パートⅡ：ホンオニクからの新しいフェニルプロパノイド置換ジグリコシドの複製誘導分離とマクロファージでのNO産生に対するそれらの阻害活性
Mar 04, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
アグリコンの下部構造である3-メチルブテニル基は、H-2とH-1aおよびH-1 bとのCOZY相関、およびH{{ 4}}およびH-5とオレフィン炭素、kC 120.7（C -2）および136.4（C -3）。 酸加水分解物のNMRスペクトル分析とHPLCスペクトル分析により、MSフラグメントパターンを使用して2つの糖部分が確立されました。 それらの絶対配置は、酸加水分解物のHPLC分析を使用してD-グルコースおよびL-ラムノースであると決定された[17]。 これらの糖部分は、アノマープロトンの結合定数によってα-グルコースおよびα-ラムノースとして定義されました。 1H -1 H COZYスペクトルは、H-13からH-63へ、およびH-133からH-633への連続的な相関を示しました（図4）。
kH 4.70（H -43）でのダウンシフトされたグルコースプロトンは、グルコース上のアシル置換基を示唆しました。 HMBCスペクトルから、H-43とC-9333の間の相関関係により、カフェオイル置換基の位置が確認されました。 H-13とC-1（kC 64.5）の間、およびH -33（kH 3.68）とC -133（kC 101.2）の間のHMBC相関は、各置換基の位置を示唆しました。 したがって、6の構造は3-メチルブテニル-O - - L-ラムノピラノシル-（1→3）-4- O-（E）-カフェオイル- -D-として決定されました。グルコース-ピラノシドおよび名前付きシスタンサルシドB。
茶色の無定形粉末であるCistansalsideC（12）は、（plus）-HR-ESI-QTOF-MSによってC26H38O13の分子式を持っていると判断され、m / z 581.2213 [M plus Na] plus（calcd 。C26H38O13Naの場合、581.2205）。 m / z 163の特徴的なイオンは、カフェオイル置換基が構造内に存在することを示唆しました。 m /z325およびm/z 471のフラグメントイオンは、ラムノースユニットとグルコースユニットの存在を示唆していました。
12のNMRスペクトルと6のNMRスペクトルを比較すると、アグリコン構造を除いて類似していることがわかりました。 12のNMRスペクトルでは、kCで2つのパラフィン系炭素の代わりにkC38で2つのパラフィン系炭素が観察されました。 6のアグリコンの}}。7（C -2）および136.4（C -3）。12のアグリコンの生殖メチル基（kH 0。88）は上方にシフトしました。 6のアグリコンのH-4およびH-5（kH 1.71および1.63）と比較して（表2）。 12のアグリコンは3-メチルブチル基であることが示唆され、1HおよびCOZYNMRスペクトルによって確認されました。 3-メチルブチル基のピークは、3.81（1H、m、H -1 a）、3.48（1H、m、H -1 b）、1.71（1H、m）で観察されました。 、H -3）、1.44（2H、m、H -2）、および0.88（H -4、5）。
酸加水分解物のHPLC分析とNMRスペクトル分析、およびMSフラグメントパターンによって、2つの糖部分が再確認されました。 糖の絶対配置は、酸加水分解物のHPLC分析を使用してD-グルコースおよびL-ラムノースとして同定されました[17]。 アノマープロトンの結合定数により、α-グルコース部分とα-ラムノース部分が確認された。 1H -1 H COZYスペクトルは、H-13からH-53、H-133からH-333、およびH{{11}への連続的な相関を示しました。 }からH-433（図4）。
置換基の位置は、HMBC分析によって確認されました。 HMBCスペクトルでは、H-13とC-1（kC 67.2）の間、H -33（kH 3.68）とC -133（kC 101.2）の間、およびH -43（kH 4.70）およびC -9333（kC 165.7）が検出されました。 その結果、12の構造は3-メチルブチル-OaL-ラムノピラノシル-（1→3）-4- O-（E）-カフェオイル- -D-グルコース-ピラノシドとcistansalsideCという名前。
アモルファスブラウンパウダーであるCistansalsideD（17）は、ポジティブモードの高分解能ESI-QTOF-MSにより、分子式がC31H38O14であると判断されました。これは、m / z 657.2147 [M plusNa]plusに付加イオンピークを示しました。 （C31H38O14Na、657.2154の計算値）。 [M +HxアグリコンxRhaxアセチルGlc]+m / z 147のイオン、[M +HxアグリコンxRha]+ m / z 351のイオン、[M +Hxアグリコン]を含むフラグメントイオンプラスイオンm/z497も検出されました。 m / z 147の特徴的なイオンは、クマロイル置換基がその構造に存在することを示唆しました。 m /z351およびm/z 497のフラグメントイオンは、ラムノースユニットとアセチル置換グルコースユニットの存在を示唆していました。
Cistansalsideからcistancheハーブ
13C-NMRスペクトルは、31個の炭素原子の存在を明らかにしました。 kH 4.61（1H、m、H -13）および4.6 0（1H、s、H {{1 0}}）の2つのアノマープロトンが1HおよびHSQCスペクトルで観察されました。 1H-NMRスペクトルは、1.97（3H、s、アセチル-CH3）にメチル基、kH 7.55（1H、d、J= 15。9Hz、H {{ 25}}）および6.34（1H、d、J= 15。9Hz、H -8333）およびkH 7.53（2H、d、J= 6の2つのパラ置換ベンゼン環。 9 Hz、H -3333、5333）および6.79（2H、d、J= 6。9Hz、H -2333、6333）/ kH 6.98（2H、d、J {{5 0}}。0Hz、H -2、6）および6.65（2H、d、J= 8。0Hz、H -3、5）（表2） 。 HMBC NMRスペクトルから、kc 165.5（C -9333）のカルボニル炭素とH -8333の間、およびH -2333、6333、C -7333（kc 145.4）は（E）-クマロイル基を提案しました。 kc 169.0でのメチルプロトンピークとカルボニル炭素の間のHMBC相関により、アセチル基の存在が確認されました。
4-ヒドロキシフェニル基は、KC 155.6（C -4）および128.6（C -1）でのH -3、5、および第4芳香族炭素間のHMBC相関に基づいて提案されました。 。 ヒドロキシル化エチル基は、kH 2.66（2H、t、J= 6。1Hz、H -7）、3.90（1H、m、H -8 a）のCOZYNMR信号によって確認されました。 ）および3.54（1H、m、H -8 b）。 H-7とC-1（kC 128.6）およびC -2、6（kC 129.7）の間のHMBC相関は、アグリコン下部構造として4-ヒドロキシフェニルエチル基を示唆しました。
MSフラグメントパターンから示唆される2つの糖部分は、酸加水分解物のHPLC分析とNMRスペクトルによって再確認されました。 D-グルコースとL-ラムノースは、酸加水分解物のHPLC分析を使用して解明されました[17]。 アノマープロトンの結合定数により、α-グルコース部分とα-ラムノース部分が確立された。 1H -1 H COZYスペクトルは、H-13からH-53へ、およびH-133からH-633への連続的な相関を示しました（図4）。
1H-NMRスペクトルから、H -23（kH 4.69）およびH -43（kH 4.8 0）のダウンフィールドシフトは、グルコース上のアシル置換位置を示唆しました。 グルコースと2つのアシル基の間の接続は、H -43（kH 4.80）とC -9333の間、およびH-23とアセチル基のカルボニル炭素（kC 169.0）の間のHMBC相関によって確認されました。 ）。 アグリコンとラムノースの位置は、H -33（kH 3.95）とC -1333の間、およびH-8とC-13の間のHMBC相関によって与えられました。 したがって、17の構造は4-ヒドロキシフェニルエチル-2-O-アセチル-O- - L-ラムノピラノシル-（1→3）-4- O-（E）-として割り当てられました。クマロイル- -D-グルコピラノシドおよび名前付きシスタンサルシドD。
Cistansalside E（18）は無定形の茶色の粉末として分離されました。 その分子式は、13C-NMRデータおよびm / z 657.2166 [M plus Na] plus（C31H38O14Naの計算値、657.2154）でのポジティブモード高分解能ESI-QTOF-MSピークによってC31H38O14であると決定されました。 さらに、m / z 163のカフェオイルイオン、m /z367の[MplusHxアグリコンxRha]+イオン、およびm /z513の[MplusHxアグリコン]イオンを含むフラグメントイオンも検出されました。フラグメントイオンは、ラムノースユニットとアセチル置換グルコースユニットの存在を示唆しました。
1H-NMRスペクトルは、kH 4.63（1H、d、J= 8。2Hz、H -13）および4.60（1H、s、H -133）に2つのアノマープロトンが存在することを示唆しました。 ）およびkH 4.71（1H、dd、J=8。9、8.2 Hz、H -23）および4.81（1H、dd、J= 9。7の2つのアシル置換グルコースプロトン、9.5 Hz、H -43）。 1HおよびHMBCスペクトルは、kH 1.94（3H、s、アセチル-CH3）にアセチル基、kH 7.48（1H、d、J= 15。9Hz、 H -7333）、7.02（1H、d、J= 1。6Hz、H -2333）、6.98（1H、dd、J=8。1、1.6 Hz、 H -6333）、6.76（1H、d、J= 8。1Hz、H -5333）および6.21（1H、d、J= 15。9Hz、H { {67}}）およびkH 7.29（2H、m、H -3、5）、7.21（2H、m、H -2、6）および7.20（1H、 m、H -4）（表2）。 アグリコンの下部構造であるフェニルメチル基は、H -7（2H、kH 2.80、m）とC -1（kC 138.8）の間、およびH-7とCの間のHMBC相関によって示唆されました。 -2、6（kC 128.9）およびH -8 a（1H、kH 3.99、m）およびH -8 b（1H、 kH 3.63、m）。
酸加水分解物のHPLC分析およびNMRスペクトル分析により、2つの糖部分が再確認された。 糖の絶対配置は、D-グルコースとL-ラムノースであることが確認された酸加水分解物のHPLC分析を使用して解明されました[17]。 -グルコース部分と-ラムノース部分は、アノマープロトンの結合定数によって確立されました。 1H -1 H COZYスペクトルは、H-13からH-53、H-133からH-233、およびH{{11}への連続的な相関を示しました。 }からH-333（図4）。
HMBCスペクトルから、H{{0}}とC-8（kC 69.4）の間、H -23とアセチル基のカルボニル炭素（kC 169.1）の間の相関H -33（kH 3.95）とC -133（kC 102.0）、およびH -43（kH 4.81）とC -9333（kC 165.6）の間で、置換基の位置が確認されました。構造。 したがって、18の構造はフェニルエチル-2- O-アセチル-OaL-ラムノピラノシル-（1→3）-4- O-（E）-カフェオイル- -D-グルコピラノシドであると決定されました。 cistansalsideEという名前。
トランスシンナモイル置換基のほとんどは、invitroでシスアイソフォームに異性化されました。 光はトランス桂皮酸誘導体をシスアイソフォームに変換することが報告されています[18,19]。 シンナモイル置換基のトランス-シス変換の平衡は、トランス-アイソフォームの分離株の約70パーセントを維持することが観察されました。 シス型のオレフィンプロトンの場合、ピークは約6.90 ppm（d、J=12〜13 Hz、H -7333）および5.80 ppm（d、J=12〜13 Hz、 H -8333）は1H-NMRスペクトルで割り当て可能でしたが、ピークは約7.55 ppm（d、J= 15。8Hz、H -7333）および6.40 ppm（d、J { {28}}。8Hz、H -8333）が変換[20]で観察されました。 トランス-シス混合物の1H-NMRスペクトルでは、2つのオレフィンプロトン（H-7333とH-8333）のピークが7：3（トランス：シス）の比率で観察されました。 シス型の13C-NMRピークは、トランスフォームのピークと類似していた。
cistancheからの有効成分：acteosides
すべての分離株は、RAWでのLPS誘発性NO産生に対する阻害効果についてテストされました。
すべての分離株は、RAW264.7細胞におけるLPS誘導性NO産生に対する阻害効果についてテストされました。 デキサメタゾンを陽性対照として使用し、そのIC50は7。0uMでした。 テストした化合物のうち、化合物5（IC50 42。7o 6.6 uM）、11（IC50 37。3o 2.2 uM）、13（IC50 40。{{2{{ 24}}}} o4。0uM）および18（IC50 27。9o 0.8 uM）は、誘導性NOシンターゼに対して中程度の阻害活性を示しましたが、他の化合物はこのアッセイでは不活性でした（IC50値>100uM）。 これらの化合物が細胞毒性を有するかどうかを検証するために、MTTアッセイを使用して細胞生存率を測定しました。 その結果、それらのいずれも有意な細胞毒性を示さなかった（補足図S 6-1）。 これらの4つの化合物は、LPSで刺激されたRAW264.7細胞におけるNF-λB経路に対する阻害活性を評価するために選択されました。 LPSによるRAW264.7細胞の刺激は、0.5時間のインキュベーション後にI入BおよびNF-入B（p65）のリン酸化を誘導しました。 ウエスタンブロット分析で示されるように、NF-入B（p65）のリン酸化は、化合物11、13、および18での前処理によって大幅に減少しました（図5）。 したがって、化合物11、13、および18は、マクロファージのNF-入Bの阻害を介して抗炎症効果を発揮する可能性があります。
図5。LPSで刺激されたRAW264.7細胞におけるI入BおよびNF-入B（p65）のリン酸化に対する4つの化合物の影響。 （A）ウエスタンブロットはLPSおよびサンプル処理されたRAW264.7細胞で実施されました。 （B、C）イムノブロットシグナルは、Molecular Analyst / PCデンシトメトリーソフトウェア（Bio-Rad、Richmond、CA、USA）を使用して定量化されました。 リン酸化アイソフォームのデンシトメトリー分析が報告されています。 RAW 264.7セルのNF-入Bは、-アクチンの含有量に対して正規化されました。
3. 材料と メソッド
3.1. 一般的な実験 手順
旋光度は、Jasco P -2000デジタル旋光計（Jasco、東京、日本）を使用して測定しました。 UVスペクトルは、Chirascan plus Circular Dichroism分光計（Chirascan、APL、UK）で記録されました。 Jasco FT /IR-4200分光光度計を使用してIRスペクトルを記録しました。 高分解能エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析（HR-ESI-qTOF-MS）は、Agilent 1260Infinityシリーズ（Agilent Technologies、Inc. 、Palo Alto、CA、USA）、使用したカラムはJasco SFCpak Crest C18T -5カラム（id150 4。6mm、5 um）でした。 MassHunterワークステーションソフトウェアをデータ取得に使用しました。
1D（1Hおよび13C）および2D（1H -1 H COSY、HSQC、HMBC、NOESY）NMRスペクトルは、Jeol LA 300（Jeol、東京、日本）、Bruker AVANCE -400、Brukerを使用して取得しました。 AVANCE -500、Bruker AVANCE -600、およびBruker AVANCE 800 HD分光計とクライオプローブ（Bruker、Ettlingen、ドイツ）を組み合わせたもの。 DMSO-d6（Cambridge Isotope Laboratories、In Cistanche Andover、MA、USA）をNMR溶媒および参照ピーク（kH2.50およびkC39.5）として使用しました。 カラムクロマトグラフィー（CC）は、Sephadex LH -20（25–100 um; Pharmacia、Uppsala、Sweden）またはKieselgel 60シリカゲル（40–63 um、230–400 mesh、Art。9385; Merck、Darmstadt）を使用して実施しました。 、ドイツ）。 薄層クロマトグラフィー（TLC）は、プレコートされたKieselgel 60シリカゲルF254プレート（Art。5715; Merck）で実施しました。 TLC上のスポットは、254nmおよび365nmのUVランプを使用して検出されました（VL -4。LC、365/254; Vilber Lourmat、Torcy、France）。 中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）は、RediSep 120 gシリカゲルフラッシュカラム（Isco、リンカーン、ネブラスカ、米国）およびKiesegel 60シリカゲル（40〜63 um、230〜400メッシュ、Art。9385; Merck）で、コンビフラッシュコンパニオン（Isco）。 高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）システムは、Gilson321ポンプとUV.VIS151検出器（Gilson、Middleton、WI、USA）を備えたGilson HPLCで、セミ分取ODSカラム（Luna 5 um C18（2））を使用しました。 100Å、id 250：10 mm、5 um、Phenomenex Inc.、Torrance、CA、USA; HypersilGOLD™aQ175Å、id 250：10 mm、5 um、Thermo Scientific™、Hennigsdorf、Germany;InnoC18カラム120 Å、id 250：10 mm、5 um、Young Jin Biochrom Co.、Ltd.、Seongnam、Korea）。 分析用RP-HPLCシステムは、a996フォトダイオードアレイ（PDA）検出器を備えたWaters 2695アライアンスシステム（Waters Corp、米国マサチューセッツ州ミルフォード）であり、使用したカラムはHypersil™BDS C18カラム（130Å、id 150：4.6）でした。 mm、5 um、ThermoScientific™）。 ギ酸はDaejungChemicals＆Metals Co.、Ltd.（Seoul、Korea）から購入しました。 HPLCグレードの溶媒は、Fisher Scientific Korea Ltd.（ソウル、韓国）から購入しました。 H2SO4、Na2CO3、および抽出、分画、分離用の1級溶媒は、Daejung Chemical＆Metals Co. Ltd.（ソウル、韓国）から購入しました。 L-およびD-システインメチルエステル塩酸塩およびo-トリリソチオシアネートは東京化成工業（東京、日本）から購入しました。
3.2. 工場 素材
の植物全体ホンオニクサルサ新疆ウイグル人から集められたは、Daerim Pharmaceutical Wholesale Company（清州、韓国）を通じて輸入されました。 それらは、イ・ジェヒョン博士（東国大学、ソウル、韓国）によって特定されました。 バウチャー標本（SNUPH 2016-03）は、ソウル国立大学薬学部の薬用植物園の植物標本室に寄託されました。
3.3. 抽出と 隔離
の乾燥した全植物ホンオニクサルサ（5.7 kg）を切り刻み、室温で99分間超音波処理しながらMeOH（2 0 L）で3回抽出しました。 真空中で溶媒を除去した後、粗抽出物（１．３５ｋｇ）をＨ ２ Ｏ（５Ｌ）に懸濁し、次にＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で分配した。 ＥｔＯＡｃ残留物（５５．３ｇ）を、ＣＨＣｌ ３ ／ ＭｅＯＨ（５０：１〜０：１、段階勾配系）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィー上で１６の画分（Ｅ Ｘ ＿１２ ／ ＞）に分離した。
E 0 8（611.7 mg）をシリカゲル中圧液体クロマトグラフィー（25 g）にかけ、CHCl3 / MeOH（18：1 – 0：1、ステップグラジエントシステム）で溶出し、 11個のフラクションを与えた（E 0 8a-k）。 E08gから、化合物13（0.7 mg）および18（0.6 mg）を、Luna 5 um HPLCカラムと28％水溶液のアイソクラティック溶出を使用して精製しました。 MeCN。 E08h（138.5 mg）のHPLC精製（Hypersil GOLD、25％水溶液MeCN）により、化合物7（10.6 mg）、8（17.2 mg）、14（13.4 mg）、および17（4.9 mg）が得られました。
E 0 9（1.15 g）を、CHCl3 / MeOH（1 0：1–0：1、ステップ-）で溶出するシリカ-MPLCカラム（2 0 g）でさらに精製しました。勾配システム）11個のサブフラクション（E09a-k）を与える。 E09e（398.7 mg）をSephadex LH -20（MeOH）にかけ、8つのサブフラクション（E09e 1-8）を生成しました。 続いて、Hypersil GOLD HPLCカラム（22パーセント水溶液MeCN）を使用してE09e6を精製し、化合物11（0.4 mg）を得た。 E09e7から、化合物5（0.6 mg）は、40％水溶液のLuna 5umHPLCカラムからのアイソクラティック溶出によって精製されました。 MeOH。
E1 0（1.2 0 g）を、MeOHで溶出するSephadex LH -20カラムで9つのフラクション（E1 0 ai）に分離しました。 E1 0 g（147.5 mg）から、化合物4（13.4 mg）、9（8.0 mg）、および15（5.0 mg）をHPLC分離（Inno、23パーセント水溶液MeCN）で分離しました。 画分E10h（470.0 mg）をHypersil GOLDカラムでアイソクラティック溶出（40％aq。MeOH）により精製し、化合物1（3.8 mg）、10（42.1 mg）、および16（3.0 mg）を得ました。
E11（2.96 g）をMeOHで溶出するSephadex LH -20に供して、9つの画分（E11a-i）を得た。 E11eは、10パーセント、20パーセント、30パーセント、50パーセント、および100パーセントの水溶液で段階的に溶出するSep-PakC18カートリッジによって分離されました。 MeOHで7つの画分（E11e 1-7）を生成し、続いてLuna 5 um HPLC（28パーセント水溶液MeCN）で化合物3（3.4 mg）、6（1.4 mg）、および12（1.2 mg）を生成します。
E12（19. 0 g）をCHCl3 / MeOHステップグラジエントシステムを使用してシリカMPLC（12 0 g）にかけ、6つのフラクション（18：1 – 0：1）を得ました。 、E12a-f）。 E12fをSephadexLH-20カラム（MeOH）でクロマトグラフィーにかけ、7つの画分（E12f 1-7）を得た。 E12f7のHPLC精製（Hypersil GOLD、25％水溶液MeCN）により、化合物2（3.3 mg）が得られました。 HPLCに使用したすべての溶媒は、0.05パーセントのギ酸緩衝液でした。 HPLCおよびMPLCクロマトグラフィーの一般的な流速は、それぞれ3および40 mL/minでした。
3.4。特性評価
Cistansalside A（5）：茶色の無定形粉末; [| 2 0 x33.7（c 0.1、MeOH）; UV（MeOH）Amax nm（log e）332（3.18）; IR（ニート）vmax 3359、1748、1705、1602、1516 cmx1; 1H-NMR（800 MHz）および13C-NMR（200 MHz）データ。表2を参照してください。 HRMS（ESI-TOF）m / z [M + Na] + 645.2146（C30H38O14Naの計算値、645.2154）。
Cistansalside B（6）：茶色の無定形粉末。 [| 2 0 x72.9（c 0.1、MeOH）; UV（MeOH）Amax nm（log e）333（3.32）; IR（ニート）vmax 3400、1705、1603、1516 cmx1; 1H-NMR（500 MHz）および13C-NMR（125 MHz）のデータ。表2を参照してください。 HRMS（ESI-TOF）m / z [M + Na] + 579.2054（C26H36O13Naの計算値、579.2048）。
Cistansalside C（12）：茶色の無定形粉末; [| 2 0 x61.6（c 0.1、MeOH）; UV（MeOH）Amax nm（log e）337（3.25）; IR（ニート）vmax 3359、1704、1602、1508 cmx1; 1H-NMR（800 MHz）および13C-NMR（200 MHz）データ。表2を参照してください。 HRMS（ESI-TOF）m / z [M + Na] + 581.2213（C26H38O13Naの計算値、581.2205）。
Cistansalside D（17）：茶色の無定形粉末; [| 2 0 x51.1（c 0.1、MeOH）; UV（MeOH）Amax nm（log e）221（3.53）、315（3.52）; IR（ニート）vmax 3358、1746、1722、1603、1516、1232、1157、1039 cmx1; 1H-NMR（400 MHz）および13C-NMR（75 MHz）データ。表2を参照してください。 HRMS（ESI-TOF）m / z [M + Na] + 657.2147（C31H38O14Naの計算値、657.2154）。
Cistansalside E（18）：茶色の無定形粉末; [| 2 0 x59.2（c 0.1、MeOH）; UV（MeOH）Amax nm（log e）336（3.22）; IR（ニート）vmax 3370、1741、1712、1602、1231、1157 cmx1; 1H-NMR（800 MHz）および13C-NMR（200 MHz）データ。表2を参照してください。 HRMS（ESI-TOF）m / z [M + Na] + 657.2166（C31H38O14Naの計算値、657.2154）
3.5.HPLC-QTOF-MS 分析
クロマトグラフィー-質量分析は、Agilent 126 0 InfinityシリーズLCシステム（Agilent Technologies、Inc.、USA）で実行されました。 分析カラムはSFCpakCrestC18T -5カラム（id 15 {{1 0}}：4.6 mm、5 um、日本分光）でした。 移動相は、MeCN（A）および水（B）中の0。1パーセント（v / v）ギ酸で構成され、0〜35分（23パーセントA）、35〜45分（23パーセントA）のグラジエント溶出を使用しました。 23〜28パーセントA）、45〜75分（28パーセントA）、および75〜80分（90パーセントA）。 流速は0.3mL/分に保たれた。 吸光度は320nmで測定されました。 ESIソースの条件は次のとおりです。乾燥ガス（N2）の流量、10 L/min。 乾燥ガス温度、350度; ネブライザー、30 psig; シースガス流量、12.0 L / min; シースガス温度、350度; キャピラリー、4000 V; スキマー、60 V; オクタポールRF、750 V; フラグメンター電圧、180 V; ポジティブモード。 システムは、Masshunterワークステーションソフトウェアの下で操作されました。 質量範囲はm/z 50〜1000に設定されました。
3.6。酸 加水分解
化合物は、90度の水浴で2時間加熱した1NH2SO4（1 0 0 uL）を使用して加水分解し、飽和Na2CO3水溶液で中和しました。 溶液をＮ ２流下で乾燥させた後、生成物および標準糖（Ｄ－Ｇｌｃ、Ｌ－Ｇｌｃ、Ｌ－Ｒｈａ）を、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（０．５ｍｇ）を含むピリジン（１００μＬ）に溶解した。 L-ラムノースサンプルを、D-システインメチルエステル塩酸塩（0.5 mg）を含むピリジン（100 uL）に溶解しました。 その後、60度で1時間加熱した。 溶液を１μＬ（１．１１ｍｇ）のｏ－トリリソチオシアネートで処理し、これを再び６０度で１時間加熱した。 各最終混合物を分析RP-HPLC（Hypersil™BDS C18カラム、17パーセント水溶液MeCN、0.8 mL / min、40分、35度）で直接分析しました。 21.9分と40.4分のピークのtRは、それぞれD-グルコースとL-ラムノースのチオカルバモイルチアゾリジン誘導体のtRと一致しました。
3.7. 細胞 文化
マウスマクロファージ、RAW 264.7は、韓国生物科学およびバイオテクノロジー研究所（大田、韓国）から入手し、10％ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン/硫酸ストレプトマイシンを含むRPMI培地で増殖させました。 細胞を加湿した5％CO2雰囲気中で37度でインキュベートしました。
3.8。薬物および化学薬品
RPMI、ペニシリン、ストレプトマイシンはHyClone（Logan、UT、USA）から購入しました。 ウシ血清アルブミンとLPSは、Sigma（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。
3.9。NO生産の測定
培地中の亜硝酸塩濃度は、Griess反応によるNO産生の指標として測定されました。 細胞を2：105細胞/ウェルで96-ウェル培養プレートに播種しました。 RAW 264.7細胞を18時間プレインキュベーションした後、細胞を化合物（5 0 uM、10 uM、5 uM、または1 uM）で前処理し、LPS（500 ng / mL）で24時間刺激しました。 h。 DMSOに溶解した試験化合物。 細胞はまた、ビヒクル対照として0.05パーセントのDMSOで処理された。 RAW 264.7細胞（2：105細胞/ウェル）をフェノールレッドを含まないRPMIを使用して96-ウェルプレートで培養し、サンプルで0.5時間前処理しました。 細胞のNO産生は、500 ng/mLの最終濃度のLPSの添加と24時間のインキュベーションによって誘導されました。 インキュベーション後、100μLの馴化培地を同量のGriess試薬と混合し、15分間インキュベートしました。 540 nmでの混合物の吸光度を、ELISAマイクロプレートリーダー（Benchmark、Bio-Rad Laboratories、Richmond、CA、USA）で測定しました。 得られた値を、RPMIに溶解した標準濃度の亜硝酸ナトリウムの値と比較し、サンプル処理細胞の馴化培地中の亜硝酸塩の濃度を計算しました。
3.10。3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ
細胞を{{0}}ウェルプレートに5：104細胞/ウェルの密度で播種し、サンプルの存在下で無血清培地とインキュベートしました。 DMSOに溶解した試験化合物。 細胞はまた、ビヒクル対照として0.05パーセントのDMSOで処理された。 24時間のインキュベーション後、10 uLのMTT（生理食塩水中5 mg / mL）を添加し、インキュベーションをさらに4時間続けました。 生細胞のミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼは、インキュベーション中にMTTを目に見えるホルマザン結晶に変換します。 次に、ホルマザン結晶をジメチルスルホキシドに可溶化し、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）マイクロプレートリーダー（Benchmark、Bio-Rad Laboratories）を使用して540nmで吸光度を測定しました。 相対的な細胞生存率は、未処理の対照群の吸光度と比較して計算されました。 すべての実験は3回行った。
3.11。イムノブロット分析
タンパク質発現は、標準的な手順に従ってウエスタンブロッティングによって評価されました。 簡単に説明すると、RAW264.7細胞を6 {{2 0}} mm培養皿（2：1 0 6 / mL）で培養した後、50uMの化合物を前処理しました。 。 細胞を氷冷PBS（pH 7.4）で2回洗浄し、細胞ペレットを氷上の溶解緩衝液に15分間再懸濁し、遠心分離によって細胞片を除去しました。 タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイ試薬を製造元の指示に従って使用して決定しました。タンパク質（20〜30 ug）を2：サンプルバッファー（20％グリセロール、4％SDS、10％2-）と1：1で混合しました。 ME、0.05％ブロモフェノールブルー、および1.25 M Tris [pH 6.8]）、8または15％SDS-PAGEゲルにロードし、150Vで90分間泳動します。 細胞タンパク質は、Bio-Radセミドライトランスファーシステムを製造元の指示に従って使用して、Immunoblotポリフッ化ビニリデンメンブレン（Bio-Rad）にトランスファーされました。 次に、膜を、5％のスキムミルクと0.1％のTweenを含むトリス緩衝生理食塩水中で、それぞれのp-NF-入B、NF-入B、pI入B、および-アクチン一次抗体（Abcam、ケンブリッジ、英国）とともに一晩インキュベートしました。 20.翌日、ブロットをトリス緩衝生理食塩水（0.1パーセントTween 20）で3回洗浄し、HRP標識二次抗IgG抗体（1：2 000 – 1に希釈）とともに1時間インキュベートしました。 ：20,000）。 ブロットをトリス緩衝生理食塩水（0.1パーセントTween 20）で再度3回洗浄し、化学発光基質ECL Plus（Amersham Biosciences、Piscataway、NJ、USA）を使用して免疫反応性バンドを展開しました。
3.12。統計分析
実験データはSEMの平均として示されています。 統計的有意性のレベルは、分散分析（ANOVA）と、それに続く多重比較のためのダネットのt検定によって決定されました。p0.05未満の値は有意であると見なされました。
ホンオニクサルサ抽出物
4. 結論
この研究では、複製解除戦略を使用して、13の既知の化合物を分離および同定することに加えて、シスタンサルシドAE（5、6、12、17、および18）という名前の5つの新しいフェニルプロパノイド置換グリコシドの構造を分離および解明しました。 既知の化合物は、リペドシドAI（1）[21]、23-アセチルアクテオシド（2）[22]、イソシスタノシドC（3）[15]、オスマンツシドB（4）[21]、エピメリジノシドA（ 7）[15]、シスタノシドD（8）[23]、サルサシドB（9）[6]、ツブロシドE（10）[16]、シスタノシドM（11）[15]、イソマルチノシド（13）[24]、サルササイドC（14）[6]、ジオノシドC（15）[25]およびサルササイドF（16）[6]。 それらの構造は、広範な分光データの分析と、文献で報告されているデータとの比較によって確立されました。 フェニルプロパノイド置換配糖体の暫定的に予測された構造が実際の構造と正しく一致していることが確認されました。
ホンオニクサルサ抽出物の利点
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