パート1| Herba Cistanche Extractは、ラットの心臓とH9c2細胞のミトコンドリアATP生成を促進します
Mar 04, 2022
HoiYanLeungとKamMingKo
香港科技大学生化学科、清水湾、香港特別行政区、中国
キーワード：ATP、ニクジュヨウ、H9c2細胞、心臓、ミトコンドリア
概要
「の薬理学的基礎を調査するにはヤン-爽快"ハーブCistancheのアクション[乾燥した全植物のニクジュヨウYC Ma（ハマウツボ科）]、漢方薬では、ミトコンドリアのATP生成能力に対するHerba Cistancheのメタノール抽出物の影響を、exvivoラット心臓モデルとinsituH9c2細胞アッセイを使用して調べました。 Herba Cistanche抽出物による治療は、in vitro測定で評価した場合、ラットの心筋ミトコンドリアATP生成能力を用量依存的に増加させました。 ATP生成能力の刺激は、ピルビン酸によってサポートされているがコハク酸ではサポートされていないミトコンドリアの電子伝達の平行した増強と関連していた。 Herba Cistanche治療はまた、心筋ミトコンドリア複合体Iおよび複合体III活性を増加させ、複合体I活性に対する刺激の程度はより大きかった。 Herba Cistanche処理により、H9c2細胞のミトコンドリアATP生成能力が用量および時間に依存して増加しました。 結果は、HerbaCistanche治療ができることを示していますミトコンドリアのATP生成を増加させるexvivoでのラット心臓およびinsituでのH9c2細胞酸化的リン酸化を促進する.
Cistancheは心臓機能を改善し、血圧を下げ、血中脂質を下げることができます
序章
漢方薬の身体機能の一般化された強化を具体化する「ヤンの活性化」は、さまざまな生化学的プロセスを推進する際にエネルギーを使用することを含みます。
この点で、細胞機能を促進するエネルギーの普遍的な通貨であるATPは、主にミトコンドリアの酸化的リン酸化によって生成されます。 私たちは「陽を元気にする」ハーブを仮定しましたミトコンドリアのATP生成能力を高める能力を持っている（Ko et al。、2004）。 これは、「陽を活性化する」が「陰を養う」中国の強壮ハーブではなく、exvivoでマウスの心臓の心筋ATP生成能力を高める可能性があるという最近の発見によって裏付けられています（Koet al。、2006）。 ニクジュヨウYCMa（ハマウツボ科）の乾燥した全寄生植物（花を除く）であるHerba Cistancheは、'ヤンを活性化させる「伝統的な漢方薬の強壮ハーブ」（Chen、1998）、そしてそれはヤンを活性化するために使用される多くの中国の特許処方で最も人気のある成分として表示されます。 中国と日本では、HerbaCistancheは多くのヤン欠乏症状の治療に広く使用されています。 薬理学的研究は、HerbaCistancheがフリーラジカルを除去する（Xiong et al。、1996）、鎮静剤を生成する（Lu、1998）、老化防止（Lee et al。、1990）、抗侵害受容および抗炎症効果（Lin et al。、2002）、および免疫機能を高める（Wu et al。、2005）。 HerbaCistancheの主な有効成分はフェニルエタノイド配糖体（Ouyang et al。、2003）、抗菌、抗ストレス、抗酸化特性（Xiong et al。、1998）、および培養ニューロンに対する抗アポトーシス効果（Tian＆Pu、2005）。 現在の研究では、Herba Cistancheのヤン活性化作用の薬理学的基礎を調査するために、exvivoおよびinsituで培養されたH9c2心筋細胞から単離されたミトコンドリアのATP生成能力に対するHerbaCistanche処理の影響を調べました。 ATP生成促進作用の根底にある生化学的メカニズムを調査するために、ミトコンドリアの電子伝達と複雑なI–IV活性に対するHerbaCistanche治療の効果もラットの心臓で調べました。
Cistancheの有効成分は、さまざまな活性酸素フリーラジカルを除去することができます
材料および方法
化学物質、細胞培養、およびハーブ材料
ATP、ADP、および3- [4、5-ジメチルチオゾール-2-イル] -2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）はSigmaChemicalCoから購入しました。 。（セントルイス、ミズーリ州、米国）。 ルシフェラーゼ溶液（ATPlite）は、PerkinElmer（ボストン、マサチューセッツ、米国）から入手しました。 ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）およびウシ胎児血清（FBS）は、GIBCO BRL Life Technologies（Grand Island、NY、USA）から購入しました。 H9c2細胞株はATTC（Rockville、MD、USA）から購入しました。 Herba Cistancheは、地元のハーブディーラー（Lee Hoong Kee）から供給されました。 ハーブはサプライヤーによって認証され、バウチャー標本（HKUSTY00301）が香港科技大学（HKUST）の生化学科に寄託されました。
ハーブ抽出
Herba Cistanche（1 0 0 g）を細かく切り、300mLのメタノール中で65°Cで2時間加熱還流して抽出しました。 手順を2回繰り返した。 プールした抽出物を減圧下で溶媒を蒸発させることにより乾燥させ、Herba Cistancheのメタノール抽出物を39パーセント（w / w）の収率で得た。 化学分析によると、Herba Cistancheのメタノール抽出物には、総サポニン、総フラボノイド、総リグナン、および多糖類がそれぞれ1.62パーセント（w / w）、0.08パーセント、0.15パーセント、および75.6パーセントの濃度で含まれていました。
動物の世話
成体のオスのSprague-Dawleyラット（8〜10週間、250〜300g）を、約22°Cの空気/湿度制御された部屋で12-時間の暗/明サイクル下で維持し、餌と水を自由に摂取させました。 HKUSTのアニマルケア施設で。 実験プロトコルは、HKUSTの研究実践委員会によって承認されました。
薬物治療
動物をランダムにグループに分け、それぞれに5〜6匹の動物を入れた。 治療群では、ラットにHerba Cistancheのメタノール抽出物（水に溶解/懸濁）を1日量（{{0}}。031–0.5 g / kg）を増やしながら3日間胃内投与しました。 対照動物は水のみを受けた。 最後の投与から24時間後、フェノバルビタールで麻酔した動物から心臓を採取し、生化学的分析を行いました。
ミトコンドリア画分の調製とエクスビボでのATP生成能力（ATP-GC）の測定
心臓の左心室組織サンプルを切除し、氷冷等張緩衝液（0 .32 Mスクロース、1 mM EDTA、50 mM Tris / HCl、pH 7.4）ですすいだ。 心臓ミトコンドリア画分は、4°Cの等張バッファーでの分画遠心分離によって調製しました。 10％（w / v）の心臓ホモジネートは、細かく刻んだ心室組織をテフロンガラスホモジナイザーで4000 rpmで20〜30回の完全なストロークでホモジナイズすることによって調製しました。 ホモジネートを600×gで10分間遠心分離し、核と細胞片を除去しました。 次に、上清を8000×gで30分間遠心分離して、ミトコンドリアを沈殿させました（Evan、1992）。 ペレットを1mLの等張緩衝液に再懸濁し、ミトコンドリア画分を再構成しました。 未処理の動物のミトコンドリアATP-GCは、Leungetal。の方法で測定されました。 （2005）
Cistanche多糖類は、臓器の生理学的変性と細胞形態の変性を遅らせることができます
ミトコンドリアの電子伝達の測定
Cohen et al。によって記述されたように[1]実行された、MTTの減少に基づく、単離されたミトコンドリアにおける電子伝達の測定。 （1997）。 ミトコンドリアは、インキュベーションバッファー（25 0 mMスクロース、5 0 mM HEPES、10 mM KH2PO4、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、pH 7.4）を使用してタンパク質濃度1 mg/mLで調製しました。 。 ミトコンドリアのアリコート（40 µL）を、15mMピルビン酸または0.5mMコハク酸塩および0.42mg / mLMTTのそれぞれ100µLと混合しました。 反応混合物を穏やかに振とうしながら37℃で10分間インキュベートした。 インキュベーション後、100 µLの溶解緩衝液（10％、w / v、ドデシル硫酸ナトリウム、および45％ジメチルホルムアミド、氷酢酸でpH 4.7に調整）を添加して反応混合物を停止しました。 5分間静置した後、反応混合物の吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）で読み取り、570nmと630nmの差として報告しました。 データは、対照群（すなわち、Herba Cistanche-未処理）の平均値のパーセンテージとして表されました。
細胞培養
心臓筋芽細胞に由来する永久細胞株であるH9c2細胞（Hescheler et al。、1991）は、10パーセント（v / v）FBSを添加したDMEMで単層として培養されました。 培地には、グルコース（4.5 g / L）とグルタミン（4.5 mM）が含まれ、NaHCO3（17 mM）、ペニシリン（100 IU / mL）、およびストレプトマイシン（100µg / mL）が追加されました。 すべての細胞は、37°Cの空気中で5％（v / v）CO2の雰囲気下で増殖しました。 培地は2、3日ごとに新しい培地と交換した。 細胞のストックを75cm2の培養フラスコで増殖させ、1：10の継代培養比でコンフルエントになる前に分割しました。 ATP-GCアッセイでは、H9c2細胞を2.5×104細胞/ウェルの密度で24-ウェルプレートに播種しました。 細胞接着後、Herba Cistanche抽出物（リン酸緩衝生理食塩水に溶解; PBS）を培地に適用し、細胞を長時間（2〜16時間）インキュベートしました。 対照（未処理）細胞にはPBSのみを与えた。
insituでのATP-GCの測定
増加する濃度（5 {{1 0}} – 3 0 0 µg / mL）でHerbaCistanche抽出物との示されたインキュベーション期間の後、ATP-GCアッセイを実行しました。 培地を吸引し、細胞をインキュベーションバッファー（120 mM KCl、5 mMKH2PO4、2 mM EGTA、10 mM HEPES、0.1 mM MgCl2、0.5パーセントBSA、pH 7.4）中のジギトニン（50µg / mL）で37℃で3分間処理しました。 ◦C。 ジギトニンを吸引した後、グルタミン酸（5 mM）、リンゴ酸（5 mM）、およびADP（60µM）を細胞に添加して、ミトコンドリアのATP生成を行い、0〜15分の時間間隔でモニターしました。 60 µLの過塩素酸（30％、w / v）を添加して反応を停止し、反応混合物を600×gで10分間4°Cで遠心分離しました。 上清のアリコート（120 µL）を90 µLの1.4 M KHCO3と混合して中和し、混合物を再度600×g、4°Cで遠心分離し、前述のように上清のATP含有量を測定しました。 未処理の細胞のATP-GCは、生成されたATP（nmol / mgタンパク質）を時間（0〜15分）に対してプロットし、任意の単位で表したグラフ（AUC1）の曲線下面積を計算することによって推定されました。 HerbaCistancheで処理した細胞の場合、インキュベーション時間の増加（3、5、7、10、および15分）のAUC1値を、未処理のサンプルからのそれぞれの平均コントロール値に正規化し、パーセントコントロールとして表した。 次に、インキュベーション時間（3〜15分）に対するパーセントコントロール値をプロットしたグラフの曲線下面積（AUC2）を計算し、任意の単位で表した。 Herba Cistancheで治療したグループのデータは、次の式から対照のパーセンテージとして表されました。
[AUC2（HerbaCistanche-処理済み）/ AUC2（未処理）]×100％
複合体I–IVおよびクエン酸シンターゼ活性の測定
ミトコンドリア電子伝達系（ETC）複合体I–III活性は、記載されているように（Grad＆Lemire、2004; Hsu etal。 、2005; Mark et al。、2001）。 複合体IV活性は、Sigmaのチトクロームcオキシダーゼアッセイキットを使用して測定しました。 ミトコンドリアのクエン酸シンターゼ活性は、Srere（1969）の方法で測定されました。
タンパク質アッセイ
ミトコンドリア画分および細胞溶解物のタンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（{{0}}。038–0.600mg / mL）を使用するBioRadタンパク質アッセイキットを使用して決定されました。
統計分析
すべてのデータは、平均±平均の標準誤差（SEM）として表されました。 それらは一元配置分散分析（ANOVA）によって分析されました。 事後多重比較はLSDで行われました。 P値<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">
結果
ラットの心筋ミトコンドリアATP-GCに対するHerbaCistanche治療の効果
図1に示すように、最大0 .5 g / kgの用量でHerbaCistanche抽出物を投与すると、ラットの心筋ミトコンドリアATP-GCが用量依存的に増加し、刺激の程度は1用量で89％でした。 0。5g/kgの。
ラット心臓のミトコンドリア電子伝達に対するHerbaCistanche治療の効果
MTTの減少を監視することによって測定された孤立したミトコンドリアにおける電子伝達の程度。 アッセイに使用した基質は、ピルビン酸またはコハク酸のいずれかでした。
図1.exvivoでのラット心臓のミトコンドリアATP生成能力に対するHerbaCistanche治療の効果
各バーは平均±SEMを表し、n{{0}}です。 動物をHerbaCistancheで指示された1日量で3日間経口投与した。 ATP生成能力は、「材料と方法」で説明されているように測定されました。 データは、それぞれの未処理の対照群の値（AUC2）に対するパーセント対照で表されました。 ∗それぞれの未治療対照群とは有意に異なります。 0.5g/kgのHerbaCistanche治療群とは有意に異なります。
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図2.ラット心臓のミトコンドリア電子伝達に対するHerbaCistanche治療の効果
各バーは平均±SEMを表し、n{{0}}です。 （a）ピルビン酸でサポートされている（b）コハク酸でサポートされているミトコンドリアの電子伝達は、「材料と方法」で説明されているように、MTT還元によって測定されました。 データは、未処理のコントロール値のパーセンテージで表されました[ピルビン酸サポート：OD57 0 nm- OD63 0 nm=0。0206±0.0001（SEM）、n {{ 10}}; コハク酸サポート：男性、0.255±0.015、n= 5]。 ∗それぞれの未処理の対照群とは有意に異なる。 0.5g/kg群とは大きく異なります。
図2aに示すように、Herba Cistanche治療は、ラットの心臓でピルビン酸によってサポートされるミトコンドリアの電子輸送の程度を用量依存的に増加させ、0 .5 g/kgの用量で最適な刺激を観察できました。 しかし、コハク酸によってサポートされるミトコンドリア電子輸送の程度に有意な変化は、Herba Cistancheで処理されたラットの心臓では検出されませんでした（図2b）。
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