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Yasaman Alaghbanda、b、c、Janine L. Kwapisa、b、d、AlbertoJ.Lópeza、b、c、AndréO。Whitea、b、c、3、Osasumwen V. Aimiuwua、b、c、1、Amni Al- Kachaka、b、c、2、Kasuni K. Bodinayakea、b、c、

ニコールC.オパラウゴア、b、c、リチャードダンガ、b、d、マリアムアスタラバディア、b、c、4、ディナP.マテオサ、b、マルセロA.ウッダ、b、c、d

a301 Qureshey Research Lab、Department of Neurobiology and Behavior、Center for the

学習と神経生物学メモリー、カリフォルニア大学アーバイン校、アーバイン、カリフォルニア州、92697学習神経生物学センターおよびメモリー（CNLM）、カリフォルニア州アーバイン、92697 c

アーバイン中毒神経科学センター（ICAN）、カリフォルニア大学アーバイン校、カリフォルニア州、92697d Institute forメモリーカリフォルニア大学アーバイン校の障害と神経障害、

クリックして記憶を改善するためのカンカニクジュヨウの利点と副作用

概要

ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）は、クロマチン修飾酵素であり、メモリープロセス。 HDAC3は、コカイン関連の絶滅だけでなく、オブジェクトの場所の長期記憶において極めて重要な役割を果たすことが示されています。メモリー、しかし、この機能がHDAC3のデアセチラーゼドメインに依存するかどうかは不明です。 ここでは、HDAC3のデアセチラーゼドメインがオブジェクトの位置に役割を果たしているかどうかをテストしましたメモリーコカイン関連の記憶の形成と消滅。 HDAC3のデアセチラーゼデッドポイント変異体を使用して、背側海馬でHDAC3デアセチラーゼ活性を選択的にブロックすると、オブジェクトの場所の長期記憶が強化されるが、コカイン関連記憶の形成には影響がないことがわかりました。 HDAC3のこの同じ点突然変異ウイルスが前縁皮質に注入されたとき、それはコカイン関連に影響を与えることができませんでしたメモリー形成。 絶滅に関しては、辺縁下皮質のHDAC3デアセチラーゼドメインを損なうことは絶滅に影響を与えなかったが、点突然変異ウイルスが背側海馬に送達されたときに促進された絶滅効果が観察された。 これらの結果は、HDAC3のデアセチラーゼドメインが長期的な基礎となる特定の脳領域で選択的な役割を果たすことを示唆していますメモリーオブジェクトの場所の形成とコカイン関連メモリー形成と絶滅。

キーワード

長期記憶; エピジェネティクス; クロマチン; オブジェクトの場所; 条件付きの場所の好み; 背側海馬

序章

ヒストンのアセチル化は、に必要な遺伝子発現の調節に関与する、よく研究されたクロマチン修飾メカニズムです。メモリー。 多くの研究は、ヒストンのアセチル化が長期的に関与していることを示していますメモリーフォーメーション（Levenson and Sweatt、2006; McQuown and Wood、2011;GräffandTsai、2013; Peixoto and Abel、2013; Penney and Tsai 2014でレビュー）。 ヒストンのアセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼとヒストンデアセチラーゼ（HDAC）によって実行されます。これらは、一般に、それぞれ遺伝子発現を促進および抑制します（Jenuwein and Allis 2001; Kouzarides、2007）。 ヒストンデアセチラーゼ3（HDAC3）は、脳内で最も高度に発現するクラスI HDACであり、この特定のHDACは、学習および記憶プロセスの強力な負の調節因子です（Kwapis et al。、2017; Malvaez et al。、2013; McQuown etal。 。、2011; Rogge et al。、2013）。 私たちの研究室は、海馬と扁桃体に固有のHDAC3操作を使用して、HDAC3がオブジェクトの位置と恐怖に関連する記憶形成（McQuown et al。、2011; Kwapis et al。、2017）で重要な役割を果たすことを示しました。 また、HDAC3阻害は、回復を阻止する方法で薬物探索行動の消滅を促進することも示しました（Malvaez et al。、2013）。 Malvaez et al（2013）の絶滅実験では、全身投与された選択的HDAC3阻害剤を使用したため、HDAC3-依存性の絶滅調節に最も重要な脳領域を特定できませんでした。

HDAC3自体は強力なデアセチラーゼ活性を持ち（Guenther et al。、2002; Lahm et al。、2007; Zhang et al。、2002）、コリプレッサー核内受容体コリプレッサー（NCoR）との相互作用を介してHDAC4/HDAC5と結合します。機能的な多タンパク質リプレッサー複合体を形成します（Guenther et al。、2001; Fischle et al。、2002; Alenghat et al。、2008）。 1つのアイデアは、HDAC4は標準的なアセチル-リジン基質に対してほとんどまたはまったく触媒活性を持たないため、これらの多タンパク質複合体が脱アセチル化に必要となる可能性があるということです（Lahm et al。、2007）。 HDAC4は変調することが示されていますメモリーそのデアセチラーゼドメインとは独立している（Sando et al。、2012）。 学習の分野の外とメモリー、他の組織におけるHDAC 3-を介した遺伝子発現は、必ずしもHDAC3酵素機能を必要としない（Sun et al。、2013）。これは、おそらくHDAC3のデアセチラーゼ活性が記憶形成に必要ではない可能性があることを示唆している。 最近まで、記憶形成におけるHDAC3のデアセチラーゼ活性は直接テストされていませんでした。 Kwapisと同僚（2017）は、扁桃体依存型の扁桃体には実際にHDAC3の酵素活性が必要であることを示しました。メモリー形成。

以前の研究は、HDAC3阻害剤の全身投与が物体位置の形成の両方を促進できることを示していましたメモリー（OLM）および関連するコカインコンテキストの絶滅メモリー（Malvaez et al。、2013）。 ただし、HDAC3のデアセチラーゼ活性がオブジェクトの位置に必要かどうかメモリー海馬のOLM、および下肢皮質のコカインコンテキスト関連記憶の消滅は不明なままです。 現在の研究では、海馬依存性記憶形成、ならびに背側海馬（DH）、前縁皮質（PrL）、および下縁皮質（IL）において、HDAC3のデアセチラーゼ活性を特異的に標的としました。コカインで調整された場所の好み、または関連するコカインコンテキストメモリープロセス。

材料および方法

科目

すべての手順は、カリフォルニア大学アーバイン校の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。 マウスは8〜12週齢で、12時間の明暗サイクルで照明を維持しながら、ホームケージ内の餌と水を自由に摂取できました。 行動テストは、サイクルの軽い部分で実行されました。 被験者は、AAV-HDAC3（Y298H）-v5実験の成体雄C57BL/6Jマウスでした。 HDAC3 flox欠失実験では、Hdac3flox/floxおよび野生型Hdac3plus/plus同腹仔マウスをC57BL/6Jバックグラウンドで維持しました（Mullican et al。、2011）。 簡単に説明すると、これらのマウスは、ペンシルベニア大学（ペンシルベニア州フィラデルフィア）のミッチ・ラザール博士の研究室で生成され、酵素の触媒活性に必要な領域であるHdac3遺伝子のエクソン4からエクソン7に隣接するloxPサイトがあります（Mullican et al。、2011）。

薬物

コカイン-HClはSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入し、生理食塩水（0 .9パーセントNaCl）に溶解しました。 コカイン-HClは塩の重量として表されます。 取得実験でのコカイン-CPPトレーニングでは、コカイン-HClを最終濃度0。5 mg / mlに溶解し、10 ml / kg体重の量で投与した結果、最終投与量は5になりました。 mg/kg。 絶滅実験におけるコカイン-CPPトレーニングでは、コカイン-HClを最終濃度2 mg / mlに溶解し、10 ml / kg体重の量で投与し、最終用量を20 mg/kgにしました。 コカイン-HClおよび生理食塩水を腹腔内投与した（ip）。

手術

マウスは酸素中の4％イソフルランで誘発され、手術期間中1.5–2。0％に維持されました。 動物にAAV-HDAC3（Y298H）-v5またはAAV-EV（空のベクター）のいずれかを注射した（Kwapis et al。、2 0 17）。 DH実験では、1 µlofvirusを両側に注入しました。 前縁および下縁実験では、0。3 µlのウイルスを両側に注入しました。 免疫蛍光法を使用して、HDAC3（Y298H）の発現を確認した。 注射針は、0。2mm/15sの速度で目的の座標まで下げられました。 {{2 0}}目標深度に到達してから数分後、ウイルスは6 µl/hrの速度で注入されました。 注入後、ウイルスを拡散させるために注射針を2-分間そのままにしました。 次に、インジェクターを0。1mm上げ、さらに1分間放置してから、ゆっくりと取り外しました（0。1mm / 15秒）。 切開を縫合し、行動の前に完全なウイルス発現のために2週間待った。 ウイルスは、PE5 0チューブに接続され、ハミルトンシリンジに接続されたデュアル28ゲージ注入器（DH：中心から中心に3mm、PrL / IL：0。中心から中心に8 mm）で注入されました。輸液ポンプに取り付けられています。 DHの座標は次のとおりです。AP、-2.0mm。 ML、±1.5mm; DV、ブレグマに対して-1.5mm。 PrLの座標は次のとおりです。APプラス1.9mm。 ML、±0.4mm; DV、ブレグマに対して-2.2mm。 ILの座標は次のとおりです。APプラス1.5。 ML、±0.4mm; DV、ブレグマに対して-3.2mm。

AAVプロダクション

野生型HDAC3は、マウス海馬のcDNAから増幅され、CMVプロモーターと-グロビンイントロンの制御下で、改変されたpAAV-IRES-hrGFP（Agilent）にクローン化されました。 点突然変異を作成するために、アミノ酸298のチロシンの代わりにヒスチジン残基の生成を指示するエクソン11の一塩基置換が作成されました（プラスミドMW92）。 空のベクターコントロールの場合、HDAC3コード配列は存在しませんでしたが、他のすべての要素は残っています（プラスミドMW87）。 アデノ随伴ウイルス（AAV）は、ペンシルベニア大学のPenn Vector Coreによって、上記のプラスミドから作成され、AAV2.1で血清型が決定されました。 AAV-HDAC3（Y298H）の最終力価は6.48×1012 GC / mLであり、AAV-EVの最終力価は1.35×1013 GC/mLでした。

免疫蛍光

図2〜7に示す行動実験では、行動分析に含まれるすべての動物で、免疫組織化学によってウイルス注入が確認されました。 マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、それらの脳を取り出し、氷冷イソペンタン中で急速冷凍した。 2 0 µmスライスをIL / PrLまたはDH全体で収集し、スライドに解凍マウントし、使用するまで-80度で保存しました。 蛍光抗体分析では、スライドを4％パラホルムアルデヒドで1 0分間固定し、0.1MPBS中の0.01％TritonX-100で15分間透過処理しました。 次に、スライドを8％正常ヤギ血清（Jackson）で室温で1時間ブロックし、一次抗体（HDAC3クローンY415抗体：1：250; Abcam）で4度で一晩インキュベートしました。 翌日、スライドを室温で1時間、ヤギ抗ウサギAlexa 488（1：1 000希釈、Invitrogen）とともに暗所でインキュベートした後、15-分のDAPIインキュベーション（1： 10,000、Invitrogen; DH）。 赤色蛍光nissl染色NeuroTrace（1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies）を使用した実験では、スライドを室温で50分間インキュベートした後、0.01％Triton-X-100で2回洗浄しました。 5分間、次にPBSで5分間2回洗浄します。 VectaShield Antifade封入剤（VectorLaboratories）を使用してスライドをカバースリップした。

すべての画像は、VS110スキャナーソフトウェアを備えた20倍のアポクロマート対物レンズ（開口数0.75）を備えたOlympus ScannerVS110で取得されました。 すべての治療グループが各スライドに表示され、スライド上のすべての画像が同じ露光時間でキャプチャされました。 免疫標識強度は、バックグラウンドに正規化されたCA1の細胞層の光学密度をサンプリングすることによりImageJで定量化されました。

定量的RT-PCR

以前に記載されたように（Lópezetal。、2016; White et al。、2016）、AAV-HDAC3（Y298H）注入（実験1）後の野生型Hdac3mRNA発現のV5発現およびアップレギュレーションを検証するために定量的リアルタイムRT-PCRを実施しました。 実験1では、蛍光抗体法によって確認されたように、ウイルス発現の領域（またはEVマウスの同等の領域）の500 µmスライスからDHの1mmパンチを収集しました。 すべての組織は、処理するまで-80度で保存されました。

RNeasy Minikit（Qiagen）を使用してRNAを単離し、Transcriptor First Strand cDNA合成キット（Roche Applied Science）を使用してcDNAを作成しました。 Roche Universal ProbeLibraryから派生した次のプライマーを使用しました。Hdac3rightプライマー、5'- ttcaacgtgggtgatgactg -3'; Hdac3leftプライマー、5'- ttagctgtgttgctccttgc -3'; プローブ、ctgctccc; Hdac 3- v5rightプライマー、5'-tggagattctcgagggtaagc -3'; Hdac 3- v5leftプライマー、5'- atgccacccgtagatctgg -3'; プローブ、ctctcctc。 これらの標的遺伝子の各プローブは、色素FAMに結合しました。 グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（Gapd）は、すべてのRT-qPCRアッセイの参照遺伝子として使用されました。 Gapdには、次のプライマーを使用しました。左プライマー、5'atggtgaaggtcggtgtga -3'; 右の入門書、5- aatctccactttgccactgc -3'; プローブ、tggcggtattgg。 GapdprobeはLightCyclerYellow555にコンジュゲートされました。参照遺伝子の重複しない色素とクエンチャーにより、Roche LightCycle 480 IIマシン（Roche Applied Sciences）での多重化が可能になります。 すべての値はGapd発現レベルに正規化されました。 分析と統計は、ロシュ独自のアルゴリズムと、Pfafflメソッドに基づくREST 2009ソフトウェアを使用して実行されました（Pfaffl 2001; Pfaffl et al。、2002）。

OLMおよびORMタスク

OLMおよび新規オブジェクト認識用メモリー（ORM）、慣れデータ（個々の慣れセッション中に移動した距離）、トレーニング、およびテストビデオは、任意の迷路行動分析ソフトウェアを使用して収集されました。 OLMとORMのトレーニングとテストは、前述のように実行されました（Lópezetal。、2016; McQuown et al。、2011; Vogel-Ciernia et al。、2013; Vogel-Ciernia and Wood、2014）。 訓練の前に、マウスを1〜2分間4日間扱い、物体がない状態で6日間連続してOLMチャンバーに5分間実験装置に慣れさせました。 トレーニングトライアル中、マウスを2つの同一のオブジェクト（OLM：100 mlビーカー、直径2.5 cm、高さ4 cm、ORM：スパイス缶とガラスキャンドルホルダー）とともに実験装置に配置し、これらのオブジェクトを3分間探索しました。 、これは短期的または長期的な結果にはなりませんメモリー。 以前、24時間でテストされたLTMを生成するには3分のトレーニング期間では不十分であることを示しました（Haettig et al。、2011、2013;Lópezetal。、2016; McQuown et al。、2011; Stefanko et al。、2009） 。 24時間後、動物の保持力を5分間テストしました。 OLMの場合、使い慣れたオブジェクトの1つのコピーがトレーニングトライアル中と同じ場所に配置され、使い慣れたオブジェクトの1つのコピーがボックスの中央に配置されました。 ORMの場合、使い慣れたオブジェクトの1つのコピーと新しいオブジェクトが、トレーニングトライアル中と同じ場所に配置されました。 すべてのトレーニングとテストの試行は、動物の治療を知らない個人によってビデオ録画され、手で採点されました。 ビデオは、識別指数（DI）[（見慣れたオブジェクトの探索に費やされた新しい目的の探索に費やされた時間）/（両方のオブジェクトの探索に費やされた合計時間）×100％]に加えて、オブジェクトの全体の探索について分析されました。 オブジェクトのすべての組み合わせと場所は、特定の場所またはオブジェクトの好みに起因する潜在的なバイアスを減らすために、バランスの取れた方法で使用されました。

条件付き場所優先装置

場所の好みの条件付けは、私たちの研究で以前に説明されたように実行されました（Malvaez et al。、2011; Rogge et al。、2013; White et al。、2016）。 簡単に説明すると、実験開始前の3日間（1〜3日目）、マウスを1日1分間処理しました。 すべての実験のCPP手順は、偏りのない、釣り合いのとれたプロトコルを使用して実行されました。 各実験のベースライン選好は、場所選好装置の中央コンパートメントに動物を配置し、15分間すべてのコンパートメントに自由にアクセスできるようにすることによって評価されました（事前テスト; 4日目）。 トレーニングステージは、プレテストの翌日に始まりました。 ギロチンドアを閉じた状態でその後4日間コンディショニングを行い、動物をCPP装置の2つの外側コンパートメントの1つに30分間（5〜8日目）閉じ込めました。 偏りのないデザインを使用して、動物の半分は市松模様のコンパートメントに配置する前にコカインを与え、残りの半分はトレーニング1日目（CS plus）に白いコンパートメントに配置する前にコカインを受け取りました。 翌日、各動物の治療とコンパートメントを逆にし（トレーニング2日目）、代替コンパートメント（CS-）に配置する前にマウスに生理食塩水を注射しました。 注射は、その後のコンディショニングセッションのために変更されました。 図1および2に示す取得実験の場合。 3〜5日、動物は、一方の区画でコカインとの合計2つの30-分のペアリングを受け取り、もう一方の区画で生理食塩水との2つの30-分のペアリングを受け取りました。 最後のコンディショニングセッションの48時間後、薬物を含まない状態で上記のようにすべての動物で好み（15分;テスト後1; 10日目）を評価しました。 図1と図2に示す消滅実験の場合。 6〜7日、動物はコンディショニングを受け、その後、上記の最後のコンディショニングセッションの1 48時間後にテストが行​​われました。 DHまたはILへのウイルス注入の2週間後、動物は毎日薬物を使用しない嗜好試験を繰り返し受けました（15分、試験後2〜5日、25〜28日目）。 CPPスコアは、コカインペア（CSプラス）から生理食塩水ペア（CS-）コンパートメントを差し引いた時間（秒）として計算されました。 大きな外側のコンパートメントのそれぞれで費やされた時間は、EthoVision 3.1ソフトウェア（Noldus Technology; Malvaez et al。、2011を参照）を使用したMPEGビデオからの自動ソフトウェアによって分析されました。

統計分析

Graphpad Prism 7.02（GraphPad Software）は、すべての統計分析に使用されました。

二元配置分散分析を使用して馴化を分析し、馴化セッション全体で移動した合計距離を比較しました。 スチューデントのt検定を使用してトレーニングとテストのデータを分析し、対照動物とテスト動物の間で探索またはDIのいずれかを比較しました。 また、DI値をゼロと比較する片側t検定を使用してテストデータを分析し、有意な識別が観察されたかどうかを判断しました。 CPP実験は、二元配置分散分析（ANOVA）と、それに続く被験者内変数およびグループ/遺伝子型としてのテストでの優先スコア（PS）を使用したボンフェローニの事後検定を使用して分析されました（空のベクトルvs.Y298Hポイント変異体;Hdac3 plus / plus vs. Hdac3flox / flox）。 この統計的検定は、有意な相互作用および/またはメイングループの影響が観察されたときに特定の比較を行うために使用されました。 PS値をゼロと比較する片側t検定を使用してテストデータも分析し、有意な選好が観察されたかどうかを判断しました。 絶滅実験では、スチューデントのt検定を最初に実施して、ウイルス注入前の試験後1で動物が有意な選好を形成したかどうかを判断しました。 RT-qPCR値は上記のように得られました。 RT-qPCR値の違いは、スチューデントのt検定で評価されました。 すべての分析で、有意性のために0。05の値が必要でした。