パート1CistancheDeserticola多糖類はマウスのOVX誘発性骨量減少とRANKL誘発性骨粗鬆症誘発を阻害します

1. 序章

骨粗鬆症—骨量の減少、骨組織の微細構造の異常、骨の脆弱性の増加、および骨折を特徴とする疾患（De Martinis、Di Benedetto、Mengoli、およびGinaldi、2006年）—現在、世界中で2億人以上が罹患しており、現代社会に対する社会経済的負担（Strom et al。、2011）。 骨粗鬆症の臨床治療は、主にホルモン補充療法、ビスフォスフォネート療法、またはデノスマブ療法に焦点を当てています。 これらの方法は効果的ですが、乳がんや非定型大腿骨骨折の潜在的なリスクなどの長期的な副作用をもたらします（Black、Bauer、Schwartz、Cummings、＆Rosen、2012; Rachner、Khosla、＆Hof-Bauer、2011）。 したがって、阻害するだけでなく、阻害することができる薬を探索する緊急の必要性があります骨粗鬆症しかし、望ましくない副作用も少なくなります。

ニクジュヨウ（CD）、「砂漠の高麗人参」として知られている中国で広く使用されている強壮剤および薬用食品は、鱗葉が付いた乾燥した多肉植物の茎ですニクジュヨウYC Ma（Gu、Yang、およびHuang、2016年）および多様で効果的な薬理学的活動、免疫調節、抗酸化、抗酸化など骨粗鬆症プロパティ（Hu et al。、2020; Li et al。、2012; Zhang et al。、2014）。 骨粗鬆症治療におけるCDの活性物質に関するこれまでの研究は、主にフェニルエタノイド配糖体（Li、Jiang、＆Gu、2018; Xu、Zhang、Wang、Yao、＆Ma、2017）。 ただし、CDには、イリドイド、リグナン、多糖類（Wang、Zhang、およびXie、2012年）。 漢方薬（TCM）の臨床応用は、主に水煎じ薬です。多糖類水溶性成分であり、TCMの主要な薬力学的成分である可能性が最も高いです。 TCMから抽出された多糖類は、抗骨粗鬆症効果といくつかの望ましくない副作用は、クリニックで一般的に使用されています（たとえば、Epimedium brevicornumから抽出された多糖類（Zheng、He、Wu、Cai、およびWei、2020）、Achyranthes bidentata（Zhang、Zhang、Zhang、Wang、およびYan、2018）、およびMorinda officinalis（Yan et al。、2019））。 したがって、私たちは次のように仮定しましたニクジュヨウ多糖類CDから抽出された（CDP）は、骨粗鬆症の治療に潜在的に安全な薬である可能性があります。

通常、骨吸収と骨形成は、破骨細胞、骨芽細胞、骨裏打ち細胞、骨細胞などのいくつかのタイプの細胞と協調して、骨リモデリング中に動的バランスを維持します（Kular、Tickner、Chim、およびXu、2012年）。 このバランスが崩れると、次のようなさまざまな骨代謝性疾患が発生する可能性があります。骨粗鬆症（Zhu et al。、2018）および骨硬化症（Ihde et al。、2011）。 破骨細胞は、単核/マクロファージ系統に由来する最終分化細胞として、骨吸収機能を備えた唯一の細胞です（Teitelbaum、2000）。 破骨細胞の分化と成熟に関与する2つの重要なサイトカインがあります（Koga et al。、2004）：マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）と核因子κBの受容体活性化因子（NF-κB）リガンド（RANKL）。 M-CSFは、造血幹細胞の破骨細胞前駆細胞への分化を仲介し、RANK受容体の発現をアップレギュレートすることによって破骨細胞の分化を促進します（Takayanagi、2007）。 破骨細胞表面でのRANKLとRANKの結合により、次の結果が得られます。（1）TNF受容体関連因子6（TRAF6）などのシグナル伝達アダプター分子の動員。 （2）NF-κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）を含む複数の下流標的の活性化。 （3）活性化T細胞の核因子である細胞質1（NFATc1）の発現レベルのアップレギュレーション（Liu et al。、2019; Yamashita et al。、2007）。 これらのシグナル伝達経路の活性化は、酸性ホスファターゼ5（Acp5）[酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAcP）をコードする]、マトリックスメタロプロテイナーゼ9（MMP9）、カテプシンK（CTSK）（Boyle、Simonet）などの破骨細胞遺伝子の発現を直接調節します。 、＆​​Lacey、2003）。 したがって、RANKL誘導破骨細胞分化関連シグナル伝達経路の阻害は、骨粗鬆症の潜在的な治療法です。

この研究では、卵巣切除（OVX）誘発性に対するCDP治療の効果を決定することを目的とした骨粗鬆症破骨細胞特異的遺伝子の発現とNFATc1およびNF-κBとMAPKのシグナル伝達経路の活性化に焦点を当てた、invivoおよびinvitroでのRANKL誘導破骨細胞活性に関するマウスモデル。 私たちの調査結果は、骨粗鬆症を治療するための安全で効果的な薬としてのCDPの可能性への新しい洞察を提供するかもしれません。

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2。材料と方法

2.1。 化学薬品とサンプルの収集

CD（no。180801）は、安徽済春漢方薬有限公司（中国安徽省）から購入し、中国広州の広州中国医学大学薬学部のHaiboHuang教授によって識別されました。 エストラジオール吉草酸錠剤はバイエル（レバークーゼン、ノルトラインヴェストファーレン州、ドイツ）から購入しました。 アルファ改変最小必須培地

（-MEM）およびウシ胎児血清（FBS）は、Gibco（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）から入手しました。 ペニシリン/ストレプトマイシンおよびTRAcP染色キットは、Solarbio（北京、中国）から入手しました。 組換えマウスM-CSFおよび組換えマウスRANKLは、R＆D Systems（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から調達しました。 ヒドロキシアパタイトでコーティングされたプレートは、Corning Life Sciences（St. Lowell、MA、USA）から購入しました。 NFATc1およびCTSKの一次抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）; IκB-、p65、P-p65、p38、P-p38、ERK1 / 2、P-ERK1 / 2、JNK、およびP-JNK（Cell Signaling Technology、Danvers、MA、USA）; -アクチン（CWBIO、北京、中国）も入手しました。 この研究で使用された他の試薬は分析グレードのものであり、水はMilli-Q浄水システム（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ、米国）によって精製されました。

2.2。 CDP抽出

CDを微粉末に粉砕し、石油エーテルと3回混合して破砕しました。 固形残留物を濾過により収集し、次に室温で乾燥させた。 The多糖類前処理したサンプルから水で2時間3回抽出し、濃縮し、無水エタノールを添加して最終濃度を80％（v / v）に沈殿させ、4°Cで24時間保存しました。 沈殿物を3000rpmで20分間の遠心分離によって収集し、蒸留水に溶解し、Sevag法（Zhao et al。、2019）を使用して精製（遊離タンパク質の除去）しました。 回収された多糖類透析し、乾燥させ、さらに使用するまで保管した。 さらに、化学組成の結果は、CDPの総糖、ウロン酸、硫酸塩、およびタンパク質含有量が67。63 0 .98パーセント、21。05 0。49パーセント、1。{{7 }}。24パーセント、および8。81 0。36パーセント。

CDPの単糖組成とフーリエ変換赤外分析を補足図1と2に示しました。

2.3。 OVX誘発性骨粗鬆症マウスモデル

すべての動物実験は、広州中国医学大学の動物倫理委員会によって承認されました（承認されたSYXK 2019-0202）。 30匹の6-週齢の雌C57BL/6マウスは、広州中国医学大学の実験動物センターから供給されました。 1週間の順化後、1つのグループのマウスに偽手術を行い（偽のグループ）、残りのマウスに卵巣摘出手術を行いました（OVXグループ）。 手術後、マウスを1-週間回復させた。 次に、モデル化に成功したマウスをランダムに5つのグループに分け、グループごとに6匹のマウスを配置しました。

（1）偽グループ：蒸留水で処理、（2）OVXグループ：蒸留水で処理、（3）OVX E2グループ（E2）：0。13 mg / kgエストラジオール吉草酸錠剤で処理、（4） ）OVX CDP低用量群（CDP-L）：300 mg / kgのCDPで治療、（5）OVX CDP高用量群（CDP- H）：600 mg/kgのCDPで治療。 蒸留水、E2、またはCDPは、1日1回強制経口投与されました。 12-週間の治療期間の後、すべてのマウスを犠牲にしました（図1A）。 子宮を収集して秤量し、その後の検査のために左脛骨を収集した。 全血サンプルを収集し、5000rpmで遠心分離しました。

4°Cで15分。 血清上清を吸引し、

-さらに分析するまで80°C。

2.4。 マイクロコンピューター断層撮影（マイクロCT）分析と骨組織形態計測

左脛骨を4％パラホルムアルデヒドで48時間固定し、続いて通常の生理食塩水を含む遠心分離管に入れました。 固定されたサンプルは、Skyscan 1172 micro-CT装置（Bruker micro-CT、Skyscan、Kontich、ベルギー）で、次の設定を使用してスキャンされました。 ソース電流、100μA; Al、0.5mmフィルター; ピクセル

サイズ、9.76μm; および回転ステップ、0.6◦。 のいくつかのパラメータ

骨ミネラル密度（BMD）、骨体積分率（BV / TV）、総体積あたりの骨表面（BS / TV）、骨梁数（Tb。N）、および骨梁間隔（Tb。Sp）を含む骨梁を以下を使用して測定しました。 CT-Analyser®ソフトウェア（Bruker micro-CT、Skyscan）。 CTVolソフトウェア（Bruker micro-CT。Skyscan）を使用して3次元画像を生成しました。

マイクロCT分析に続いて、左脛骨を14％EDTA溶液で脱灰し、切片化のためにパラフィンに包埋しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびTRAcP染色実験の前に、ミクロトームを使用してサンプルを5 µmの切片にスライスしました。 染色された切片は、Olympus CX 31顕微鏡（Olympus Optical Co.、Ltd、Tokyo、Japan）を使用して検査および記録されました。

Cistanche骨密度を高め、骨粗鬆症を和らげることができます

2.5。 血清分析

カルシウム（Ca）とリン（P）の濃度は、南京江城生物工学研究所（南京、中国）によって設計されたキットの説明書に従って決定されました。 血清中のTRAcP-5bおよびRANKLレベルは、TRAcP -5 b ELISAキット（CUSABIO、武漢、中国）およびRANKL ELISAキット（Cloud-CloneCorp。、武漢、中国）をそれぞれ使用して分析しました。

2.6。 invitro破骨細胞形成アッセイ

BMMは、6-週齢の雌C57BL/6マウスの脛骨と大腿骨から分離されました。 単離された細胞は、25 ng / mL M-CSF、10％FBS、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む-MEM培地で培養されました。 コンフルエンスに達したら、BMM（1 104細胞/ウェル）を96-ウェルプレートに播種し、50 ng /mLRANKLの存在下でCDPで処理しました。 培地とCDPは2日ごとに交換しました。 7日後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、TRAcPの存在を染色しました。 3つ以上の核を持つTRAcP陽性細胞として定義される破骨細胞の数をカウントし、光学顕微鏡を使用して記録しました。

2.7。 細胞増殖アッセイ

BMM（1×1 0 4細胞/ウェル）を96-ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートしました。 これに続いて、細胞をさまざまな濃度のCDP（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、および40 µg / mL）で48時間処理しました。 細胞のコンフルエンスは、IncuCyteZOOM®（Essen BioScience、米国ミシガン州アナーバー）を使用して検出および分析されました。これは、長期のリアルタイム動的生細胞イメージングシステムです。

2.8。 ヒドロキシアパタイト吸収アッセイ

BMM（{{0}}細胞/ウェル）をヒドロキシアパタイトでコーティングしたプレートに播種し、指示された濃度（0、5、および10 µg / mL）のCDPで処理し、完全な-MEMで培養しました。 25 ng /mLM-CSFおよび50ng/mLRANKLを含みます。 ７日後、細胞を１０パーセントの漂白剤溶液で洗浄して、細胞成分を除去した。 ヒドロキシアパタイト吸収領域の画像は、IncuCyteZOOM®を使用してキャプチャされ、ImageJソフトウェア（NIH、ベセスダ、メリーランド州、米国）を使用して分析されました（Abramoff、Magelhaes、およびRam、2003年）。

2.9。 RNAの分離とリアルタイム逆転写-定量的PCR（RT-qPCR）分析

BMM（{{0}}細胞/ウェル）を6-ウェルプレートに播種し、さまざまな濃度（0、5、および10）のCDPの存在下でRANKLおよびM-CSFで刺激しました。 µg / mL）5日間。 TRIzol試薬（Sigma-Aldrich）を使用して、マウスの細胞または骨組織からトータルRNAを単離しました。 逆転写酵素キット（TransGen Biotech、北京、中国）を使用して、2 µgのトータルRNAから相補DNAを合成しました。 RT-qPCR反応は、PerfectStart™Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech）を使用して調製し、ABI 7500システム（Applied

Biosystems、Thermo Fisher Scientific、Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。 PCRのサイクリングパラメーターは次のように設定しました：95°Cで5分間、続いて95°Cで15秒間、60°Cで30秒間を40サイクル。 使用した特定のプライマーを表1に示し、各標的遺伝子の量をGAPDH（内部対照）に対して正規化しました。

2.10。 ウエスタンブロット分析

BMM（{{0}}細胞/ウェル）を6-ウェルプレートに播種しました。 短期間の実験では、細胞をさまざまな濃度のCDP（0、5、および10 µg / mL）で1時間プレインキュベートした後、50 ng /mLRANKLで30分間処理しました。 。 長期間、CDP（0、5、および10 µg / mL）の存在下で3、5、および7日目に細胞を50 ng /mLRANKLで刺激しました。 RIPA溶解バッファー（CWBIO）を使用して総タンパク質を抽出しました。 タンパク質を10％SDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンに転写しました。 メンブレンを5％スキムミルクで室温で2時間ブロックし、プライマリーとインキュベートしました

抗体を4°Cで一晩、次に対応する二次抗体と

1.5時間の抗体。 膜はECL試薬（Millipore Corp.、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して開発され、画像はTanon 5200化学発光イメージングシステム（Tanon Science and Technology、上海、中国）を使用して撮影されました。

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2.11。 蛍光抗体検査を使用したNFATc1転座の検出

BMMを{{0}}ウェルカバースリップに播種し、RANKLとM-CSFで刺激し、10 µg /mLCDPで5日間処理しました。 細胞を4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、PBSで3回洗浄し、0.1％TritonX-100で10分間透過処理しました。 細胞を10％ヤギ血清（CWBIO）と混合し、2時間インキュベートしました。 続いて、細胞を一次抗体と4°Cで一晩インキュベートし、次にAlexa Fluor 488ヤギ抗マウス二次抗体（Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）と暗所で1時間インキュベートしました。 カバースリップをPBSで洗浄し、4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（ソーラー）を含むProlong GoldAntifadeReagentにマウントしました。

Airyscan共焦点顕微鏡（Carl Zeiss、ドイツ、オーバーコッヘン）を備えたZeissLSM800を使用して検査。

2.12。 統計分析

すべての実験データは、SPSS 25. 0統計ソフトウェア（IBM Corporation、米国ニューヨーク州アーモンク）を使用して分析されました。 動物および細胞研究のデータは、それぞれ平均±SEMおよび平均±SDとして表されます。 結果は、一元配置分散分析またはスチューデントのt検定を使用しています。 p <>

Cistanche減らすことができますアポトーシス骨を強化します密度