以前のmRNAの結果に基づいて、Q-3-Gの水和効果に対するAP-1およびNF-kBシグナル伝達の関与がタンパク質レベルでも発生する可能性があると仮定しました。 ウエスタンブロットアッセイを使用して、AP-1およびNF-kBの上流分子のリン酸化を調べました。 まず、AP -1経路では、HaCaT細胞をQ -3- Gと24時間インキュベートした後、c-Junのリン酸化が増加しました（図4a）。 p-INKのレベルは、2.5、5、および10μMの濃度のQ-3-Gで処理した後にも増加しました。 JNKの全体的な形態は変わりませんでした（図4b）。 さらに、JNKの上流調節因子であるMKK4とTAK-1のリン酸化を調べました。 図3cに示すように、HaCaT細胞をO -3- Gで処理した後、p-MKK4とp-TAK1のタンパク質レベルもアップレギュレーションされました。
NF-kBシグナル伝達に加えて、Q -3- Gは、NF-kBのサブユニットであるp50およびp65のリン酸化を増加させました（図4c）。 さらに、IKKとIkBaの活性化を評価しました。これらも、対照群と比較して10uMまでQ-3-G増加しました（図4d）。 最終的に、NF-kBシグナル伝達経路に関与する上流分子の活性化を決定しました。 SrcおよびAkt（Ser473）のリン酸化は、O -3- G処理によって強化されました（図4e）。 全体として、これらのデータは、Q -3- Gの皮膚保護効果がタンパク質レベルを増加させることによってTAK1とSrcの活性化を標的とし、それによってそれぞれAP-1とNF-kBの活性をアップレギュレートすることを示しています。
2.4.AP-1およびNF-kBの転写活性化に対するQ-3-Gの効果
MTTアッセイにより、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293T細胞におけるQ -3- Gの細胞毒性を調査しました（図4f）。 HEK293T細胞の生存率は、未処理の細胞と比較して、Q -3- G（2。5-20μM）で処理した後、有意な影響を受けませんでした。
ルシフェラーゼアッセイを使用して、Q-3-GがNF-kBおよびAP-1プロモーターアッセイを調節できるかどうかを判断しました。 O -3-GがAP-1-を介したルシフェラーゼ活性（図4g）とNF-kBを介したルシフェラーゼ活性（図4h）を濃度依存的に増加させることを確認しました。 これらの結果は、AP-1の活性化とNF-KBの活性化がQ-3-Gの重要な薬理学的標的であることを証明しています。
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