パート2：エキナコシドはラット大脳皮質神経終末における電位依存性Ca2プラスエントリーおよびプロテインキナーゼCを抑制することによりグルタミン酸放出を阻害する
Mar 05, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2、Tzu Yu Lin 1,2、Shu Kuei Huang 1、Su Jane Wang 3 *
3.2治療上の意味
過剰なグルタミン酸放出およびグルタミン酸受容体活性化によって引き起こされる病的過程である興奮毒性は、脳卒中、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病などの急性および慢性脳障害における神経学的死の主な原因であり[13,41]、治療戦略グルタミン酸放出阻害を伴うことは、そのような疾患を治療するための有望な神経保護戦略である可能性があります。 エキナコシドは、血液脳関門（BBB）に浸透することが確認されており、神経毒性のさまざまなin vivoモデルで神経保護効果を示します[8、10–12、42]。 これらの神経保護効果のメカニズムは完全には理解されていませんが、炎症反応の抑制、ミトコンドリア機能の安定化、抗酸化、フリーラジカル捕捉、神経栄養機能の模倣など、いくつかの可能なメカニズムが報告されています[5,9,12,42]。 現在の研究では、エキナコシド神経終末からのグルタミン酸放出を減らすことも、その神経保護メカニズムを部分的に説明するかもしれません。 ただし、この効果がエキナコシドグルタミン酸興奮毒性に関連する脳障害では、さらなる研究が必要です。
4.材料および方法
4.1。 化学薬品
Fura -2-アセトキシメチルエステル（Fura -2- AM）および3'、3'、3'-ジプロピルチアジカルボシアニンヨージド[DiSC3（5）]は、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）から購入しました。 o-コノトキシンMVIIC、ロトリン、2- [1-（3-ジメチルアミノプロピル）インドール-3-イル] -3-（インドール-3-イル）マレイミド（ GF109203X）、5,6,7、13-テトラヒドロ- 13-メチル-5-オキソ-12 H-インドール[2、3- a]ピロロ[3、{ {27}} c]カルバゾール-12-プロパンニトリル（Go6976）およびN-[2-（p-ブロモシンナミルアミノ）エチル] -5-イソキノリンスルホンアミド（H89）は、Tocris Bioscience（Bristol、UK）から購入しました。 ）。エキナコシド、ダントロレン、DL-スレオ-ベータ-ベンジル-オキシアスパラギン酸（DL-TBOA）、7-クロロ-5-（2-クロロフェニー）-1、5-ジヒドロ{ {10}}、1-ベンゾチアゼピン-2（3H）-オン（CGP37157）、2-（2-アミノ-3-メトキシフェニル）-4 H -1-ベンゾピラン-4-オン）（PD98059）、エチレングリコールビス（-アミノエチルエーテル）-N、N、N /、N /-四酢酸（EGTA）およびその他すべての試薬はSigma-から購入しました。 Aldrich Co.（セントルイス、ミズーリ州、米国）。
4.2。 動物
生後2ヶ月のオスのSprague-Dawleyラットを使用した。 動物は標準化された環境条件（22±1 oC、相対湿度50％、12時間の明暗サイクル）で飼育され、餌と水を無制限に摂取できました。 動物は断頭により殺され、大脳皮質は4℃で急速に除去された。 実験手順は、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って、Fu Jen Institutional Animal Care and UtilizationCommittee（A10259）によって承認されました。 動物の苦痛を最小限に抑え、信頼できる結果を生み出すために必要な最小限の動物を使用するために、あらゆる努力が払われました。
4.3。 シナプトソーム調製物
シナプトソームは、以前に記載されているように[43,44]、不連続なパーコール勾配でラットの大脳皮質から精製されました。 簡単に説明すると、組織を0 .32 Mスクロース（pH 7.4）を含む培地でホモジナイズし、ホモジネートを3000×g（5 {{25}）で10分間遠心分離しました。 } 0 0 rpm、JA25.5ローター;Beckman Coulter、Inc.、Miami、FL、USA）および4 oCで、上清を再度12分間14,500×gで遠心分離しました（11、 000 JA 25.5ローターのrpm）。 ペレットを0.32Mスクロース（pH 7.4）に穏やかに再懸濁し、このシナプトソーム懸濁液（2 mL）のアリコートを、0.32 Mスクロース、1 mM EDTA、0.25 mM DL-ジチオスレイトール、および3パーセント、10パーセント、および23パーセントのパーコール（pH 7.4）。 32,500×g（JA20.5ローターで16,500rpm）で4 oCで7分間遠心分離した後、シナプトソームを10％から23％のパーコールバンドから回収し、最終容量30mLで希釈しました。 HEPESバッファー培地（140 mM NaCl、5 mM KCl、5 mM NaHCO3、1 mMMgCl2﹒6H2O、1.2 mM Na2HPO4、10 mMグルコース、および10 mM HEPES（pH 7.4））。 27、000×g（JA25.5で15,000rpm）で10分間さらに遠心分離した後、シナプトソームペレットを3 mLのHEPESバッファー培地に再懸濁し、ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質含有量を測定しました。 最後に、0.5mgのシナプトソーム懸濁液を10mlのHEPES緩衝液で希釈し、3000×g（JA20.1ローターで5000rpm）で10分間遠心分離しました。 上清を捨て、シナプトソームを含むペレットを氷上で保存し、4〜6時間以内に使用しました。
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4.4。 グルタミン酸放出
グルタミン酸の放出は、以前に記載されているようにオンライン蛍光測定によってアッセイされました[45,46]。 シナプトソームペレットをHEPESバッファー培地（0 .5 mg / mL）に再懸濁し、16 uMウシ血清アルブミンの存在下で37oCで10分間プレインキュベートして、プレインキュベーション中にシナプトソームから放出された遊離酪酸を結合しました。 シナプトソームの2-mLアリコートを、2 mM NADPプラス、50ユニットのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、および1.2 mM CaCl2を含む攪拌キュベットに移し、NADPHの蛍光をPerkin-ElmerLSで測定しました{{14 }}分光蛍光光度計（PerkinElmer Life and Analytical Sciences、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）、それぞれ340nmと460nmの励起波長と発光波長。 シナプトソームは電気刺激を受けにくいため、カリウムチャネル遮断薬4-ファンプリジンを使用してグルタミン酸の放出を刺激しました。 4-アミノピリジンは膜電位を不安定にし、電位依存性Ca2プラスチャネルの活性化と神経伝達物質放出につながるシナプス末端のinvivo脱分極に非常に近い反復的な自発的Naプラスチャネル依存性脱分極を引き起こすと考えられています[47 ]。 データは2秒間隔で取得されました。 各実験の最後に、外因性グルタミン酸の標準（5 nmol）を追加しました。 標準添加によって生成された蛍光変化の値を使用して、放出されたグルタミン酸を、シナプトソームタンパク質1ミリグラムあたりのグルタミン酸のナノモル（nmol / mg）として計算しました。 本文で引用されている放出値は、5分間の脱分極後の定常状態で達成されたレベルです（nmol / mg / 5分）。 累積データは、Lotus 1-2-3スプレッドシート（IBM、ホワイトプレーンズ、ニューヨーク、米国）およびMicroCal Origin（OriginLab Corporation、ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国）を使用して分析されました。
4.5。 原形質膜電位
原形質膜電位は、膜電位感受性色素、DiSC3（5）[48]で測定されました。 シナプトソームをHEPESバッファー培地に再懸濁し、2 mLのアリコートを、Perkin–Elmer LS -55分光蛍光光度計（PerkinElmer Life and Analytical Sciences、マサチューセッツ州ウォルサム）で37°Cの5 uM DiSC3（5）を含む攪拌キュベットに移しました。 、米国）。 混合物を３分間平衡化させた後、蛍光を、それぞれ６４６および６７４ｎｍの励起および発光波長で決定した。 データは2秒間隔で収集されました。 累積データは、MicroCal Origin（OriginLab Corporation、Northampton、MA、USA）を使用して分析され、蛍光単位で表されました。
4.6。 サイトゾルCa2プラス濃度（[Ca2プラス] C）
[Ca2 plus] Cは、Ca2plusインジケーターフラ-2で測定しました。 シナプトソーム（0 .5 mg / mL）を、5uMフラ-2および0。1mM CaCl2を含むHEPESバッファー培地で、攪拌した試験管内で37oCで30分間プレインキュベートしました。 。 フラ-2をロードした後、シナプトソームをマイクロ遠心分離機で3000×g（5000 rpm）で30秒間遠心分離しました。 シナプトソームペレットをHEPESバッファー培地に再懸濁し、シナプトソーム懸濁液をPerkin-Elmer LS -55分光蛍光光度計（PerkinElmer Life and Analytical Sciences、米国マサチューセッツ州ウォルサム）のサーモスタット付きキュベットで攪拌しました。 3分後にCaCl2（1 mM）を添加し、さらに10分後にさらに添加しました。 蛍光データは、励起波長340および380 nm（発光波長505 nm）で2秒間隔で蓄積されました。 [Ca2 plus] C（nM）は、キャリブレーション手順[49]および前述の式[50]を使用して計算されました。 累積データは、MicroCal Origin（OriginLab Corporation、Northampton、MA、USA）を使用して分析されました。
4.7。 ウエスタンブロッティング
シナプトソームを溶解バッファー（10 mM HEPESバッファー、pH 7.4）、1％Triton X -100、およびプロテアーゼ阻害剤混合物でホモジナイズしました。 ライセートを遠心分離により清澄化し、タンパク質アッセイキット（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA）を使用してタンパク質濃度を測定しました。 等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写しました。 膜を5％低脂肪ミルクを含むトリス緩衝生理食塩水でブロックし、適切な一次抗体（ホスホプロテインキナーゼC（パン）、1：3000、NOVUS Biologicals Inc.、米国マサチューセッツ州ビバリー）と一晩インキュベートしました。 4°C。 トリス緩衝生理食塩水で3回洗浄した後、メンブレンを二次西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（1：3000）で室温で1時間処理しました。 次に、膜をトリス緩衝生理食塩水で少なくとも3回洗浄し、強化された化学発光システム（Amersham、バッキンガムシャー、英国）を使用して視覚化した。 サンプルのアリコートをロードし、ロードコントロールとしてPKCを検出するために抗PKC抗体でプローブしました。 発現またはリン酸化のレベルは、デンシトメトリーによって定量化されたバンド密度によって評価されました。 バンドのデンシトメトリーによる定量化は、Syngeneソフトウェア（Synoptics、ケンブリッジ、英国）を使用して分析しました。
4.8。 統計分析
データは単一のシナプトソーム調製物から得られたものであり、互いに独立していませんでした。 薬物対対照の効果の有意性をテストするために、両側スチューデントのt検定が使用されました。 追加の比較が必要な場合（2回目の治療がエキナコシドの作用に影響を与えたかどうかなど）、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定を使用しました。 分析は、ソフトウェアSPSS（17。0; SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ、米国）を介して完了しました。 データは平均±SEMとして表されます。 有意性は、すべての統計的尺度についてp<>
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5。結論
これは、エキナコシドがCav2.2およびCav2.1チャネルを介したCa2と流入を減らすことにより、ラット大脳皮質シナプトソームからのグルタミン酸放出を阻害することを示す最初の研究であり、この放出阻害は、少なくともプロテインキナーゼC経路の抑制に依存している可能性があります。部。 それが脳におけるエキナコシドの作用機序への新しい洞察を提供するので、現在の発見は価値があります。
謝辞：この作品は、科学技術省からの助成金によってサポートされていました（MOST 103-2320- B -030-001 MY3）。
著者の貢献：TzuYuLinとSuJaneWangが実験を考案し、設計しました。 ChengWeiLuが実験を行いました。 ChengWeiLuとShuKueiHuangがデータを分析しました。 SuJaneWangが論文を書きました。
利害の対立：著者は利害の対立を宣言しません。
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