パート2：アクテオシドとその誘導体の抗酸化と細胞保護：比較と機構化学
Mar 02, 2022
Xican Li 1,2、*、†ID、Yulu Xie 1,2、†、Ke Li 3,4、Aizhi Wu 1,2、*、Hong Xie 1,2、Qian Guo 1,5 Penghui Xue 1、Yerkingul Maleshibek 1、Wei Zhao 6、Jiasong Guo 7、Dongfeng Chen 3
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com
1広州中国医学大学、広州510006、中国の中国ハーブ医学部。 xieyulu1900@163.com（YX）; xiehongxh1@163.com（HX）; 15622178307@163.com（QG）; 15228738137@163.com（PX）; pandiphd@163.com（YM）
2広州漢方大学TCMの革新的な研究開発研究所、
広州510006、中国
3広州中国医学大学基礎医学部、広州510006、中国。 ys1090992678@163.com（KL）; chen888@gzucm.edu.cn（DC）
4広州中国医学大学基礎統合医学研究センター
広州510006、中国
5広東薬科大学基礎医学部、広州510007、中国
6中山医学部、中山大学、第74中山路。 2、広州510080、中国;
7中国、広州510515、南部医科大学組織学および発生学科。
plsはパート1にここをクリックしてください
4.3。 PTIO・-スカベンジングアッセイ
PTIO・スカベンジングアッセイ（pH4.5またはpH7.4）は、私たちの方法[16]に基づいて実施されました。 簡単に説明すると、テストサンプル溶液（x=0 – 2 0 L、pH4.5の場合は1mg / mL、pH7.4の場合は0。5mg / mL）を（20 .x）95％エタノールL、続いてPTIO・水溶液80 L。PTIO・水溶液は、リン酸バター溶液（0.1 mM、pH4.5またはpH7.4）を使用して調製しました。 混合物を３７度で２時間維持し、次に前述のマイクロプレートリーダーを使用して５６０ｎｍで吸光度を測定した。 PTIO・阻害率は次のように計算されました。
ここで、A 0はサンプルを含まないコントロールの吸光度、Aはサンプルを含む反応混合物の吸光度です。
4.4。 ABTS plus・-スカベンジングおよびDPPH・-スカベンジングアッセイ
ABTS・プラス掃気活性は、方法[37]に従って評価されました。 ABTS plus・は、0 .2 mLのABTS二アンモニウム塩（7.4 mmol / L）を0。2 mLの過硫酸カリウム（2.6 mmol / L）と混合することによって生成されました。 混合物を室温で12時間暗所に保持してラジカル生成を完了させた後、蒸留水（約1：2 0の比率）で希釈して、734nmでの吸光度を{ {16}}。35o0。01前述のマイクロプレートリーダーを使用。 除去活性を測定するために、テストサンプル（x=4 – 20 L、0.05 mg / mL）を（20 .x）Lの蒸留水に加え、続いて80 LのABTSプラス・試薬を加え、吸光度を測定しました。 734 nmで、最初の混合の3分後に、蒸留水をブランクとして使用して測定しました。
DPPH・ラジカル除去活性は、以前に記載されたように決定されました[18]。 簡単に説明すると、75 LのDPPH・溶液（0 .1 M）を、メタノールに溶解した指定濃度のサンプル（0。025 mg / mL、5〜25 L）と混合しました。 混合物を室温で30分間維持し、前述のマイクロプレートリーダーを使用して519nmで吸光度を測定した。 ABTSプラス・-スカベンジング活性およびDPPH・-スカベンジング活性のパーセンテージは、セクション4.3に示されている式に基づいて計算されました。
cistanche美白機能があります
4.5。 DPPH・反応生成物のUPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS分析
この方法は、以前の研究[25]に基づいています。 のメタノール溶液アクテオシドメタノール中のDPPH・ラジカルの溶液とモル比1：2で混合し、得られた混合物を室温で24時間インキュベートしました。 次に、生成物の混合物を0。22- mフィルターでろ過し、C18カラム（2。0mmid土10{）を備えたUPLCシステムを使用して分析しました。 {13}} mm、1.6 m、Phenomenex、Torrance、CA、USA）。 移動相はシステムの溶出に使用され、メタノール（相A）と水の混合物（相B）で構成されていました。 カラムは、次のグラジエント溶出プログラムを使用して、0.3 mL / minの流速で溶出しました。0〜10分、60〜100パーセントA。 10〜15分、100パーセントA。さまざまな成分を分離するために、サンプル注入量を1Lに設定しました。 ESI-Q-TOF-MS / MS分析は、負イオン化モードで実行されたESIソースを備えたトリプルTOF 5600プラス質量分析計（AB SCIEX、マサチューセッツ州フレーミングハム）を使用して実行されました。 スキャン範囲は100〜2000Daに設定されました。 システムは、次のパラメータで実行されました。イオンスプレー電圧、.4500 V; イオン源ヒーター、550度; カーテンガス（CUR、N2）、30 psi; 噴霧ガス（GS1、空気）、50 psi; Tisガス（GS2、空気）、50psi。 デクラスタリングポテンシャル（DP）は.100 Vに設定され、衝突エネルギー（CE）は.40 Vに設定され、衝突エネルギー拡散（CES）は20 Vに設定されました。RAF生成物は、トータルイオンクロマトグラム（補足2）。
前述の実験は、フォルシトシドB、ポリウモシド、およびカフェー酸を使用して繰り返されました。 対応するm/zピークは、トータルイオンクロマトグラム（補足2）の対応する分子式から抽出されました。
4.6。 Fe2プラスキレート製品のUV-Vis-Spectra分析
のFe2プラスキレート反応生成物アクテオシド-Fe2 plusは、UV-Vis-spectroscopy[13]を使用して評価されました。 実験のために、300Lのメタノール溶液アクテオシド（0 .24 mM）をFeCl2×4H2O（168 mM）の水溶液700Lに加えた。 次に、溶液を激しく混合した。 続いて、得られた混合物を、200〜850 nmで1時間後にUV-Vis分光光度計（Unico 2600A、上海、中国）を使用してスキャンしました。 前述の実験は、代わりにフォルシトシドBまたはポリウモシドを使用して繰り返されましたアクテオシド.
4.7。 スーパーオキシドアニオン（・O2。）スカベンジングのためのピロガロール自動酸化アッセイ
スーパーオキシドアニオン（・O2。）スカベンジング活性の測定は、私たちの方法に基づいていました[17]。 簡単に説明すると、サンプルを1 mg/mLのエタノールに溶解しました。 サンプル溶液（x L）を、EDTA（1 mM）を含むTris-HClバッファー（980。xL、0.05 M、pH 7.4）と混合しました。 20Lのピロガロール（1mMHCl中60mM）を加えたとき、混合物を直ちに室温で振とうした。 混合物の325nmでの吸光度を、ブランクとしてTris-HClバッファーに対して30秒ごとに5分間測定しました（Unico 2100、上海、中国）。 ・O2。 掃気能力は次のように計算されました。
ここで、△A325nm、制御はサンプルなしの混合物のA325nmの増分であり、△A325nm、サンプルはサンプルありの混合物のA325nmの増分です。 T= 5分 実験温度は37℃でした。
4.8。 酸化ストレスを受けたbmMSCに対する細胞保護効果（MTTアッセイ）
bmMSCは、以前のレポート[38]に従って、わずかな変更を加えて培養されました。 簡単に言えば、骨髄はラットの大腿骨と脛骨から得られました。 骨髄サンプルは、1 0パーセントのFBSを含むDMEM（低グルコース）で希釈されました。 ｂｍＭＳＣは、１．０７３ｇ ／ ｍＬのパーコールで９００ｇで３０分間の勾配遠心分離によって調製された。 調製した細胞を0.25％トリプシンで処理することにより剥離し、1土104/cm2で培養フラスコに移しました。 継代3のbmMSCは、MTTアッセイを使用したCD44の検出を使用して、培養細胞の均一性について評価されました[39]。
MTTアッセイは、の細胞保護効果を評価するために使用されましたアクテオシドおよびbmMSCに対するその派生物[40]。 傷害モデルは、以前の研究[41]に基づいて確立されました。 実験プロトコルを図3に簡単に示します。
cistanche抗酸化による肌の美白効果
4.9。 統計分析
セクション4.2〜4.4および4.7の各実験は3回実行され、MTTアッセイ実験は5回実行されました。 データは平均値oSD（標準偏差）として記録されました。 用量反応曲線は、Origin 6。0プロフェッショナルソフトウェア（OriginLab、米国マサチューセッツ州ノーサンプトン）を使用してプロットされました。 IC5 0値は、5 0パーセントのラジカル阻害（相対還元力）の最終濃度として定義されました[42]。 一元配置分散分析によって統計的比較を行い、Windows用のSPSS 13.0（SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国）を使用して有意差を検出しました。 p<>
5。結論
3つの自然フェニルプロパノイド配糖体、すなわち、アクテオシド、フォルシトシドB、およびポリウモシドは、ET、Hプラス転移、Fe2プラスキレートを含む抗酸化作用を発揮する複数の経路に関与する可能性がありますが、RAFは関与しません。 ETおよびHプラス転移経路は、ラムノシル部分またはアピオシル部分によって妨げられる可能性があります。 ただし、Fe2とキレート経路は糖残基（特にラムノシル部分）によって強化される可能性があります。 ラムノシル部分またはアピオシル部分の一般的な効果は、複数の経路が関与するROS捕捉能力を強化することです。 したがって、フォルシトシドBとポリウモシドはより優れていますアクテオシド細胞保護効果において。
補足資料：補足資料はオンラインで入手できます。 1.用量反応曲線; 2.HPLC-MSスペクトル; 3.の分析証明書アクテオシド、forsythoside B、およびpoliumoside。
謝辞：この作品は、中国国立科学財団（81573558、81603269）、広東科学技術プロジェクト（2017A050506043）、および広東省自然科学財団（2017A030312009、2015A030310491）によってサポートされました。
著者の貢献：XicanLiとDongfengChenが実験を考案し、設計しました。 AizhiWuはポリウモシドを準備しました。 Yulu Xie、Qian Guo、PenghuiXueが抗酸化実験を行いました。 KeLiとWeiZhaoがMTT実験を行いました。 HongXieがデータを分析しました。 JiasongGuoは図2Dの実験を行いました。 XicanLiが論文を書きました。 すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
利害の対立：著者は利害の対立を宣言しません。
略語
ABTS plus・2,2→-and-bis（3-エチルベンゼン-チアゾリン-6-スルホン酸）ラジカルbmMSC骨髄由来間葉系幹細胞
CUPRACキュプリックは抗酸化能力を低下させます
dAMP2'-デオキシアデノシン-5'-一リン酸ラジカルDMEMダルベッコ改変イーグル培地
dGMP 2'-デオキシグアノシン-5'-一リン酸ラジカルDPPH・1、1-ジフェニル-2-ピクリル-ヒドラズルラジカル
ET電子移動; FBS：ウシ胎児血清
抗酸化力を低下させるFRAP第二鉄イオン; HAT水素原子移動
MTT 3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルPCETプロトン共役電子移動
PTIO・2-フェニル-4、4,5、5-テトラメチルイミダゾリン-1-オキシル3-オキシドラジカルRAFラジカル付加物の形成
ROS活性酸素種
SCNT体細胞核移植
SEPTシーケンシャル電子-プロトン移動
SPLETシーケンシャルプロトンロスシングルエレクトロントランスファーTPTZ2,4、6-トリピリジルトリアジン
Trolox（o）-6-ヒドロキシル-2、5,7、8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸
Cistancheアクトシドには抗酸化作用と老化防止作用があります
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