パート2：超音波支援抽出を使用してピーナッツの殻から分離された生物活性化合物の美白と抗しわ効果
Mar 25, 2022
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2.4。 CAIに対する抽出条件の影響
コラーゲンは哺乳類で最も豊富なタンパク質であり、14 00アミノ酸より長いgly-pro-hyp反復単位を持つ細胞外マトリックスの主要な構造成分です。 コラゲナーゼは、皮膚、骨、腱、靭帯を形成するコラーゲンのペプチド結合を分解する酵素です。 真皮に存在するコラーゲンはコラゲナーゼによって分解され、皮膚のしわを引き起こし、皮膚の弾力性を低下させます。 したがって、皮膚のしわを防ぐためにコラゲナーゼの活性を低下させる必要があります[32,33]。 ピーナッツ殻抽出物のCAIを最大化するために、UAE条件の最適化が実行されました。 3つの個別の変数を最適化するには、合計17回の実行が必要であり、実験セットで得られたCAIの実験データは25.2パーセントから92.3パーセントでした（表2）。 17回の実験に基づいて、実験データに重回帰分析を適用することにより、応答と独立変数は、表3に示すコード化パラメーターに関して、次の2次回帰方程式によって関連付けられました。次に、ANOVAを適用して回帰係数を決定しました。 、統計的有意性、および数学モデルを適合させるため。 平均二乗値は、各変動源の二乗の合計を自由度で割ることによって計算され、95％の信頼水準（= 0。0 5）が統計を決定するために適用されました。二次モデルの分析における重要性。 ANOVAの結果は、2次回帰方程式のR2が0。8862であり、p値が0.0134であり、有意水準（p <0.05）よりも小さいことを確認しました。これは、適合および統計の優れたモデルを示しています。 cai値を予測するための重要性。="" 一次項では、x2とx3が有意な効果を示し、相互作用効果の項はx1x2とx2x3で有意でした（p=""><0.05）。 cai生成に対するuae条件の影響は、抽出温度（p="0。0236）">エタノール濃度（p=0。0240）>抽出時間（p {{37 }}。8505）、したがって、抽出温度とエタノール濃度の影響がCAIに有意であったことを示しています。
図1cは、2つの変数が固定され、CAIに対する1つの変数の影響を視覚化した摂動プロットを示しています。 CAIに対する3つの変数すべての効果は類似していることが示され、3つの変数は有意な効果を示し、各独立変数が増加するにつれてCAIが増加およびその後減少しました。 私たちの研究では、2次回帰方程式を使用してCAIの2つの独立変数の相互作用を視覚化するために、3D表面応答曲線が作成されました（図4）。 エタノール濃度を中心点に固定した場合、CAIに対する抽出時間と温度の影響を図4Aで評価しました。 2つの変数が同時に変更されると、CAIは次のように増加しました。
33.4分および76.8Cで、最大CAIが92.8％になった後、再び減少しました。 図4B、Cに示すように、CAIは64.3％のエタノール濃度で最も高い値を示し、その後徐々に減少する傾向を示しています。これは、64.3％のエタノールからなる二成分溶媒が抽出溶媒としてより適していることを示しています。 この結果は、水とエタノールの二成分溶媒が、ツメレンゲからの生物活性化合物の抽出において水よりも高いCAIを示したことを報告した以前の研究と一致しています。これは、50％エタノールが抽出に有利であることを示唆しています。肌-ホワイトニング 材料[34]。 二次回帰モデルによって予測されたピーナッツシェル抽出物の最大CAIは94.5％であり、これは抽出時間45.1分、抽出温度93.6 C、エタノール濃度42.3％の条件下で得られました。 私たちの研究で得られたCAIは94.5％でした。これは、Ohらによって報告された緑茶抽出物のCAI値の39.4％と40.3％の2倍以上の効果です。 [35]。
図4.抽出時間、抽出温度、およびエタノール濃度に応じたピーナッツ殻抽出物のCAIの応答曲面プロット。 抽出温度と抽出時間（A）、抽出時間とエタノール濃度（B）、および抽出温度とエタノール濃度（C）の関数としてのCAI。
2.5。 最適な抽出条件
酸化防止剤、皮膚-ホワイトニングしわ防止効果はすべて化粧品にとって重要な機能であり、UAEの条件を最適化するには、これら3つの機能を同時に最大化できる条件を導き出す必要があります。 図5は、二次回帰方程式によって導出された等高線グラフの各最適条件をオーバーラップすることにより、RSA（Y1）、TAI（Y2）、およびCAI（Y3）を同時に最大化できる最適化手順を示しています。 3つの変数を最適化するための独立変数の範囲は、抽出時間5。0〜55。0分、抽出温度26に制限されていました。{{1 0}} 〜94。0 .C、およびエタノール濃度0。0パーセント〜99.5パーセント（表5）。 個々の最適な抽出条件によると、最適なUAE条件は、抽出時間31.2分、抽出温度36.6 .C、エタノール濃度の93.2パーセントであり、上記の条件下では、RSAは74.9パーセント、TAIは50.6パーセント、CAIは{ {28}}。8パーセントが予測されました。 予測されたRSA、TAI、およびCAIの値を検証のための実験から得られた値と比較した場合、検証テストの値は予測値の値と類似しており、値は78.2パーセント、52.3パーセント、および87.7パーセントでした。それぞれ。
図5.RSA（パーセント）、TAI（パーセント）、およびCAI（パーセント）を最大化するための3つの変数を同時に最適化するための等高線マップの重ね合わせ。 エタノール濃度は93.2パーセントの最適レベルに固定されました。
表5.さまざまな抽出条件でソックスレー抽出（SE）と超音波支援抽出（UAE）によって得られたピーナッツ殻抽出物のRSA、TAI、およびCAIの比較。
1 CCDの中心点の下でのピーナッツ殻の超音波支援抽出（実行番号15、16、17）。 最適な抽出条件下でのピーナッツ殻の2つの超音波支援抽出。
2.6。 SEとUAEの比較
UAEの抽出効果を確認するために、UAEおよびソックスレー抽出（SE）技術を使用して製造されたピーナッツ殻抽出物のRSA、TAI、およびCAIを比較します。 SEを一般的なSE条件下で、7 0 .Cで99.5％のエタノールを使用して4時間抽出した場合、RSA、TAI、およびCAIは75.5％、60.2％、および74.4％であることがわかりました。最適なUAE条件下で得られた結果と大差ありませんでした。 ただし、SE条件をUAEの最適条件である31.2分および93.2パーセントのエタノールに等しく設定すると、RSA、TAI、およびCAIは、最適な条件下のUAEと比較して、それぞれ62.0、28.3、および45.6パーセント減少しました。 ピーナッツの殻から有用な材料を製造する際の超音波の利点は、溶媒消費量が少なく、抽出時間が短いため、高い生産性と工業化に適したプロセスとして評価されました。
2.7。 MMP-3およびTRP-1のmRNA発現
哺乳類のメラノサイトでは、メラニン形成とコラーゲン加水分解はそれぞれTRPとMMP遺伝子によって制御されており、TRP{{0}}とMMP-3はメラニン形成とコラーゲン加水分解の調節の主要な遺伝子として知られています; したがって、B 16- F 0細胞の全細胞溶解物のRT-PCR分析を実施し、最適な条件下（31.2分、36.6 C、93.2パーセント）でUAEから生成されたピーナッツ殻抽出物の効果を調べました。 MMP-3とTRP-1のmRNA発現について研究した。 図6に示すように、ピーナッツ殻抽出物は、ピーナッツを用いて遺伝子発現実験を行った場合、B 16-F0細胞におけるMMP-3およびTRP-1の発現を大幅にダウンレギュレーションしました。 0〜1 mg/mLの殻抽出物濃度範囲。 ピーナッツシェル抽出物は、1。0mgでMMP-3とTRP-1の発現をそれぞれ6.1-倍と8.7-倍大幅に減少させました。 /mL。 これらの結果は、ピーナッツ殻抽出物がMMP-3の不活性化からMMP-1の不活性化によってB16F0細胞のコラーゲン分解を阻害し、MMP-9の協力を妨げることを示唆しています[36]。 既存の研究は、植物抽出物による治療が、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ERK）をリン酸化することにより、小眼球症関連転写因子（MITF）の発現を阻害することを示しています。 したがって、ピーナッツ殻抽出物によるメラニン生成の阻害効果は、ERKおよびMITFの発現阻害によるチロシナーゼ活性の阻害に起因します[37]。 したがって、ピーナッツ殻抽出物は、TRP-1およびMMP-3のmRNA発現レベルを低下させました。これは、ピーナッツ殻抽出物がコラーゲン分解およびメラニン形成に対して強力な阻害活性を有し、皮膚を備えた優れた化粧品材料であることを示しています。ホワイトニングしわ防止効果。
図6.TRP-1およびMMP-3mRNAの発現に対するピーナッツ殻抽出物の影響。 B 16- F 0細胞を、さまざまな濃度のピーナッツ殻抽出物で24時間処理しました。 MMP-9およびTRP-1のmRNAレベルは、RT-PCRを使用して測定されました（a）。 バンド強度は、Quantity Oneソフトウェアを使用して推定され、-actin（* p <0。05）に正規化されました。 すべてのデータは、3回行った3回の別々の実験の平均osdとして表されます。="" nt="未処理サンプル、TRP" -1="" mrna発現の定量化（a）、mmp="" -3="">
cistanchephelypaesは肌に利益をもたらします
3.材料と方法
3.1。 材料と試薬
ピーナッツの殻は3月2日019にNonghyupmart（高敞、全羅北道）から購入し、乾燥オーブン（FC 49、ラボハウス、ソウル、韓国）を使用して60°Cで24時間乾燥させました。乾燥重量は一定のままでした。 乾燥したピーナッツの殻をフードプロセッサー（Hanil HMF -3800、ソウル、韓国）を使用して粉砕し、600 µmのふるいに通しました。 エタノールはSamchunChemical（95.0％v / v、ソウル、韓国）から購入しました。 Folin– Ciocalteu試薬、没食子酸（97％）、およびケルセチンはMerck（Kenilworth、NJ、USA）から購入しました。 2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）、アスコルビン酸、および3、4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン（L-DOPA）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、 MO、USA）。 この実験で使用された他のすべての化学物質は分析グレードであり、Sigma-Aldrichから購入しました。 すべてのストック溶液は、Milli-Q精製システム（Millipore、バーリントン、バーモント州、米国）を使用して精製脱イオン水で調製しました。
3.2。 超音波支援抽出およびソックスレー抽出
粉末ピーナッツ殻（1 g）を抽出容器に入れ、それぞれ1 0 mLの溶媒を入れ、ボルテックスミキサー（VM -10、大韓科学株式会社、ウォンジュ、韓国）を使用して混合しました。 1分間。 抽出は、外部冷蔵浴サーキュレーター（CDRC8、大韓科学株式会社、原州、韓国）デジタルタイマーと温度コントローラー付き。 抽出は、デジタルタイマーと温度コントローラーを備えた超音波装置を使用して実行されました。 サンプルは、40kHzの動作周波数でさまざまな実験期間と温度で超音波処理されました。 次に、抽出物を10、000 rpmで10分間遠心分離しました（236R、Labogene、ソウル、韓国）。 遠心分離後、サンプル量を5 mLにし、分析前に0.2 µmメンブレンフィルターでろ過しました。 ソックスレー抽出では、粉末ピーナッツ殻（5 g）を、ソックスレー抽出器で最高温度70°Cで4時間（8サイクル）99.5パーセントエタノールを使用して100mLで連続抽出しました。 超音波支援抽出技術は、ブドウ種子からの油の抽出に非常に効率的であることが示されました。油とポリフェノールの両方の従来の抽出方法と比較して、超音波の利点は、より低い溶媒で得られる油/ポリフェノールの収率と同様でした。消費とより短い抽出時間。
cistanchetubolosa抽出物
3.3。 実験計画
実験計画は、RSMの一種であるCCDを使用して実行され、実験の実行回数を最小限に抑え、要因間の相互作用を研究しました。 Design-Expert®ソフトウェア8.0（State-Ease、City、MN、USA）は、実験計画法、データ分析、および抽出条件の最適化に使用され、抗酸化剤、皮膚-ホワイトニング、およびピーナッツの殻からの抗しわ効果。 実験はCCDに従って設計され、提示された3つの独立変数の範囲と中心点の値は、予備実験の結果に基づいていました（表1）。 CCDは、ピーナッツの殻からのRSA、TAI、CAIなどの応答を最大化するための最適なUAE条件を予測するために適用されました。 独立変数として、選択された3つの変数は、抽出時間（X1）、抽出温度（X2）、およびエタノール濃度（X3）でした。 再現性を推定するために、中心点で3回の反復を行って、合計17回の実験を実行しました。 式（1）に示すように、2次回帰モデルを使用して実験データを適合させ、応答変数を予測するために適用しました。
Y= 0 + 1X1 + 2X2 + 3X3 + 11X12 + 22X22 + 33X32 + 12X1X2 + 13X1X3 + 23X2X3（1）
ここで、Yは予測された応答です。 0は定数（インターセプト）です。 1、2、および3は、線形効果項の回帰係数です。 11、22、および33は2次効果の項です。 12、13、および23は、それぞれ相互作用効果の項です。 応答曲面分析とANOVAを使用して、モデル項の回帰係数と統計的有意性を決定し、実験の数学的モデルを適合させました[38]。
3.4。 DPPHラジカルスカベンジングアクティビティ（RSA）
ピーナッツシェル抽出物のRSAは、Pereira-Caroetal。 [39]。 0。0メタノール中の1mMDPPH（95パーセント）の溶液を調製し、1.25mLを0.25mLの希釈抽出物に添加しました。 RSAは、UV-Vis分光光度計（UV1650PC、島津製作所、京都、日本）を使用して、20分間のインキュベーション後に517nmでの吸光度を測定するように決定されました。 ブランクは蒸留水を使用して調製し、RSAは以下に従って計算しました。
（式（2））：
3.5。 チロシナーゼ活性阻害（TAI）
TAIは、Joらによる基質としてL-DOPAを使用する修正された方法に従って実行されました。 [40]。 サンプルを200µLのL-DOPAおよび200 µLのリン酸カリウムバッファー（pH 6.8）と混合し、200 µLのチロシナーゼ（125 U / mL）を試験管に加え、37°Cで20分間インキュベートしました。 UV-Vis分光光度計を使用して475nmでサンプルの吸光度を測定し、結果をコントロールと比較しました。 各濃度について、酵素活性は、阻害剤を含まない緩衝液を使用したアッセイのそれと比較したパーセンテージとして計算され、TAIは以下の式に基づいて計算された。 （式（3））：
ここで、Abs（コントロール）はバッファーとコラゲナーゼの吸光度です。 Abs（サンプル）は、バッファーとコラゲナーゼとサンプル/標準の吸光度です。
3.6。 コラゲナーゼ活性阻害（CAI）
抽出物のCAIの測定は、WünschとHeindrichの方法を変更することによって実行されました[41]。 基質4-フェニルアゾベンジルオキシルカルボニル-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg（FALGPA）を10mLバッファーに1.2mg/ mLまで溶解し、125 µLの溶液を加えてインキュベートしました。 37.Cで60分 コラゲナーゼを緩衝液に溶解して0.4mg/ mLにし、75 µLの酵素溶液を緩衝液に加えました。 酵素-基質混合物を37℃の水浴中で30分間インキュベートし、75μLの20パーセントクエン酸（w / v）を添加することにより反応を停止させた。 1.5mLの酢酸エチルを加えた後、酢酸エチル層を分離し、320nmで吸光度を測定した。 阻害率は、次の式に従って計算されました。
w
ここで、Abs（コントロール）はバッファーとコラゲナーゼの吸光度です。 Abs（サンプル）は、バッファーとコラゲナーゼとサンプル/標準の吸光度です。
3.7。 細胞株の維持と培養
メラニン産生B16-F 0メラノーマ細胞は、Korea Cell Line Bank（KCLB、Chongno、Seoul、Korea）から入手し、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Sigma-Aldrich、St。ウシ胎児血清（FBS、10％、ウェルジーン、京山、韓国）およびペニシリン-ストレプトマイシンの抗生物質溶液（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO、米国）を補充したルイ、MO、米国）。 トリプシン-EDTA（Gibco、Grand Island、NY、USA）を細胞のトリプシン処理に使用しました。 使用したすべての材料は細胞培養グレードのものでした。
3.8。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
RT-PCRを実行して、MMP-3およびTRP-1遺伝子発現レベルの変化を測定しました。ホワイトニングしわ防止効果として、B 16- F 0細胞を、無血清DMEMでさまざまな濃度のピーナッツ殻抽出物で処理した24-ウェルプレートで培養し、24時間培養しました。 。 未処理の細胞コントロールは、
実験中のテストグループと同じ条件。 細胞からのRNA分離は、AccuPrep®Universal RNA Extraction Kit（Bioneer、Daejeon、Korea）を使用して実施しました。 相補的DNAは、AmfiRiert Platinum cDNA合成マスターミックス（GenDEPOT、バーカー、テキサス州、米国）を使用して合成されました。 CFX 96 touch PCR System（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用してRT-PCR分析を行い、mRNAレベルを測定しました。 使用したプライマーは次のとおりです。MMP-3センス、5 / -AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC -3 /およびアンチセンス、5 /-TACATGAGCGCTTCCGGCAC -3 /; およびTRP{{10}}センス、5 / -GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC - 3 /およびアンチセンス、5 / -AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-3/。 上記の適切なプライマーセットを使用して、次のサイクリング条件を使用してそれぞれの遺伝子を増幅しました：94 .Cで5分間、続いて95°Cで5秒間、60°Cで30秒間を25サイクル（MMP -3の場合） ）、および60 Cで30秒間（TRP -1の場合）、72Cで30秒間の延長。 PCR産物を1％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、Gel Doc TM XR plusSystemおよびQuantityOneソフトウェア2.0（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して視覚化しました。 ハウスキーピングタンパク質である-アクチンは、これらのタンパク質の発現レベルが一定のままであるという仮定の下で、ローディングコントロールとして使用されました。
ニクジュヨウはホワイトニングしわ防止効果
4.結論
この研究では、ピーナッツの殻の農業副産物から生物活性物質を回収して使用し、複数の用途で付加価値のある成分を開発するために、補完的なアプローチが採用されました。 まず第一に、私たちは抗酸化物質、皮膚-で生物活性化合物の抽出効率を高めることを試みましたホワイトニング、UAEプロセスを最適化することによるしわ防止効果。 したがって、この研究では、皮膚を含む生物活性化合物の効率的な生産にUAEを採用しました。ホワイトニングピーナッツの殻によるしわ防止効果と統計ベースの最適化を適用して、RSA、TAI、CAIを同時に最大化します。 アラブ首長国連邦の条件はCCDを使用して最適化され、ピーナッツの殻から生物活性化合物を抽出する際には、溶媒と濃度の選択を考慮する必要があることが確認されました。 応答曲面、3つの従属変数の曲線、31.2分の抽出時間、36.6 Cの抽出温度、93.2％のエタノール濃度がUAEの最適条件であると決定されました。 ピーナッツ殻抽出物のRSAは非常に高く、皮膚の指標であるTAIとCAIの増加が期待できることが確認されています。ホワイトニングそれぞれ、しわ防止効果。 アラブ首長国連邦の条件の最適化により、ピーナッツの殻での生物活性物質の生産が増加することが確認されました。ホワイトニングチロシナーゼおよびコラゲナーゼ活性のダウンレギュレーションによるピーナッツ殻抽出物の抗しわ活性。 これに基づいて、MMPおよびTRPの発現レベルに対するピーナッツの殻の影響を評価して、それらがホワイトニング遺伝子発現レベルでの抗しわ効果。ホワイトニングピーナッツ殻抽出物の抗しわ効果は、mRNA発現のダウンレギュレーションとMMP-3およびTRP-1のタンパク質発現の阻害によって確認されました。 したがって、ピーナッツ殻抽出物は、ホワイトニングタンパク質発現と遺伝子レベルでのしわの改善。 アラブ首長国連邦を使用したピーナッツ殻抽出物は、高い抗酸化作用と優れた肌を持っています-ホワイトニングしわ防止効果があり、ピーナッツの殻に天然の化粧品や食品成分として大きな可能性を与えます。 さらに、UAEを使用した生物活性化合物の製造は、従来のプロセスに比べて製造歩留まりが高く、処理コストが低いため、化粧品、食品、医薬品の製造の商業化プロセスに適用できると考えられています。
著者の貢献：著者の個々の貢献は次のように指定されます：執筆-原案の作成、資金調達、監督、執筆、編集、JWK。 検証、分析、方法論、DHG; 調査、方法論、データキュレーション、編集、JWH; 分析、方法論、レビュー、JHK; すべての著者は、出版された原稿を読み、同意しました。
資金提供：この研究は外部からの資金提供を受けていません。
倫理委員会の声明：該当なし。
インフォームドコンセント声明：該当なし。
データ可用性ステートメント：この調査では、新しいデータは作成または分析されていません。 データ共有はこの記事には適用されません。
利害の対立：著者は利害の対立を宣言しません。
サンプルの入手可能性：化合物のサンプルは著者から入手できません。
