パート1ラットのストレプトゾトシン-ニコチンアミド誘発糖尿病におけるJacarandaMimosifoliaファミリーBiognoniaceaeからのアクテオシドの抗糖尿病および抗酸化効果

Verbascum配糖体の抗糖作用と抗酸化作用はどのように反映されますか？

Salma A. El-Marasy1、Siham M. El-Shenawy1、Fatma A. Moharram2、Nagla A. El-Sherbeeny3 * 1薬理学部、国立研究センター、ギザ、エジプト。 2エジプト、ヘルワンのヘルワン大学生薬学部生薬学科。 3エジプト、イスマイリア、スエズ運河大学医学部臨床薬理学科

概要

バックグラウンド： アクテオシドから単離されたフェニルエタノイド化合物ですジャカランダ mimosifolia D.ドンは潜在的な抗糖尿病効果を残します。

目的：この研究は、の抗糖尿病および抗酸化効果を調査するために設計されましたアクテオシドストレプトゾトシン-ニコチンアミド（STZ-NA）によって誘発されたラットの2型糖尿病。

方法：糖尿病は、NA（25 mg / kg）の腹腔内投与の15分後に、STZ（52.5 mg / kg）の単回投与の腹腔内（ip）注射によって誘発されました。 ラットは6つのグループに分けられました。 グループI：正常ラットグループがビヒクルを投与され、グループII：糖尿病対照グループ、およびグループIII-IV：糖尿病ラットグループがいずれかの経口投与により治療されたアクテオシド（10、20、および40 mg / kg）またはピオグリタゾン（30 mg / kg）を21日間連続で投与。 生化学的パラメーターは、血清および肝臓ホモジネートで評価されました。 組織病理学のための肝臓切片の検査も実施された。

結果：アクテオシド治療を受けたラットは、対照の糖尿病ラットと比較して、有意に低いレベルの血糖、糖化ヘモグロビン、総コレステロール、トリグリセリド、および増加した血清インスリンを示した。 さらに、アクテオシド糖尿病対照と比較して、処置されたラットは、マロンジアルデヒドの有意な減少、グルタチオン肝臓含有量の減少の増加、および肝臓の病理学的変化の減弱を示した。 これらの効果は、標準的な抗糖尿病薬であるピオグリタゾンによって引き起こされる効果と同等でした。試験管内で, アクテオシド除去された安定フリーラジカル1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル。

結論：アクテオシド2型糖尿病の潜在的な治療薬と見なすことができます。 ただし、その抗糖尿病効果の根底にあるさらなるメカニズムを研究することをお勧めします。

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序章

糖尿病は、世界中の約4億5000万人の成人が罹患している慢性代謝障害です。 その数は2045年までに6億2900万に達すると予想されています[1]。 この疾患は、膵臓ベータ細​​胞からのインスリン出力の低下および/またはインスリン作用に対する組織の抵抗性によって誘発される高血糖症を特徴とします。 2型糖尿病は、すべての糖尿病症例の90〜95パーセントに見られます。 糖尿病は、大血管および微小血管（腎症、神経障害、網膜症）の合併症のリスクが高いことに関連しています[2]。 ライフスタイルの変更、薬理学的治療、および注意深いモニタリングは、糖尿病管理の主力です。 目標の血糖コントロールを達成することは、糖尿病合併症を予防するのに役立つか、少なくとも遅らせることができます[3]。 現在の抗糖尿病薬の利点にもかかわらず、すべてのクラスには望ましくない副作用があります。 したがって、2型糖尿病の新しい治療法を探す必要があります。 新薬は、最小限の副作用と手頃な価格で効果的でなければなりません。 糖尿病患者は、特に薬のコストが実際の課題を課す分野で、血糖コントロールを改善すると考えられている自然療法を使用します[4]。 ジャカランダ属（ノウゼンカズラ科）は、主に熱帯および亜熱帯の地理的地域で見られます。 Jacaranda mimosifoliaはブラジル原産ですが、エジプトでは観賞用の木としても栽培されています。 アクテオシド（ベルバスコシド）は、J。mimosifoliaの葉から分離されました[5]。 抗炎症作用[6]、[7]、肝保護作用[8]、抗酸化作用[9]、抗腫瘍作用[10]、神経保護作用[11]など、アクテオシドのさまざまな有望な活性が以前の研究で報告されました。 以前の報告は、アクテオシドの潜在的な抗高血糖効果を示しています。 たとえば、アクテオシドは、抗糖尿病薬と相関する活性である、invitroでのタンパク質糖化を防止しました[12]。 さらに、アクテオシドを含む植物抽出物は、実験的な2型糖尿病において抗高血糖効果を示しました[13]。 さらに、アクテオシドの潜在的な血糖降下作用のより直接的な試験が、森川らによる研究で報告されました。 [14]; マウスにデンプン負荷と同時に与えられた毎日の経口アクテオシドの2週間後、耐糖能は体重の有意な変化なしに改善されました。 ただし、アクテオシドの抗糖尿病効果は、実験的な糖尿病モデルではまだ調査されていません。 したがって、この作業は、ストレプトゾトシン-ニコチンアミド（STZ-NA）によって誘発された2型糖尿病のラットモデルにおけるアクテオシドの抗糖尿病および抗酸化効果を調査することを目的としています。

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材料および方法

動物

現在の研究では、オスのWistarアルビノラット（体重180〜210 g）を使用しました。 ラットは国立研究センター（カイロ、エジプト）の動物飼育施設から購入した。 動物を標準化された条件で飼育し、実験を開始する前に実験室で7日間順応させた。 ラットは、標準的な餌ペレットと水を自由に摂取できた。 実験プロトコルとすべての動物の手順は、エジプトの国立研究センターの倫理委員会によって承認されました（承認番号：18/042）。 委員会のガイドラインは、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドに沿っています。

材料

STZはSigma-Aldrich（ミズーリ州、米国）から、NAはBayer Schering Pharma（スイス、ヨーロッパ）から、PioglitazoneはAmoun Pharmaceutical Industries Co.（カイロ、エジプト）から調達しました。 アクテオシドの純粋なサンプルは、4番目の著者によって提供されました。 J. mimosifoliaの葉からのアクテオシドの分離は、MoharramとMarzoukによって以前に報告されたように実行されました[5]。 他のすべての化学薬品と試薬は分析グレードのものでした。

糖尿病の誘発

12時間の絶食後、0 .1mol / Lクエン酸緩衝液（pH 4.5）に溶解したSTZ（52.5 mg / kg）の単回腹腔内投与によって糖尿病がラットに誘発されました[15]。 STZはNA（25 mg / kg）の腹腔内注射の15分後に与えられました[16]。 STZ注射の次の24時間後、低血糖ショックから生じる可能性のある死亡のリスクを克服するために、5パーセントのブドウ糖溶液がラットに与えられました。 STZ注射の48時間後、携帯型血糖計を使用して尾静脈から採取した血液サンプルの血糖値を推定しました。 ラットは、空腹時血糖値が250 mg/dL以上の場合にのみ糖尿病と見なされました。

実験計画

ラットの体重を測定した後、それらをランダムに6つのグループに分けました（グループあたり6匹のラット）。グループI：通常のコントロールとして使用しました（蒸留水のみを与えた場合）。 グループII：糖尿病対照群; グループIII-V：経口アクテオシドでそれぞれ3週間（10、20、および40 mg / kg）治療された糖尿病ラット。 グループIV：経口ピオグリタゾン（30 mg / kg）で3週間治療された糖尿病ラット。 ビヒクルは、正常および糖尿病の対照ラットに与えられた。 アクテオシドまたはピオグリタゾンの治療は、高血糖の確認後、STZ注射の48時間後に開始されました。 アクテオシドとピオグリタゾンの用量は、Liuらによって以前に発表されたデータに従って選択されました。 [17]そしてVidal等による。 それぞれ[18]。

体重の変化初期体重

実験開始前に各ラットの体重を測定することにより決定した。 さらに、各ラットの最終体重は、研究計画に従って、ビヒクルまたは治療のいずれかの最後の投与の24時間後に推定された。 体重の変化率は次のように計算されました。

生化学的分析

血糖値

グルコースレベル（mg / dl）は、Trinder [19]の方法に基づいて、（Biodiagnostic、Egypt）から購入したキットを使用して比色分析で測定しました。

血清インスリンレベル

血清インスリンレベル（µIU / ml）は、酵素結合免疫吸着キットラットインスリン（INS）ELISA（Cusabio Biotech Co.、Ltd.、Hubei、China）により、製造元のプロトコルに従って測定されました。 糖化ヘモグロビン値（HbA1c）糖化Hb値（ng / ml）は、Glory Scienceから購入した（Rat [HbA1c] ELISA）を使用して、製造元のプロトコルに従って推定しました。 血清トリグリセリドおよび総コレステロールレベルトリグリセリドレベル（mg / dl）および総コレステロールレベル（mg / dl）は、酵素法を使用して決定されました。 エジプトのBiodiagnosticの診断キットは、FossatiとPrencipeの方法[20]に従って使用されました。

組織ホモジネートの調製

氷冷0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.4）。 次に、ホモジネートを冷却遠心分離機（2k15; Sigma / Laborzentrifugen）で4000rpmで5分間遠心分離しました。 次に、上清を使用して、マロンジアルデヒド（MDA）および還元型グルタチオン（GSH）の肝臓含有量を測定しました。 すべてのラットを麻酔下で断頭して犠牲にし、次に肝臓を摘出した。 肝臓の一部をホモジナイズしました（20％w / v）

肝臓の過酸化脂質含有量

肝臓のMDA含有量（ナノモル/肝臓組織のグラム）は、エジプトのBioDiagnostic Co.から購入した診断キットを使用して佐藤[21]によって説明されているように、比色分析で決定されました。

肝GSHコンテンツ

肝臓の減少したGSH含有量（mmol / g肝臓組織）は、Beutleretal。による比色法によって推定されました。 [22] BioDiagnostic Co.、Egypから購入したキットを使用

抗酸化作用の評価（invitro）

1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）ラジカル捕捉活性は、Peiwuetal。 [23]。 化合物が水素を提供できる抗酸化剤である場合、DPPHと反応します。 この反応により、DPPHの色が濃い紫色から黄色に変化します。 この色の変化は、517nmで分光光度計を使用して測定されました。 0。1M濃度のアスコルビン酸が標準でした[24]。 DPPHラジカル捕捉活性は、次の式に従って計算されました。ラジカル捕捉活性パーセント=（Ac-At）/ Ac×100（1）ここで、AcとAtは、それぞれコントロール（DPPH）とアクテオシドの吸光度です。

組織病理学的検査

肝臓組織をラットから採取し、10％ホルムアルデヒドで24時間固定しました。 次に、組織を処理して4 µmのパラフィン包埋切片を得ました。 組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色し、光学顕微鏡を使用して検査した[25]。

統計分析

結果は、グループあたり6匹のラットの平均±SEMとして表されます。 3つ以上のグループ間の比較は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して実行されました。 すべての分析は、Windows用のGraphPad Prism 6. 0統計パッケージ（GraphPad、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行われました。 統計的有意性はp<>

cistanche関数：アクテオシドできる老化防止

結果

体重に対するアクテオシドの効果

図1は、NA（25 mg / kg）のip注射の15分後にSTZ（52.5 mg / kg）の単回ip投与によって誘発された糖尿病が、体重のパーセンテージの11による有意な体重減少をもたらしたことを示しています。{ {6}}±1.32の糖尿病誘発の3週間後。 一方、正常なラットは、22.74±1.85の体重パーセントの有意な増加を示しました。 アクテオシドを10、20、および40 mg / kgの用量で21日間連続して糖尿病ラットに経口投与した結果、体重の割合が19.05±1.14、16.92±1。00、およびそれぞれ22.98±1.21。 同様に、30 mg / kgで経口投与されたピオグリタゾンは、体重のパーセンテージで25.59±2.13の有意な増加を示しました。

血糖値、インスリンレベル、およびHbA1cに対するアクテオシドの効果

表1に示すように、糖尿病ラットは318.70±13.8mg / dlのレベルまで血糖値の有意な上昇を示しましたが、正常ラットの平均レベルは81.51±4.15 mg/dlでした。 アクテオシド（1 0、2 0、および4 {{4 0}} mg / kg）による3週間の経口治療により、血糖値が111.3 {{5 0}}±0。61、74.88±3.23、および75.15±8.45 mg / dl、対対照値。 さらに、ピオグリタゾン（3 0 mg / kg）は、糖尿病ラットの対照値に対して、血糖値を103。00±3.12mg/dlに低下させました。 血清インスリンレベルに関して、対照糖尿病ラットは、1.25±0.07 µIU / mlの有意に低下した血清インスリンレベルを示したが、正常ラットは5.32±0.27 µIU/mlであった。 アクテオシド（10 mg / kg）による経口治療は、対照の糖尿病群および正常群と比較して、血清インスリンレベルが3.23±0.06 µIU/mlと有意に上昇する結果となりました。 20 mg / kgの用量のアクテオシドは、糖尿病ラットの対照値に対して、血清インスリンレベルを5.38±0.21 µIU/mlに回復させました。 アクトシド40mg/ kgによる経口治療は、対照の糖尿病および正常値と比較して、血清インスリンレベルを6.80±0.20 µIU/mlに有意に増加させました。 ピオグリタゾン治療により、血清インスリンレベルが8に有意に増加しました。00±0.16 µIU / ml対対照糖尿病および正常値（表1）。 表1に示すように、対照糖尿病ラットは、平均正常値3.36±0.21 ng / mlと比較して、HbA1cレベルが40.30±3.39 ng/mlと有意に上昇していました。 10および20mg/ kgの用量のアクテオシドは、対照糖尿病ラットおよび正常ラットの値に対して、それぞれ24.12±1.88 ng/mlおよび16.72±1.06ng/mlであるHbA1cレベルの有意な上昇を示しました。 アクテオシド（40 mg / kg）は、対照の糖尿病ラットと比較して、HbA1cレベルを10.18±0.92 ng/mlに大幅に低下させました。 同様に、ピオグリタゾンは、対照糖尿病ラットの値に対して、HbA1cレベルを6.42±0.29 ng/mlに有意に低下させました。

総コレステロールおよびトリグリセリドレベルに対するアクテオシドの効果

総コレステロールおよびトリグリセリドに対するアクテオシドの効果を表2に示します。対照糖尿病ラットは、正常値94.38±2.38 mg / dlと比較して、総コレステロールの有意な増加が139.35±4.28 mg/dlであることを示しました。 アクテオシド（10、20、および40 mg / kg）による経口治療は、対照の糖尿病ラットの値と比較して、総コレステロールレベルをそれぞれ96.24±1.08、90.62±1.60、および95.14±4.65 mg/dlに有意に減少させました。 同様に、ピオグリタゾン（30 mg / kg）は、糖尿病ラットの対照値に対して、総コレステロール値を96.80±4.17 mg/dlに回復させました。 トリグリセリドレベルに関して、対照糖尿病ラットは、正常値107.80±2。00 mg / dlと比較して、153.90±3.33 mg/dlであるトリグリセリドレベルの有意な上昇を示した。 アクテオシド（10、20、および40 mg / kg）による経口治療は、糖尿病ラットの対照値に対して、総コレステロールレベルを118.59±6.46、100.27±4.19、および91.89±3.20 mg/dlに回復させました。 さらに、ピオグリタゾンは、対照の糖尿病ラットの値に対して、トリグリセリドレベルを108.98±9.14mg/dlに回復させた。

肝臓のMDAおよびGSHに対するアクテオシドの効果

図2aに示されている結果は、対照糖尿病ラットが、正常ラット38.94±1.57 nmol / gと比較して、肝臓のMDA含有量を65.27±2.63 nmol/gに有意に上昇させたことを示しています。 アクテオシド（10、20、および40 mg / kg）による経口治療は、対照の糖尿病ラットの値に対して、肝臓のMDA含有量をそれぞれ32.63±2.14、36.14±2.75、および39.40±1.14 nmol/gに回復させました。

同様に、ピオグリタゾン（3 0 mg / kg）は、肝臓のMDA含有量をコントロールの糖尿病ラットの値に対して39.30±3.49nmol/gに回復させました。 肝臓のGSH含有量に関して、対照糖尿病ラットは、肝臓のGSH含有量を6.61±0。17 mmol / gに有意に減少させたが、正常値は8.69±0。16 mmol/gであった。 アクテオシド（1 0、2 0、および40 mg / kg）は、対照の糖尿病ラットの値に対して、肝臓のGSH含有量を8.99±0.37、8.30±0.21、および8.56±0.39 mmol/gに大幅に増加させました。 。 さらに、ピオグリタゾン（30 mg / kg）による経口治療は、肝臓のGSHを9に回復させました。00±0.30 mmol / g対対照糖尿病ラットの値（図2b）。

アクトシドのinvitro抗酸化活性

DPPHラジカル捕捉活性法を使用したアクテオシド対アスコルビン酸（0 .1 M濃度）のinvitro抗酸化活性を図3に示します。5分の反応時間後、さまざまな濃度のアクテオシド（200、150、 100、および50 mg / ml）は、それぞれ74.4、74、73、および72.3パーセントの最大反応反応率を示しました。 同様に、L-アスコルビン酸の反応速度は82.5％でした。

アクテオシドのcistanche多くの機能があります

肝臓の組織病理学的検査に対するアクテオシドの効果

正常なラットでは、組織病理学的変化は見られなかった。 実質の中心静脈および周囲の肝細胞の正常な組織学的構造が正常なグループで記録されました（図4a）。 対照糖尿病ラットの肝臓で記録された病理学的変化は、コラーゲン増殖に関連する中枢および門脈の重度の拡張および鬱血、ならびに門脈領域の過形成性胆管を取り巻く管周囲組織におけるわずかな炎症細胞浸潤であった（図4bおよびc ）。 アポトーシスは、びまん性細胞増殖に関連するいくつかの肝細胞で検出されました（図4d）。 それぞれアクテオシド（10、20、および40 mg / kg）で経口投与されたラットは、対照糖尿病群で観察された前述の組織病理学的病変（図4e、f、および5a-d）の顕著な減少を示しました（グループII）。 ピオグリタゾン治療を受けた糖尿病グループ（グループIV）は、門脈領域に炎症細胞の浸潤がほとんど見られませんでした（図5e）。 さらに、肝細胞の間にびまん性クッパー細胞の増殖がありました（図5f）。