エキナコシドはどのようにパーキンソン病を予防するのですか?
Mar 06, 2022
第1部:エキナコシドによるMTORシグナル伝達経路を介したMPTP誘導PDマウスにおけるオートファジー調節のメカニズム
要約：
目的:本研究は,以下の効果の検討を目的とする。エキナコシド(ECH)mTORシグナル伝達経路を介したオートファジー関連指標、特にオートファジー基質P62およびα-シヌクレインのクリアランスに対する効果、の病理学的産物のコアパーキンソン病(PD)は、PD(パーキンソン病).方法:亜急性PDのマウスモデル(パーキンソン病)1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)の腹腔内注射により樹立した。まず、各群のマウスの神経行動症状を評価し、各群の線条体中のモノアミン神経伝達物質を高性能液相で測定した。免疫蛍光二重染色を採用し、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、α-シヌクレイン、およびLC3の発現を観察した。透過型電子顕微鏡を用いて、黒質の超構造の変化とオートファゴソームの形成を観察した。次いで、TH、α−シヌクレイン、ベクリン1、LC3、P62、mTOR、および上流タンパク質AKTの発現をウェスタンブロットにより検出した。結果:モデル群と比較すると,神経行動機能は,エッカー (エキナコシド)グループ (P< 0.01),="" together="" with="" increased="" expression="" of="" th,="" da,="" and="" dopac="" in="" the="" brain="" (p="">< 0.01).="" in="" the="">エッカー (エキナコシド)群は、ベクリン1およびLC3−IIの発現が増加した間(P< 0.01),="" the="" expression="" levels="" of="" p62="" and="" α-synuclein="" decreased="" significantly="" (p="">< 0.01).="">エッカー (エキナコシド)生存シグナルp-AKT/AKTの発現レベルをアップレギュレートし、mTORの発現を減少させる可能性がある。結論：エッカー (エキナコシド)mTORの発現を阻害することによりオートファジーを増加させ、それによってα-シヌクレインのクリアランスおよびオートファジー基質P62の分解を促進し、神経保護効果を発揮することができる。
キーワード: パーキンソン病, MPTP,エキナコシド、α-シヌクレイン、P62、オートファジー、mTORの
紹介
パーキンソン病(PD)慢性および進行性の神経変性疾患である。PDの典型的な病理学的特徴(パーキンソン病)はレビー小体の形成であり、α-シヌクレインとユビキチンはレビー小体の主成分である。オートファジー - リソソーム経路は、ユビキチン - プロテアソーム経路によって分解できないタンパク質を分解するだけでなく、経路がα-シヌクレインを分解する可能性がある。したがって、オートファジーの調節は、PDの治療のための新しい戦略を提供するかもしれない (パーキンソン病).オートファジーは細胞内凝集体の分解の主な経路であり、mTORキナーゼはオートファジーの重要な調節部位である。したがって、PDとの関係を解明することは理論的・実践的に意義深い。(パーキンソン病) オートファジーはmTORシグナル伝達経路によって調節される。α-シヌクレインの分解は、主にオートファジー-リソソーム系に依存し、異常タンパク質の排除を標的とするため、オートファジーを調節できる神経保護薬の開発は、神経変性疾患の治療の方向性を与える可能性がある。 エッカー (エキナコシド)は、C35H46O20の分子式を有する。それは漢方薬シスタンチェフェニルエタノイド配糖体の主成分です。それは最初にStollらによって根源から単離された。エキナセアアンガスティフォリアDC。エッカー (エキナコシド)幅広い薬理作用を有する。抗炎症、抗酸化、神経保護、学習と記憶の改善、肝保護、免疫調節、抗腫瘍効果があります。本研究は、PDの病理学的メカニズムの中核から出発する(パーキンソン病)の神経保護効果の調節を調査することを目的としたエッカー (エキナコシド)マウスPDで(パーキンソン病)オートファジー-リソソーム経路からMPTPにより誘導されるモデル。
材料と装置
実験動物
実験群は、SPFグレードの雄C57BL/6Jマウス108匹、生後8週間、体重20~22g、ケージあたり4匹のマウスを22~25°Cに保持した。 マウスは南京中国医学大学に収容された中国科学院上海実験動物センターによって提供され、動物は温度22〜25°C、相対湿度55%のSPFグレードルームで、12時間の概日リズムの下で、国立衛生研究所のガイドラインに従って人道的なケアを受けた。マウスは食物と水を自由に摂取した。
主な試薬
MPTP(シグマ社)、マウス抗-THモノクローナル抗体(シグマ社)、Alexa Fluor 555抗ウサギ抗体(ビユンティアンバイオテクノロジー研究所)、Alexa Fluor 488抗ウサギ抗体(ビユンティアンバイオテクノロジー研究所)、HRP-ヤギ抗ウサギ二次抗体(ビユンティアンバイオテクノロジー研究所)、ウサギポリクローナルα-シヌクレイン抗体(細胞シグナル伝達技術カンパニー)、HRPヤギ抗マウス二次抗体(ビユンティアンバイオテクノロジー研究所)、ティッカー(エキナコシド) (成都Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd., Ltd.), ウサギ抗p-AKT(Ser473)抗体(Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), ウサギポリクローナルLC3抗体 (Abcam Company), ウサギポリクローナルP62抗体 (Enzo Life Science Company), マウスモノクローナルβアクチン抗体 (Santa Cruz Company), Beclin 1ポリクローナル抗体 (Abcam Company).
資料の情報:
MPTP(アメリカ、シグマ社)、マウス抗THモノクローナル抗体(アメリカ、シグマ社)、ウサギポリクローナルαシヌクレイン抗体(アメリカ、細胞シグナル伝達技術社)、HRP-ヤギ抗マウス二次抗体(中国、ビユンティアンバイオテクノロジー研究所)、ティッカー(エキナコシド) (中国、成都Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.)、ウサギ抗p-AKT(Ser473)抗体(アメリカ、Cell Signaling Technology Company)、Rapamycin(America、Cell Signaling Technology Company)、クロロキン(America、Sigma Company)、Wortmannin(America、Sigma Company)、ウサギポリクローナルLC3抗体(America、Abcam Company)、ウサギポリクローナルP62抗体(America、Enzo Life Science Company)、マウスモノクローナルβ-アクチン抗体(アメリカ、Santa Cruz Company)、Beclin 1ポリクローナル抗体(America、 アブカム社)。
エキナコシドトリートパーキンソン病
実験方法
実験動物のグループ化
108匹のC57BL/6Jマウスを無作為に6群に分け、各群に18匹のマウスを投与した。詳細は以下の通りであった:前記正常対照群(前記正常生理食塩水群、N群)、前記モデル群(MPTP群、M群)、ティッカー(エキナコシド) グループ (MPTP +エッカー (エキナコシド)、EH群)、誘導オートファジー群(MPTP+ラパマイシン群、RA群)、オートファジー阻害剤A群(MPTP+エッカー (エキナコシド)+クロロキン基、CQ基)、オートファジー阻害剤B群(MPTP+エッカー (エキナコシド)+ワートマニン基、WO基)。MPTPの用量は30mg / kg / dであり、7日間連続注射された。エッカー (エキナコシド) 30mg/kg/dで投与され、胃内投与された。
実験動物と薬物療法のモデリング
N群およびEH群には、通常の生理食塩水およびティッカー(エキナコシド) それぞれモデリングの3日前~モデリングの7日後。ラパマイシン、10〜ワートマニン、11、およびクロロキンを、MPTPの最後の注射後7日間連続して投与した。ラパマイシンの尾静脈注射の用量は、2mg / kg / dとして計算された。マウスにおけるクロロキンの腹腔内注射の用量は50mg / kg / dであった。マウスにおけるワートマニンの尾静脈注射の用量は0.7mg/kg/dであった(補足図1)。
神経行動観察
文献によると、12軽微な修正を加えて、極試験のための自作装置は以下の通りであった:装置は、マウスの付着点として装置の上部に直径2cmの球状の突起を有する長さ55cm、直径1cmのPVチューブであった。マウスが落下するのを防ぐために、装置を黒いテープで覆った。各マウスは、試験中に頭を上向きにして球状の突出点上に配置した。配置されたバーの上部から頭部までがターンダウンする時間(Tターン)と、配置されたバーの上部からチューブの底部まで上昇して着陸するまでの合計時間(T-total)を記録した。
自発的な活動
自発的な活動は、オープンフィールド活動とも呼ばれ、MPTP損傷後のまれな活動を検出するための一般的な指標です13本研究では、オープンフィールド実験ビデオ分析システムを採用しました。実験前に、同じ群のマウス4匹を観察箱に入れた(長さ25cm、幅25cm、高さは
25cm)を30分間適応させる。その後、30分間連続してビデオ録画した。30分の観測時間枠において、上下動の回数(飼育回数)を5分間の3つの不連続な間隔で別々にカウントした。映像解析システムは、マウスの活動軌跡を自動解析し、水平移動の指標として30分間の総距離(Total Distance)を求めた。
歩行分析
歩行分析:文献によると、14自作の歩行分析装置が使用された。この装置は次の通りであった:木製の歩道(長さ42cm、幅
4.5cm、高さ12cm)、一方の端は開いており、他方の端はリスのケージにつながっていた。リスの檻は黒い布で覆われていました。青いインクをマウスの足の底に浸した。次に、マウスを歩道の開いた端に置いた。ネズミは黒い布で覆われたリスのケージの端まで自然に移動しました。3つの最も長い前肢と後肢の歩幅をそれぞれ測定し、平均値を取った。
ロタロッドテスト
マウスを可変速のロタロッドの上に置き、ロタロッドの速度を5分以内に4発/分から40発/分に上げるように調整した。ロタロッド回転の開始から各回ロタロッドからのマウスの落下までの時間を、落下までの潜伏時間として記録した。高速液体クロマトグラフィー電気化学検出(HPLC-ECD)による線条体中のモノアミン神経伝達物質の含有量の測定
サンプリングと処理
マウスを安楽死させ、線条体を氷上で素早く分離し、体重を測定した。脳の0.1g(湿重量)に対する5%過塩素酸1mLの比率に従って、各群の標本を対応する体積の過塩素酸を含むガラスに入れ、スラリーチューブ中で均質化した。ホモジネートを13,000 r/minの低温で20分間遠心分離した。上清を採取し、遠心分離を繰り返した。上清をさらに検出するために低温冷蔵庫に入れた。HPLC-ECDの条件は以下の通りとした クーロエヘムル5300電気化学クロマトグラフィー検出手段は5020および504ポンドの細胞であり、MD-150のクロマトグラフィーカラム(3.0 * 150 mm; 3 um)、MDTM-2の移動相、および2uAの感度を有する。流速は0.6 mL/min、電極の電位は220mV、カラム温度は30°Cとした。 注射量は20ul(最初に10倍に希釈)であった。
以下の神経伝達物質の内容物から、ドーパミン(DA)、ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)、高バニリン酸(HVA)、ノルエピネフリン(NE)、5-ヒドロキシトリプタミン(5-HT)、5-ヒドロキシインドール酢酸(5-HIAA)を検出した。TH、α-シヌクレイン、LC3、およびp62の免疫蛍光染色をマウス(1群あたりn = 6)を深い麻酔(5%クロラール水和物)下で安楽死させ、0.9%塩化ナトリウムで灌流し、続いて左心室を通して4%パラホルムアルデヒドを灌流した。脳を素早く除去し、24時間後固定した後、沈むまで4°Cで30%スクロースを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に移した。組織をパラフィンに包埋し、冠状切片(30μm)をそりマイクロトームを用いて黒質パルスコンパクタ(SNc;ブレグマの尾部に−2.8〜−3.8mm)を切断した。切片を脱ろうして水和し、内因性ペルオキシダーゼを0.3%H2O2で30分間クエンチした。熱誘導抗原検索後、スライドを0.5%Triton-X100および5%ウシ血清アルブミンと共にそれぞれ30分間インキュベートした。次いで、切片を抗αシヌクレイン抗体、抗TH抗体、抗LC3抗体、抗p62抗体、および対応する蛍光二次抗体と共に4°Cで一晩インキュベートした。PBS中で3回の5分間洗浄した後、切片をビオチン化二次抗体中で1時間インキュベートし、続いてアビジン−ビオチン複合体を30分間インキュベートした。ペルオキシダーゼ活性を3.3-ジアミノベンジジンで可視化した。
検出ウェスタンブロットによるタンパク質の
SNcタンパク質を抽出し(1群あたりn=6匹のマウス)、12〜15%SDS-PAGEを用いて分離し、PVDF膜に転写した。膜を5%無脂乳で室温で1.5時間ブロッキングし、TH、αシヌクレイン、p62、ベクリン1、LC3、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、およびGAPDHに対する抗体と共に4°Cで一晩インキュベートした。翌日、メンブレンを0.1%Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水ですすぎ、対応する二次抗体と1.5時間ハイブリダイズさせた。タンパク質を増強化学発光を用いて可視化し、免疫反応性バンドを画像解析ソフトウェア(Gel Doc 1000-UV;Bio-Rad, Richmond, CA)は、GADPHに正規化されたα−シヌクレインおよびTHバンドの光学密度を計算する。
抗体の情報:ウサギポリクローナルLC3抗体:1:1000。ウサギポリクローナルP62抗体:1:1000。ベクリン1ポリクローナル抗体:1:1000。マウス抗THモノクローナル抗体:1:1000。ウサギポリクローナルα-シヌクレイン抗体:1:1000。
透過型電子顕微鏡による黒質の超構造観察
マウス(1群当たりn=6匹)を5%クロラール水和物で安楽死させ、氷冷PBSで左心室を通して灌流し、続いてPBS中で4%パラホルムアルデヒドおよび1%グルタルアルデヒドを灌流した。脳を摘出し、2.5%グルタルアルデヒド中で4°Cで6時間後固定した。SNcを約1mm3のブロックに切断し、2.5%グルタルアルデヒドを含むPBSに固定し、さらなる処理のために4°Cで保存した。断片を同じ緩衝液中の1%四酸化オスミウムに後固定し、段階的なアルコールを通して脱水し、そしてEpon 812(シェルケミカル社、ヒューストン、テキサス州)に包埋した。超薄切片(50nm)切片をウルトラミクロトームを用いて切断し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて染色し、透過型電子マイクロスコープ(ライカTCS SP2CLSM、復旦大学医学部電子顕微鏡センター)で分析した。
統計分析
本研究における全ての測定データは、標準誤差±平均の形で表され、統計解析は、GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ)ソフトウェアによって処理された。P<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey’s="" multiple="" group="">
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