パート Ⅰ 尿中の NGAL 検出および急性腎障害の診断のためのユウロピウム ナノ粒子側方流動免疫測定法の開発
May 09, 2023
概要
1. 背景
AKIは、2019年コロナウイルス病（COVID-19）患者の重篤な有害転帰と死亡に関連しているため、早期の診断と介入が不可欠です。 好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン (NGAL) は、急性腎障害 (AKI) の検出に最も有望なバイオマーカーの 1 つですが、現在の検出方法は不十分であるため、早期診断のために NGAL を検出するには、より迅速で便利で正確な方法が必要です。アキの。 ここで我々は、ヒト尿検体中の NGAL を検出するためのユーロピウム ナノ粒子 (EU-NPS) に基づく、迅速で信頼性が高く正確なラテラル フロー イムノアッセイ (LFIA) を確立しました。
2. 方法
ユウロピウムをドープしたナノ粒子を使用した二重抗体サンドイッチ免疫蛍光アッセイを使用し、標識として NGAL モノクローナル抗体 (MAb) コンジュゲートを電気融合パラメーターを最適化することによって生成しました。 この方法の臨床応用効率を評価するために、83 個の尿サンプルが使用されました。
3. 結果
AKI における NGAL の定量的検出範囲は {{0}} ng/mL、検出感受性は 0.36 ng/mL でした。 アッセイ内およびアッセイ間の変動係数 (CV) は、それぞれ 2.57-4.98 パーセントと 4.11-7.83 パーセントでした。 一方、ユウロピウムナノ粒子ベースの側方蛍光イムノアッセイ（EU-NPS-LFIA）とARCHITECTアナライザーとの間の相関係数は有意でした（R2=0.9829、n=83、p < 0.01）。
4. 結論
したがって、AKI に対する NGAL のより迅速で簡単な操作の定量的アッセイが確立されました。これは、早期 AKI を診断する上で非常に重要かつ有意義であり、このアッセイが疾患の転帰の早期警告を提供できることを示唆しています。
キーワード
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン (NGAL)、モノクローナル抗体、ラテラルフローイムノアッセイ、急性腎障害 (AKI)、シスタンケの効果.
序章
コロナウイルス感染症 2019 (COVID-19) は、深刻な災害を伴い世界規模で広く蔓延しています[1]。 急性腎障害（AKI）は、重篤な病気の一般的な合併症の罹患率と死亡率が高く、世界の入院患者の約 5-7 パーセントを占めています[2]。- いくつかの研究では、AKI の発症がより深刻であると評価しています。これは、新型コロナウイルス-19の転帰の悪化と死亡率に強く関連しており、新型コロナウイルス-19患者におけるAKIの発生率は0.5〜36.6パーセントと広範囲であると説明されています[3]。 AKI の早期発見と正確な治療により、より良い予防戦略を導入し、腎機能の悪化や腎不全を防ぐことができ、COVID-19 入院患者の進行を効果的に阻止することができます[4]。 中でも、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）は、AKI 検出のための有望なバイオマーカー候補の 1 つとして認識されています。 NGAL は、好中球由来のゼラチナーゼと関連する 25 kDa の糖タンパク質で、通常、胃、結腸、腎臓などのヒト組織では低レベルで存在しますが、腎臓に虚血性または腎毒性損傷があると、その発現が血清および尿中で劇的に増加します。 [5]。
ラテラルフローイムノアッセイ（LFIA）は、その単純さ、現場分析、作業の容易さの理由から、望ましいスクリーニングアッセイとみなされてきました[6]。 蛍光微粒子を備えた LFIA は、さまざまな微生物病原体やいくつかの炎症マーカーの検出にすでに使用されています [7、8]。 LFIA の感度を向上させるために、カーボン ナノ粒子、量子ドット、蛍光色素、磁性ナノラベル、ユーロピウム ナノ粒子 (EU-NPS) などのいくつかの新規ナノ粒子が一般に適用されています [9]。 キャリアとしての EU-NPS は、LFIA で標識された金コロイドナノ粒子との感度コントラストを 100- 倍向上させることができます [10]。 EU-NPS は蛍光寿命が長く、75 ～ 100 nm の範囲の平均粒子サイズでも入手できます。通常 200 nm を超える大きなストークス シフトにより、励起光の測定によって引き起こされる散乱光の干渉を回避できます。 EU-NPS は励起帯域が広いため、最近医療診断のサンドイッチ型免疫測定法で使用されている励起エネルギー、鋭い発光ピーク、低バックグラウンド、高分解能を高めるのに有利です [11]。
ここでは、私たちの研究室で発見された 2 つのモノクローナル抗体 (MAb) 1G1 および 2F4 に基づいて、尿中の NGAL を迅速、高感度、早期に測定するための LFIA の標識として EU-NPS を使用する新しい方法を確立しました。 この方法は、標識として EU-NPS および MAbs コンジュゲートを使用する二重抗体サンドイッチ免疫蛍光アッセイです。 mAb 1G1 は EU-NPS と結合し、mAb 2F4 を使用して T ラインの EU-NPS-1G1- 抗原複合体を捕捉しました。 私たちの結果は、EU-NPS-LFIA が尿中の NGAL の早期検出に使用でき、AKI 患者の治療を改善できることを示しました。
カンクイ
メソッド
1. NGALの発現と精製
Genbank からのヒト NGAL 遺伝子配列 (NP{0}.2) は北京ゲノミクス研究所 (BGI) によって合成され、両端に制限酵素 HindIII と XhoI が追加されました。 プラスミドを HindIII および XhoI で消化し、pSecTag2A ベクターにクローン化しました。 構築されたプラスミドは配列決定され、突然変異がないことを確認した後、リポフェクタミンTM2000によってチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に形質転換されました。 8日後、0.45μmフィルターで濾過した後、細胞上清を収集した。 発現したNGAL-6×Hisタンパク質をニッケルニトリロ三酢酸(Ni-NTA)カラムで精製し、異なる画分を集めてドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で評価した。 ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質定量キットは、タンパク質の濃度を測定しました。
精製された組換えタンパク質を 12 パーセント SDS-PAGE に供し、次にポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に吸着させました。 メンブレンを、5パーセントのスキムミルクを含む1パーセントのTween-20（TBST）溶液を含むトリス緩衝液中で室温（RT）で2時間ブロックした後、HRP結合抗-6×Hisタグとともにインキュベートしました。抗体（1:5000）を暗所、室温で1時間静置し、TBSTで洗浄した後ベンジジンで可視化し、Bio-Radウェスタンブロッティング検出システム（DNR Bio-Imaging Systems Ltd.、イスラエル）で可視化した。
2. MAb の生成と精製
最初の免疫では、メスのBALB/cマウス（6週齢、合計1匹の0）を、等量の完全フロイントアジュバントで乳化した50μgのNGAL-6×His組換えタンパク質で免疫した。および追加免疫化は、不完全フロイントアジュバント中で乳化されたタンパク質を用いて達成された。 マウスの背中に2回皮下注射し、その後21日間隔で腹腔内注射を行った。 3 回目の注射から 1 週間後に血清サンプルが収集され、抗血清の力価が間接酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) で測定されました [12]。 融合の3日前に、0.9パーセントNaClで希釈した50μgのNGAL-6×Hisでマウスに追加免疫を行った。
単離された免疫マウス脾臓細胞と SP2/0 骨髄腫細胞を 3:1 の比率で混合し、記載のように白金電極 LF498-3 融合チャンバー (BEX Co., Ltd.、日本) 内で融合させました。文献[13]。 簡単に説明すると、混合細胞を10 mL電気融合緩衝液（0.3Mマンニトール、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2、pH）で2回洗浄しました。 7.2)、2 × 107 細胞/mL の濃度で再懸濁しました。 融合は、0.8 MHzで20秒間の50 Vの交流電圧、0.5秒間2回の450 Vの直流パルス電圧を使用して完了し、融合後は0.8 MHzで50 Vでした。 7秒。 最後に、電気処理した細胞懸濁液を融合チャンバーから 4.5 mL の予熱した RPMI 1640 (20% ウシ胎児血清) に 37 度で 30 分間移し、その後 96- ウェル プレートで培養し、5% の RPMI 1640 でインキュベートしました。 37度のCO2。 24時間後、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(HAT)を各ウェルに補充しました。 融合の９日後に細胞培養上清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ハイブリドーマクローンの数を計算した。 あらかじめパラフィンオイルを注射したBALB/cマウスに1×106個のNGALハイブリドーマ細胞を接種し、腹水をプロテインAカラムで精製した。
3. MAb の同定
抗体の免疫グロブリンサブクラスは、抗体サブクラス同定キットを使用して分析されました。 間接ELISAでは、精製組換えNGAL{{0}}×Hisタンパク質およびPCT- 6×Hisタンパク質を使用して、特定のMAbをスクリーニングしました。 抗原と抗体間の相互作用は、BIAcore T200 システム (GE Healthcare、ストックホルム、スウェーデン) を使用して、HBS-EP 緩衝液 (0.005 パーセントの界面活性剤 P20、10 mM Hepes、pH 7.4、3 mM EDTA、150 mM NaCl)。 アミンカップリングキットにより、NGAL 抗原は 400 ～ 480 応答単位 (RU) に達する CM5 バイオセンサーチップに吸着されました。 HBS-EP バッファーで希釈した抗体 (2F4 および 1G1) をそれぞれ 50 µL/min で 5 分間チップ上にゆっくりと通過させ、続いて HBS-EP バッファーをチップ上に注入して解離相を 4 分間モニタリングしました。 。 センサーチップは、解離段階の後、グリシン溶液 (pH 3.0) で再生されました。 チップを通過する各分析物について、抗原フロー チャネルからの特異的応答が、コントロール フロー チャネルからの非特異的応答を差し引く可能性があります。 適合した飽和結合曲線は、平衡結合応答に対する分析物の濃度に基づいてプロットされ、KD を計算しました。
精製した抗 NGAL MAb を、非還元条件および還元条件下の 12 パーセント SDS-PAGE で分析しました。 簡単に説明すると、サンプルを 5 × 非還元バッファーまたは 5 × タンパク質ローディングバッファーと混合し、12 パーセント SDS-PAGE にロードしました。 抗 NGAL MAb の特異性はウェスタンブロットによって決定されました。 NGAL タンパク質を 12% SDS-PAGE で処理し、メタノールに 15 秒間浸して活性化した PVDF 膜に吸着させ、100 V で 2 時間電気泳動条件にさらしました。 5% スキムミルクを含む 1% Tween-20 溶液 (TBST) を含む Tris-HCl 緩衝液中で室温で 2 時間ブロッキングした後、膜を一次抗体としてマウス抗 NGAL MAb とともに 4 ℃でインキュベートしました。 翌日、膜をTBSTで洗浄し、抗マウス結合HRP IgGとともに暗所、室温で1.5時間インキュベートした。 最後に、増強された化学発光 (ECL) のウェスタンブロット検出システムによって膜を視覚化しました。
4. 競合酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)
2 つの MAb を、cELISA によって NGAL 上の固有のエピトープを認識する能力についてテストしました。 HRP抗体標識キット(Shanghai YSRIBIO Industrial co., LTD)を使用してMAbをHRPと結合させ、その使用濃度を直接ELISAによって試験した。 {{0}ウェル マイクロタイター プレートを 2 μg/mL の NGAL 抗原で 4 度で一晩コーティングし、次に非標識 MAb (0.2 μg/ウェル、2 μg/ウェル) を最適な希釈率で競合的に結合させました。 HRP 標識 MAb を 37 度で 1 時間インキュベートしました。 酵素反応は、基質 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン (TMB) による過酸化水素により現れ、すべてのウェルへの 2 M 硫酸により停止しました。 吸光度（OD450 nm）は、Bio-Radマイクロプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories, Inc）によって測定した。 MAb の遮断効果は、次の式を使用して計算されました: 100×[1-OD450nm(HRP-MAb プラス MAb)/HRP-MAb の OD450 nm]。 ブロック効果が 40% 以上で観察された場合、2 つの MAb は異なるエピトープを認識しました。
カンカンキエキス
5. EU-NPSの活用
抗 NGAL モノクローナル抗体 1G1 および 2F4 を、Bangs Laboratories の標準手順で EU-NPS に共有結合させました。 簡単に説明すると、100 µL EUNPS を 900 µL 0.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) を超音波で分散させ、{{40}}.08 M N-ヒドロキシスルホスクシンイミド (NHS) および 0.05 M 1-({{19 }}ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC)。 活性化されたEUNPSをカップリング緩衝液(0.05 mM H3BO3、0.04 mM Na2B4O7、pH 7.5)で洗浄し、0.3 mgの抗体と室温で2.5時間反応させた。 ユウロピウム結合化合物を1000 μLのブロッキングバッファー（10パーセントBSA、20パーセントtween-20、0.05 M Tris-HCl）中で1時間インキュベートし、1000 μLのストック溶液（10パーセントBSA、20パーセントトレハロース、20%トリス塩酸）に加えました。パーセント トゥイーン-20、0.05 M Tris-HCl ) を 4 度で保存します。
6. LFIAの開発
LFIA ストリップは、ニトロセルロース膜、コンジュゲート パッド、サンプル パッド、および吸収パッドで構成されていました。 ガラス繊維膜をブロッキングバッファー (20 パーセント トレハロース、10 パーセント BSA、20 パーセント tween-20、0.05 M トリス、3.2 mM EDTA.Na2、pH 8.6) に 1.5 時間浸漬しました。 濃度 1 mg/mL の MAb (2F4 または 1G1) をニトロセルロース膜のテストライン (TL) 上にコーティングし、ヤギ抗マウス IgG 1 mg/mL を同じ NC 膜上に 4 mm の距離でコーティングしました。品質管理ライン (CL) からのディスペンサー装置の噴霧量は 1 μL/cm に設定されました。 膜とガラス繊維マットは、試験前に 45 度で 48 時間乾燥させました。 異なる EU-NPS-1 G1 および EU-NPS-2 F4 コンジュゲート粒子をコンジュゲート パッド上にコーティングし、蛍光シグナルを免疫蛍光分析装置 (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd) で測定しました。
7. 尿サンプルの採取と患者
吉林医科大学付属病院から、AKI 患者から合計 83 個のヒト尿サンプルが採取されました。 実験では倫理ガイドラインが厳密に遵守され、吉林医科大学付属病院 (No.2018-LW029) によって提供されました。 すべての被験者は、尿サンプルの研究について中国語で口頭および書面によるインフォームドコンセントを受けました。 すべての実験はヘルシンキ倫理原則宣言に従って実施されました。 新型コロナウイルスに感染していない62歳の患者の平均年齢は20～80歳の範囲であり-19、AKIステージ1～3は腎臓病の世界的転帰を改善するAKI基準に従って分類された[14]。 AKI と診断される 12 時間前まで、および手術後はさまざまな時点 (12、24、48 時間) で頻繁に尿サンプルを NGAL 分析のために収集しました。 潜在的な交絡因子を最小限に抑えるために、尿サンプルは尿生化学を含む臨床化学検査室で迅速に分析されました（総タンパク質濃度 < 1 g/dL、尿素 < 12 g/dL、グルコース < 1 g/dL、尿クレアチニン < 1 g/dL） 、アルブミン < 2.5 g/dL、pH 4.5-9.0) であり、2 回実施されました。 サンプル収集から 30 分以内に、サンプルを 3000 rpm、4 度で 15 分間遠心分離しました。 凍結融解サイクルの繰り返しを避けるため、最低 100 μL の上清を滅菌容器に分注し、さらなる分析のために -80 度で保管しました。
NGALレベルの測定は、ARCHITECT尿NGAL試薬キット(Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Ireland)を使用し、化学発光シグナル検出を備えた非競合サンドイッチ形式を利用して実施した。 尿中 NGAL は、微粒子試薬中の常磁性粒子に共有結合した抗真菌抗体、およびアクリジニウムと結合した二次抗 NGAL 抗体の複合体によって認識されました。 製造業者の指示に従って、0- 1500 ng/mL の範囲でキャリブレーション アッセイを実行し、NGAL の濃度を測定しました。
8. 臨床サンプルの検査と分析
バイオコンジュゲートの特異的反応を強化するために、FBS を使用して一連の濃度の NGAL 標準抗原 (10、50、100、200、400、800、1500、2000、および 3000 ng/mL) を調製し、各濃度で 3 回反復しました。 臨床サンプルをサンプルパッドに加えた後、T ライン (HT) と C ライン (HC) の蛍光強度の結果がリーダーによって記録されました。 定量的検出は、HT/HC 比によって完了し、ストリップ (T と C) の違いと数学サンプルの標準マトリックス効果を効果的に排除しました[15]。 NGAL の各濃度および HT/HC 比に対して標準曲線をプロットしました。
9. 統計分析
Passing-Bablok 回帰分析と BlandAltman プロットは、MedCalc および SPSS 17.0 ソフトウェアの分散分析 (ANOVA) によって実行されました。 すべてのデータは、平均値と標準偏差 (平均 ± SD ) として示されました。
カンクサの丸薬
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Moli ying1 、Yuanwang Nie2 、Hao Liu2 、Lei Liu1 、Lu Tang1 、Yuan Dong2 、Chuanmin Hu1 および Huiyan Wang1
1 吉林省抗体工学共同イノベーションセンター、吉林医科大学、132013 Jilin, PR China。
2 吉林医科大学臨床研究院、中国吉林省 132013。
