PART 1 ほうきrapesから単離されたフェニルプロパノイド配糖体の抗酸化作用および抗凝固効果(オロバンチェ・カリオフィラセア、フェリパンチェ・アレナリア、およびP.ラモサ)

バルトシュ・スカルスキ a, シルヴィア・パウェレツ b, ダリウシュ・ジェドレイェク b, アガタ・ロルニク a, ロスチスラフ・ピエトゥホフ a,

レナータ・ピウォヴァルチク c, アンナ・ストクマル b, ベアタ・オラス a,*

a Ło'd'z大学, 一般生化学科, 生物学と環境保護学部, 90-236 Ł'od'z, ポーランド

b 生化学・作物品質学科, 土壌科学・植物栽培研究所, 国家研究所, 24-100 Puławy, ポーランド

ヤン・コチャノフスキ大学生物学研究所環境生物学部生物多様性研究センター, 25-406 Kielce, ポーランド

要約

オロバンチャ科のホロ寄生虫植物、チスタンチェ、Orobanche、およびPhelipanche sppは、フェニルプロパノイド配糖体(PPG)の豊富さで知られています。多くのPPG化合物は、抗菌、抗炎症、抗酸化、および記憶増強などの広範囲の活性を有することが見出されている。ヨーロッパのほうき菜類(O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR)および10個の単離フェニルプロパノイド成分の生理活性の可能性をよりよく調べるために、我々はそれらの抗ラジカル作用、in vitro系の血漿中の酸化に対する保護効果、および凝固パラメータへの影響を調査した。試験した抽出物は、トロロックスのパワーの50〜70%の消去活性を示した。OC抽出物には、アクテオシドは、アシル単位にB環カテコール部分を欠くPPGsを含む唯一のものであったPR抽出物よりも20%以上の優れた抗ラジカル能を有していた。さらに、H2O2/Feで処理されたヒト血漿中で抗酸化能を示したのは8つの試験済みPPGのみであることが判明した。しかし、試験された3つのPPGは、抗酸化特性に加えて抗凝固能を有していた。PPGの構造、特にアシルおよびカテコール部分の存在は、主にそれらの抗酸化特性に関連しているようである。これらの化合物の抗凝固能は、それらの化学構造にも関係している。選択されたPPGは、酸化ストレスに関連する心血管疾患を治療する可能性を示す。

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1. はじめに

酸化ストレスは、加速老化や一部の癌を含む生物の健康に悪影響を及ぼすことで広く知られています。酸化ストレスの発生は、身体の細胞における酸化機構と抗酸化機構(酵素的(カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ)および非酵素的(グルタチオン)防御を含む)との間のバランスの乱れと関連している[1]。酸化ラジカルや閉殻種を含む活性酸素種(ROS)の過剰産生は、酸化ストレスの形成の背後にある主なメカニズムの1つです。しかしながら、ROSによって引き起こされる生物学的効果は、濃度、曝露の時間、および場所に大きく依存する。通常の条件(低濃度)では、酸素/窒素ラジカルは二次メッセンジャーの役割を果たすことができますが、より高いレベルでは、細胞膜のような生物学的構造と反応し始める可能性があります[2]。すべてのROS種の中で、ヒドロキシルラジカル(HO.)は、タンパク質、脂質、およびDNAであるバイオ巨大分子に最大の損傷の1つを引き起こしている。酸化ストレスは、心血管疾患を含む様々な疾患において重要な役割を果たすことが知られている。血液系の障害は、止血および血漿バイオマーカーの様々なパラメータの変化によって相関および/または先行してきた[1,3]。

一方、ポリフェノールや多価不飽和脂肪酸などの多くの天然物質は、活性酸素種の生成および/または減少を防ぐことができる強力な抗酸化物質として同定されている。このような特性を有する化合物は、植物起源の多くの食品および医薬製剤中に見出される。したがって、新鮮な野菜や果物を豊富に含む食事、および天然の抗酸化物質に基づく抗酸化療法は、酸化ストレスのレベルを低下させ、さまざまな病態生理学的プロセスを防ぐことができるため、広く推奨されています[4,5]。植物ポリフェノールは二次代謝産物の多様なグループであり、その中でフェノール酸は広く分布しており、抗菌性、抗酸化性、抗炎症性などの様々な生物学的効果を示すため、重要な位置を占めています。フェニルプロパノイド配糖体(PPG)は、ヒドロキシ桂皮酸のエステル脱親戚であり、それらはホロ寄生虫性ハマウツボ科植物に存在する二次代謝産物の主/唯一のクラスである。チスタンチェ、オロバンチェ、フェリパンチェ属。この家族のいくつかの種は、農家が畑で取り除きたい作物の深刻な害虫(Phelipanche ramosaの例)であり、薬理学で使用されるものはほとんどなく、ほとんどは人間にとってほとんど重要ではありません。ハーブチスタンチェアジアの伝統医学では、腎不全の治療や免疫力および記憶増強剤、アンチエイジング剤、抗疲労剤として広く使用されています[6]。様々な研究グループの植物化学的分析により、アセトニド、エキナコシド、表彰台側などのフェニルプロパノイド配糖体がハーバシスタンチェの主な有効成分の1つであることが実証されています[7]。Jedrejekらによってポーランドで発見されたいくつかのほうき菜種の最近の研究 [8] は、この植物材料が同様の質的組成(PPGの支配)を有し、さらに、チスタンチェ活性物質の含有量に関して[8]。

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本研究は、様々なフェニルに富む3つのほうき菜抽出物(オロバンチェ・カリオフィラ科 – OC、Pheli-panache Arenaria – PA、およびP. ramosa – PR)の抗ラジカルおよび抗酸化能、ならびに止血パラメータへの影響を評価することを目的としていた。

プロスタノイド、ならびにそれらの単一のPPG成分。抗ラジカル容量は、2,2'-アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸/トロロックス等価物(ABTS/TE)および2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒブラジル(DPPH)試験を用いて測定した。血漿試験系における酸化ストレスをヒドロキシルラジカル(H2O2/Fe)を用いて誘導し、次いで脂質過酸化(チオバルビツール酸反応性種(TBARS)アッセイ)を行い、タンパク質カルボニル基およびチオール基のレベルを測定した。止血の決定されたパラメータの中には、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)、プロトロンビン時間(PT)、およびトロンビン時間(TT)があった。

2. 材料と方法

2.1 化学薬品

2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジルラジカル(DPPH)、2,2'−アジノビス−3−エス−イルベンズチアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)、過硫酸カリウム、6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸(トロロックス)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、チオバルビツール酸(TBA)、ギ酸(LC−MSグレード)、およびH2O2は、シグマ・アルドリッチ(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。メタノール(HPLCグラジエントグレード)およびアセトニトリル(LC-MSグレード)はメルク(ダルムシュタット、ドイツ)から入手した。テンフェニル-

2'-O-アセチルアクテオシド(97%)、2'-O-アセチルポリウモシド(98%)、3-O-メチルポリウモシド(96%)、アセトニド(99%)、アリーナ内部(97%)、クレナトシド(98%)、テニポシド(99%)、ポリウモシド(99%)、チューブロシドA(96%)、およびウィーデマンニオシドD(96%)を含むプロパン化合物は、以前に下記の植物材料から単離された[8]。化合物の純度は、UHPLC−PDA−MS分析を用いて評価した。超純水は、ミリQ浄水システム(ミリポア社製)を用いて社内で調製した。他の試薬は分析グレードのもので、国内の商業サプライヤーから提供されました。

2.2. 植物材料

Orobanche Caryophyllaceae Sm、Phelipanche Arenaria Pomel、P. Ramos (L.) Pomelを含む3種のほうき菜種の開花植物は、Renata Piwowarczyk教授(Jan Kochanowski Uni-versity、ポーランド、Kielce)によって同定され、ポーランドの自然源から収集されました。

バウチャー標本(O. Caryophyllaceae – Chomento'wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), 乾熱草原, 寄生ガリウム・ボレアーレ, May 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), psammoma-lous grassland and fallow, 寄生する Artemisia campestris, June 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), field, 寄生する Solanum Lycopersicum, September 2014) は、キェルツェのヤン・コチャノフスキ大学(KTC)のハーバリウムに寄託されている。植物材料を凍結乾燥し、抽出前に細かく粉砕した。

2.3 ほうき菜の抽出物の調製

粉末状の植物材料(O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g, P. ramosa (PR) – 3 g) を、ASE 200 加速を用いて 40 ◦C および 1500 psi (溶媒圧) で 80% MeOH で抽出した。

溶媒抽出器(ディオネックス、サニーベール、カリフォルニア州、米国)。抽出物を蒸発させ、凍結乾燥した(ガンマ2〜16 LSC凍結乾燥機、キリスト、ドイツ)。OC、PA、およびPRの抽出効率は、植物材料のそれぞれ55重量%、37重量%および43重量%であった。炭水化物の含有量が高いため(データは示さず)、生抽出物をオアシスHLBマイクロカラム(500mg;ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国)。糖を1%MeOHで除去し、次いで目的の化合物を80%MeOHで溶出した。溶媒を除去した後、OC、PA、およびPR抽出物を凍結乾燥し(ガンマ2〜16 LSC凍結乾燥機)、SPE精製の収率は53%(OC)、67%(PA)、および51%(PR)であった。

2.4 ほうき菜抽出物の植物化学的特徴

ほうき菜抽出物の定性的および定量的分析は、フォトダイオードアレイ検出器(PDA)に接続されたACQUITY UPLCシステム(Waters)およびタンデム四重極質量分析計(TQD-MS/MS)を用いて実施した。凍結乾燥OC、PA、およびPR抽出物を0.50mg/mLの濃度で50%メタノールに溶解し、次いで

BEH C18カラム(100 × 2.1 mm、1.7 μm、ウォーターズ)でクロマトグラフィー処理した。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった:オーブン温度−25◦C、

移動相A(H2O中の0.1%ギ酸)中の移動相Bの10→25%(アセトニトリル中の0.1%ギ酸)を12分間にわたって直線勾配、流速 - 0.4mL/分、注入量 - 2 μL、UV範囲 - 190〜490 nm(3.6 nm分解能)。MS分析は、次の設定を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)による負イオンモードで実行されました:スキャン範囲100〜1200 m/z。毛細管電圧2.8kV;コーン電圧35 V;

ソース温度 150 ◦C;脱溶媒和温度450◦C;脱溶媒

ガス流量900 L / h、コーンガス流量100 L / h。データの取得と処理は、ウォーターズMassLynx 4.1ソフトウェアを使用して実行されました。

フェニルプロパノイド配糖体(PPG)ピークは、得られたLC−MSデータを以前に単離された化合物のものとの比較によって同定した[8]。ほうき菜抽出物中のPPGの定量は、330nmでの検出を伴うUPLC-UV法、および外部標準較正法に基づいていた。アクテオシド(シグマアルドリッチ、99%、HPLC)として

グループ標準。1~200 μg/mLの範囲の6つの濃度で線形検量線を作成し、良好な直線性を示した(R2

定量的結果は、3回の注射の平均SD値を表し、ミリグラムとして表された。アクテオシド抽出物1グラムあたりの当量(等価)(mgアクテオシドeq/g)。

2.5 インビトロでの抗ラジカル活性

2.5.1 ABTSラジカル消去アッセイ

ABTSアンチラジカル試験は、Kontekら[9]によって記載された方法を用いて実施され、以下のように若干の修正を加えた:20%MeOHを用いて試薬を調製した(7mM ABTSおよび4.9mMカリウム当たり

硫酸塩);OC、PA、およびPR抽出物の溶液を、100〜400μg/mLの範囲の4つの濃度レベルで、トロロックス溶液を、10〜250μg/mLの範囲の6つの濃度レベルで、50%MeOHで調製した。ABTS作業溶液に対するサンプルの割合は1:25(v/v)であった。734nmの吸光度を30分間のインキュベーション後に測定した

暗闇の中でUV-vis分光光度計(進化260バイオ、

サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)。

吸光度阻害(%)は、以下のようにして算出した:[(アブセコン−)

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

ほうきレイプの抽出物のトロロックス等価物(TE)が計算された

式 TE = msample/mstandard を使用して、m は直線の傾きです。

線の曲線(吸光度阻害対濃度)。のTE値

このサンプルでは、Trolox に対する正規化されたアクティビティについて説明します (TEstandard =

OC、PA、およびPR抽出およびトロロックスのIC50値は、

実験的に到達し、その後、それらの直線から計算した

曲線(吸光度阻害対濃度)は、

μg/mL.

アッセイを3連で行い、その結果を提示する

標準偏差(SD)±手段として。

2.5.2 DPPHラジカル消去アッセイ

DPPH抗ラジカル試験は、Jedrejek et al. [8] および Brand-Williams et al. [10] によって記載された方法を用いて、以下のように若干の修正を加えて実施した:OC、PA、およびPR抽出物の溶液を、50▽ 250μg/mLの範囲の4つの濃度レベルで、およびトロロックス溶液を、10▽250μg/mLの範囲の6つの濃度レベルで、 50%MeOHで調製した。DPPHに対するサンプルの割合は1:19(v/v)であった。517nmにおける吸光度は、UV-vis分光光度計(Evolution 260 Bio)を用いて暗所で30分間インキュベーションした後に測定した。吸光度阻害(%)は、以下のようにして計算した:[(Absecontroll-Abssample)/Abscontrol]×100。試験サンプルのトロロックス等価物(TE)およびIC50値は、ABTS試験と同じ方法で計算した(セクション2.5.1)。アッセイを3連で行い、その結果をSD±手段として提示する。

2.6. ヒト血漿を用いた実験のための試験済み植物化合物および抽出物のストック溶液

試験した化合物および植物抽出物のストック溶液を50%DMSO中で調製した。試験サンプル中のDMSOの最終濃度は0.05%未満であり、その効果はすべての実験において決定された。

2.7. ヒト血漿隔離

ヒトの血液、または血漿は、6人の定期的なドナー(禁煙の男性と女性)から血液バンク(ウッチ、ポーランド)と医療センター(ウッチ、ポーランド)に得られた。血液は、CPD溶液(クエン酸塩/リン酸/デキストロース;9:1;v/v血液/CPD)またはCPDA溶液(クエン酸塩/リン酸/デキストロース/アデニン;8.5:1;v/v;血液/CPDA)として採取した。ドナーは、寄付の前に少なくとも2週間、薬物や中毒性物質(タバコ、アルコール、抗酸化物質補給を含む)を服用していませんでした。血液サンプルの分析は、ヘルシンキ人間研究宣言のガイドラインに基づいて行われ、ウッチ大学の人体実験研究倫理委員会によって承認されました。血漿は、新鮮なヒト血液を4500x gで室温で25分間遠心分離することによって調製した。タンパク質濃度は、ウィテカーおよびグラナム[11]の手順に従って、280nmにおける試験サンプルの吸光度を測定することによって計算した。

2.8 ヒト血漿中の酸化ストレスのマーカー

2.8.1. 脂質過酸化測定

血漿脂質過酸化は、チオバルビツール酸反応性物質(TBARS)の濃度を測定することにより定量した。TBARS濃度はモル吸光係数(ε=156,000M1cm1)を用いて算出した。この方法は、より徹底的に説明され、他の方法は[12,13]であった。カルボニル基測定 カルボニル基のレベルは、モル吸光係数(ε= 22,000 M 1cm1)を用いて計算され、Bartosz [13]およびLevine et al. [14]に従って血漿タンパク質のnmolカルボニル基/mgとして表された。チオール基測定 血漿タンパク質中のチオール基含有量は、5,5'-ジチオールビス-(2-ニトロ安息香酸)による412nmの吸光度により、SPECTROstarナノマイクロプレートリーダー(BMG LABTECH、ドイツ)を用いて分光光度測定的に測定した。この方法は他の場所でより詳細に説明されています[15-17]。

2.9. 止血のパラメータ

2.9.1 プロトロンビン時間(PT)の測定

PTは、オプティック・コアギュレーションを用いて凝固測定法で測定した

文字はテューキーのテストの結果を示す(p< 0.05),="" values="" with="" the="">

行内の文字は大きく異なるものではありません。

トロンビン時間(TT)の測定

TTを、Malinowskaらによって記載された方法に従って、光学凝固分析器(モデルK−3002、Kselmed、Grudziadz、ポーランド)を用いて凝固測定的に決定した[18]。

2.9.3. 活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定

APTTは、Malinow ska et al. [18]によると、K-3002 Optic Coagulation Analyser(Kselmed, Grudziadz, Poland)を用いて凝固測定法で決定された。

2.10. データ解析 不確実なデータを除去するためにQ-Dixon検定を行った。

データは、Shapiro-Wilk検定による正規分布とLevene検定による分散の等価性について検定されました。統計的に有意な差はANOVAを使用して同定され、続いてTukeyの多重比較検定またはクラスカル・ウォリス検定が続いた。比較はp< 0.05.="" the="" values="" are="" presented="" as="" means="" ±="">